פלטפורמת microfluidic לעיבוד מדגם Precision הקטן-נפח ושימוש בו לגודל חלקיקים הביולוגיים נפרדים עם Microdevice אקוסטי
November 23rd, 2015
פרוטוקול זה מתאר ארכיטקטורת מערכת לביצוע הפרדות חלקיקים אוטומטיות בנפח קטן (0.15-1.5 מ"ל) באמצעות מכשיר מיקרופלואידי, ודן בשיטות לייעול הביצועים והתפעול של מכשיר אקוסטופלואידי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע הפרדות חלקיקים אוטומטיות בנפח קטן באמצעות מכשיר פוטי מיקרופלואידי. שיטה זו יכולה לאפשר הליכי מפתח בתחום ההנדסה הביו-רפואית, כולל עיבוד והפרדה חזקים של דגימות לזיהוי ביולוגי ויישומי מחקר קליני. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם מודולריות, דיוק, חוסן ואוטומציה, מה שהופך אותה לניתנת להתאמה וגמישה לא רק להפרדה רשתית, אלא למגוון רחב של זרימה דרך התקני הפרדה מיקרופלואידיים.
זיהינו לראשונה את הצורך ביכולת זו להריץ באופן שגרתי ומהימן הפרדות על נפחי דגימות ביולוגיות תת-מילימטריות ללא דילול משמעותי או אובדן אנליט. השילוב של מדידת דגימה וניתוב אוטומטי ממקור לקבצי איסוף יחד עם פעולות משאבת מזרקים סטנדרטיות הוא קריטי לעבודה מוצלחת בקנה מידה זה. כדי להתחיל לתכנן את המכשיר הרתי האקוסטי ואת הפריסה של שתי מסכות הצילום כמתואר בסעיף הראשון של פרוטוקול הטקסט הנלווה.
לאחר מכן דפוס יציאות הנוזל האחוריות על רקיק סיליקון מלוטש 1 0 0 צד כפול. באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית של התנגדות חיובית חרוט גיאומטריה זו באמצעות תחריט יונים תגובתי עמוק לעומק של 350 עד 400 מיקרומטר. לאחר מכן, הפוך את הוופל ועצב את גיאומטריית תעלת הנוזל בצד הקדמי.
שוב, באמצעות פוטוליתוגרפיה חיובית סטנדרטית, ואז הרכיב את הוופל המעוצב לפרוסה נושאת סיליקון ריקה שנייה. שימוש בהתנגדות לצילום חורט כעת את התעלות החשופות לעומק של 200 מיקרומטר. באמצעות תחריט יונים עם תגובה עמוקה, ואז השרו את פרוסת המכשיר בתמיסת הפשטה התנגדות כדי לנתק אותה מפרוסת הסיליקון הריקה.
לאחר מכן, נקו את פרוסת המכשיר ופרוסת זכוכית בורו סיליקט בעובי 0.5 מילימטר ללא תכונות באמצעות תמיסת פיראנה. לאחר הניקוי, אטום את תעלות הנוזל המחברות באופן יוני את פרוסת הזכוכית והסיליקון באמצעות התנאים המוצגים כאן. לבסוף, חתוך את השבבים הבודדים בעזרת להב יהלום על מסור חיתוך מערכת אפוקסי דו-רכיבית עם צמיגות נמוכה
.שקלו את היחס המומלץ בין שני הרכיבים וערבבו אותם היטב. לאחר מכן הניחו את העופרת זירקין שמונה טיטנאט או קרמיקה פייזו PCT בג'יג מתאים והשתמשו בפיפטה כדי לפזר כ-10 מיקרוליטר מתערובת האפוקסי באופן שווה על פניה ליצירת שכבה דקה ואחידה. לאחר מכן, הנח את השבב לתוך הג'יג ויישר את צד האפוקסי של קרמיקה הפיזו עם השבב המיקרופלואידי.
ייתכן שיהיה צורך להדביק את השבב עם סרט כדי להחזיק אותו במקומו בזמן היישור. מהדקים את המכלול בסגן, תוך הקפדה לא לפצח אף אחד מהרכיבים ולרפא את הטמפרטורה ומשך הזמן המומלצים על ידי יצרן האפוקסי. לאחר שהאפוקסי נרפא, השתמש במלחם קצה עדין כדי לחבר מוליכי חוט דק לכל צד של קרמיקה הפיזו.
במידת הצורך, השתמש בשטף המתאים להכנת משטח הפיזו. הקפד ליצור את המגע הקצר ביותר האפשרי עם הפיזו כדי למנוע דה-פולריזציה תרמית שלו. חבר את השבב ללוח לחם נוזלי באמצעות אביזרי הידוק.
כמו כן, חבר מאוורר קירור ללוח הלחם כדי לווסת את הטמפרטורה במהלך ניסויים אקוסטיים. לאחר מכן, הברג את השבב למחברי העולם. הרכיבו את לוח אב-טיפוס על במת המיקרוסקופ והצטרפו לעולם כדי לשבב מחברים לצינורות נוספים בכניסות וביציאות.
שימוש באיגודי הברגה סטנדרטיים של רבע 28. עבור צינור אחד בגודל 16 אינץ', חבר את השבב המיקרופלואידי למשאבת המזרק, שסתומי בחירה מרובי יציאות הנשלטים על ידי מחשב, מדי זרימה וצינורות ממשקי מחשב כפי שמוצג כאן ומתואר באיור 4 של פרוטוקול הטקסט הנלווה. לפני הפעלת ההפרדה, מלא את מאגרי ריאגנט הניקוי והקם את קווי הנוזל המתאימים להם.
הגדר גם את השסתומים שלוש וארבע בשקעי השבבים כדי לזרום תחילה למאגרי הפסולת. לאחר מכן, הפעל את מאוורר הקירור. חבר את מובילי הפיזו קרמיקה למגבר הכוח והגדר את מחולל הפונקציות בתדר התהודה עבור השבב האקוסטי שבו נעשה שימוש.
כוונן את כרךtagנקודת הגדרת המתח במחולל הפונקציות כך שמגבר ה-RF יציא בין 12 ל-25 וולט שיא לשיא בהתאם להפרדה הרצויה. לאחר מכן חבר את בקבוקוני האיסוף המתאימים ואת בקבוקון כניסת המאגר למערכת. השתמש במאגר הדגימה המתאים לתאים או לחלקיקים שיש להפריד או כנדרש על ידי מבחן הניתוח שישמש לאחר ההפרדה.
לאחר מכן, טען את תוכנת הבקרה והשתמש בה כדי לשלוט בשסתומים, חיישני הזרימה והמשאבה כדי לבצע את שגרת ההפרדה וההפרדה האוטומטית לחלוטין. מיד לפני תחילת הליך ההפרדה, מערבול את בקבוקון הדגימה לזמן קצר כדי להשעות מחדש את כל החלקיקים שאולי שקעו. לחלופין, פיפטה את הדגימה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב דגימות ביולוגיות הרגישות יותר לנזק או להתגבשות על ידי מערבולת.
לאחר מכן חבר את בקבוקון הדגימה לקו הקלט והתחל את שגרת הראשוני וההפרדה ללא דיחוי. התחל בשימוש בתוכנה כדי להניע את כניסת האוויר של שסתומים אחד ושניים כדי להבטיח שהצינור אינו מכיל נוזלים. ראשית בו זמנית את הצינור המחבר את בקבוקון כניסת המאגר לשסתום השני ואת בקבוקון כניסת המדגם לשסתום הראשון.
בקש ממשאבת המזרק למשוך כ-15 מיקרוליטר משני הבקבוקונים כדי למלא לחלוטין את הצינור, ולחבר אותם לשסתומים. לבסוף, החלף את שסתומי 1 ו-2 לפסולת כדי להוציא עודפי נוזלים או אוויר שנכנסו לסליל הטעינה. לאחר מכן, הגדר את התוכנית לטעינת סליל הדגימה על ידי משיכה תחילה של 25 מיקרוליטר אוויר ב-50 מיקרוליטר לדקה.
לאחר מכן העמיסו 250 מיקרוליטר דגימה ב-200 מיקרוליטר לדקה, ואחריהם 35 מיקרוליטר של חיץ מוביל ב-200 מיקרוליטר לדקה, ולבסוף, עוד 25 מיקרוליטר אוויר ב-50 מיקרוליטר לדקה. לאחר מכן הגדר את משאבות המזרק להחדיר את פקקי הנוזל הטעונים במהירות של 100 מיקרוליטר לדקה ולפקח על קצב הזרימה בשקעי החלקיקים הקטנים והגדולים באמצעות חיישני זרימה. ניתן לקבוע את יחס הזרימה המתאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.
כאשר חיישני הזרימה מזהים עלייה בקצב הזרימה המציינת מעבר של פער האוויר הראשון, העבר את שסתום הפלט המתאים מבקבוקון הפסולת לבקבוקון איסוף דגימות. ודא שהזרימה יציבה כאשר הדגימה עוברת את השבב ומופרדת על ידי התבוננות בקריאות חיישן הזרימה. כאשר הדגימה עוברת דרך השבב, השברים המופרדים נאספים בשסתומי היציאה.
בקצה תקע הדגימה, התבונן בחיישן הזרימה, גלה את פער האוויר השני. בשלב זה, החזר את שסתומי הפלט לפסולת. לאחר חלוקת הנפח המלא, הפסק את עירוי משאבת המזרק וסיים את שגרת האוטומציה.
לאחר השלמת ניסוי ההפרדה, נתק את בקבוקוני איסוף דגימות החלקיקים הקטנים והגדולים ואחסן אותם כראוי לניתוח הבא. אבטח את צינור איסוף הדגימה בבקבוקונים ריקים כדי לאסוף תמיסות ניקוי עודפות שיישטפו דרך הצינורות. לאחר מכן התחל את שגרת ניקוי המערכת האוטומטית כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.
במהלך תהליך זה, התוכנית תשלוט בשסתומים ובמשאבת המזרק כדי להעמיס ברצף את סליל האחיזה עם ריאגנטים לניקוי ולשטוף אותם דרך המערכת. לאחר השלמת תהליך הניקוי והטיהור האוטומטי, השליכו את תמיסות השטיפה העודפות ואת הבקבוקונים שבהם נאספו על ידי ביצוע נהלים מתאימים לטיפול בפסולת ביולוגית או כימית. מוצגת כאן סריקת תדרים מייצגת ממכשיר פיזו ומיקרופלואידיקה מצומדים היטב.
כאשר הצימוד בין הפיזו למכשיר המיקרופלואידי טוב, חלקיקים מתמקדים בחוזקה בתדר התהודה, וכתוצאה מכך שיא ברור בעוצמת הפלואורסצנט ונדידה למיקום המיקוד הצפוי. לעומת זאת, כאשר יש צימוד גרוע חלקיקי לא יתמקדו היטב וההתקן אינו מתאים כאשר מיקוד באיכות גבוהה או זרימה מהירה הם קריטיים ליישום הנדרש. כל קו בגרף זה מייצג תוצאות הפרדה באמצעות גדלים שונים של חלקיקי פוליסטירן ומתחי הנעת פיזו.
באופן כללי, נדרשים מתחים גבוהים יותר כדי לחלץ חלקיקים קטנים יותר. עם זאת, לא ניתן להגדיל את המתח היבש ללא הגבלת זמן, עקב פיזור חום גדול יותר והשפעות הולכות וגוברות של סטרימינג אקוסטי. כדי להדגים את התועלת של פלטפורמה זו להפרדת חלקיקים ביולוגית, תאי ראג'י אנושיים בקוטר ממוצע של שמונה עד 10 מיקרומטר הוכנסו לנגיף דנגי בקוטר משוער של 50 ננומטר ולאחר מכן הופרדו באמצעות המכשיר המיקרופלואידי.
ברגע שמערכת כזו מורכבת ומתוכנתת, ניתן לבצע הפרדות באופן שגרתי תוך כחמש דקות. ניתן לעבד כשלוש דגימות בשעה עם ניקוי מלא וטיהור בין הדגימות. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות נוספות כגון ספירת תאים, כתמים מערביים או ריצוף מהדור הבא על מנת לאשר את טוהר ההפרדה ולהבהיר את המשמעות הביולוגית.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר מכשיר הפרדה מיקרופלואידי טיפוסי. השתמש בעולם כדי לשבב חיבורים כדי להתממשק עם חומרה ולהפעיל הליך הפרדה אוטומטי בצורה מדויקת וחזקה. אל תשכח שעבודה עם חומרים זיהומיים עלולה להיות מסוכנת ביותר וחייבת להתבצע רק על ידי צוות מיומן כראוי המשתמש בציוד ובנהלים המתאימים שנקבעו על ידי המוסד לבטיחות ביולוגית.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר ארכיטקטורת מערכת להפרדת חלקיקים אוטומטית בנפח קטן באמצעות מכשיר מיקרופלואידי. הוא מדגיש שיטות לשיפור הביצועים והפעולה של מכשירים אקוסטופלואידים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- הנדסה ביו-רפואית
- מיקרופלואידיקה
- טכניקות הפרדת חלקיקים
רקע
- הצורך בהפרדה אמינה של דגימות ביולוגיות תת-מילימטריות.
- חשיבות של מיזעור דילול ואובדן אנליטים.
- שילוב של מדידת דגימות וניתוב אוטומטי.
- שימוש בפעולות משאבת מזרק סטנדרטיות ליעילות.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה להפרדת חלקיקים אוטומטית.
- לשפר את האמינות והדיוק של מכשירים מיקרופלואידים.
- להקל על יישומי מחקר קליני באמצעות עיבוד דגימות משופר.
שיטות ששימשו
- תכנון וייצור של מכשיר רשת אקוסטית.
- פוטוליתוגרפיה לדפוס גיאומטריה של ערוצים.
- שילוב של קרמיקת פיאזו למניפולציה אקוסטית.
- שליטה אוטומטית במערכות נוזלים להפרדת דגימות.
תוצאות עיקריות
- יישום מוצלח של הפרדת חלקיקים אוטומטית.
- מודולריות ודיוק מוכחים בפעולת המכשיר.
- טיפול יעיל בנפחי דגימות קטנים ללא אובדן.
- אימות השיטה ליישומים מיקרופלואידים שונים.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח משפר את היעילות של הפרדת חלקיקים.
- ניתן לייעל מכשירים אקוסטופלואידים ליישומים שונים.
- שיטה זו תומכת בהתקדמות במחקר ביו-רפואי.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This microfluidic platform enables precise, automated processing of small-volume biological samples (0.15–1.5 mL), reducing reagent waste and preserving precious analytes in early discovery workflows. By integrating modular device design with closed-loop fluid handling, it supports robust, reproducible particle separation—critical for target validation and assay development where sample integrity directly impacts data quality. The system’s adaptability to various microfluidic devices, including acoustofluidic chips, allows seamless integration into discovery pipelines requiring high-confidence, low-input separations for mechanistic de-risking and lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating specific biological particles (e.g., cells, viruses) from complex mixtures without significant dilution or loss.
- Operational Value: Supports functional target validation through precise size-based separation, clarifying pathway involvement and reducing mechanistic ambiguity in early-stage targets.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by generating reliable separation data that informs go/no-go decisions based on particle purity and yield.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological subsystems for downstream assays by concentrating target particles and removing interferents, improving signal-to-noise in detection assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via automated, closed-loop sample processing, priming, and cleaning cycles that minimize variability between runs.
- Scalability: Facilitates screening readiness through modular chip exchange and consistent world-to-chip connections, enabling platform reuse across multiple separation targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains sample integrity from discovery through preclinical validation by enabling concentration of rare biological particles (e.g., circulating cells, viral particles) for biomarker analysis.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports data-driven decisions by providing quantitative, reproducible separation outputs that correlate with biological relevance and reduce false positives in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: When applied to disease-relevant systems, helps isolate pathogenic particles to clarify mechanism of action and de-risk translational candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The platform integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical studies, particularly where low-volume, high-purity particle separation is required for downstream analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise isolation of biological particles (e.g., Raji cells, dengue virus) from heterogeneous samples.
- Screening: Delivers assay-ready samples through automated, reproducible fluid handling that ensures consistent particle separation and collection.
- Analytics: Generates quantitative outputs (e.g., flow rate spikes, particle fractionation) monitored via integrated flow sensors, enabling objective comparison of separation conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by concentrating low-abundance biological particles (e.g., viral particles spiked into cells) for subsequent validation via cell counting, Western blotting, or sequencing.
- Enterprise Reuse: Designed as a reusable capability—modular architecture allows rapid device exchange and standardized operation across teams and projects without re-optimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through precise, size-based particle separation.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability via automated priming, separation, and cleaning routines that ensure consistent performance across runs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling reliable, low-input separations that de-risk biological targets early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by generating high-fidelity separation data that informs advancement decisions based on particle purity and yield.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, photolithography, and acoustic transducer integration.
- Depends on instrumentation including syringe pumps, multiport valves, flow sensors, function generators, power amplifiers, and temperature control (cooling fan).
- Necessitates cross-team standardization of world-to-chip connections, fluidic tubing, and valve programming for reproducible operation.
- Involves adaptation considerations when applying to different biological systems (e.g., cell types, particle sizes) due to varying acoustic properties and optimal driving voltages.
- Practical limitations include thermal management during prolonged acoustic operation and the need for careful handling of piezo ceramics to avoid depolarization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:04
Cleanroom Fabrication of Microfluidic Chips for Acoustophoresis
2:32
Piezo Transducer Attachement
3:51
Separation Procedure
8:26
Automated Cleaning and Decontamination
9:08
Results: Size Separation of Biological Particles Using an Acoustic Microdevice
10:24
Conclusion
