פלטפורמת microfluidic לעיבוד מדגם Precision הקטן-נפח ושימוש בו לגודל חלקיקים הביולוגיים נפרדים עם Microdevice אקוסטי

פרוטוקול זה מתאר ארכיטקטורת מערכת לביצוע הפרדות חלקיקים אוטומטיות בנפח קטן (0.15-1.5 מ"ל) באמצעות מכשיר מיקרופלואידי, ודן בשיטות לייעול הביצועים והתפעול של מכשיר אקוסטופלואידי.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע הפרדות חלקיקים אוטומטיות בנפח קטן באמצעות מכשיר פוטי מיקרופלואידי. שיטה זו יכולה לאפשר הליכי מפתח בתחום ההנדסה הביו-רפואית, כולל עיבוד והפרדה חזקים של דגימות לזיהוי ביולוגי ויישומי מחקר קליני. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם מודולריות, דיוק, חוסן ואוטומציה, מה שהופך אותה לניתנת להתאמה וגמישה לא רק להפרדה רשתית, אלא למגוון רחב של זרימה דרך התקני הפרדה מיקרופלואידיים.

זיהינו לראשונה את הצורך ביכולת זו להריץ באופן שגרתי ומהימן הפרדות על נפחי דגימות ביולוגיות תת-מילימטריות ללא דילול משמעותי או אובדן אנליט. השילוב של מדידת דגימה וניתוב אוטומטי ממקור לקבצי איסוף יחד עם פעולות משאבת מזרקים סטנדרטיות הוא קריטי לעבודה מוצלחת בקנה מידה זה. כדי להתחיל לתכנן את המכשיר הרתי האקוסטי ואת הפריסה של שתי מסכות הצילום כמתואר בסעיף הראשון של פרוטוקול הטקסט הנלווה.

לאחר מכן דפוס יציאות הנוזל האחוריות על רקיק סיליקון מלוטש 1 0 0 צד כפול. באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית של התנגדות חיובית חרוט גיאומטריה זו באמצעות תחריט יונים תגובתי עמוק לעומק של 350 עד 400 מיקרומטר. לאחר מכן, הפוך את הוופל ועצב את גיאומטריית תעלת הנוזל בצד הקדמי.

שוב, באמצעות פוטוליתוגרפיה חיובית סטנדרטית, ואז הרכיב את הוופל המעוצב לפרוסה נושאת סיליקון ריקה שנייה. שימוש בהתנגדות לצילום חורט כעת את התעלות החשופות לעומק של 200 מיקרומטר. באמצעות תחריט יונים עם תגובה עמוקה, ואז השרו את פרוסת המכשיר בתמיסת הפשטה התנגדות כדי לנתק אותה מפרוסת הסיליקון הריקה.

לאחר מכן, נקו את פרוסת המכשיר ופרוסת זכוכית בורו סיליקט בעובי 0.5 מילימטר ללא תכונות באמצעות תמיסת פיראנה. לאחר הניקוי, אטום את תעלות הנוזל המחברות באופן יוני את פרוסת הזכוכית והסיליקון באמצעות התנאים המוצגים כאן. לבסוף, חתוך את השבבים הבודדים בעזרת להב יהלום על מסור חיתוך מערכת אפוקסי דו-רכיבית עם צמיגות נמוכה

שקלו את היחס המומלץ בין שני הרכיבים וערבבו אותם היטב. לאחר מכן הניחו את העופרת זירקין שמונה טיטנאט או קרמיקה פייזו PCT בג'יג מתאים והשתמשו בפיפטה כדי לפזר כ-10 מיקרוליטר מתערובת האפוקסי באופן שווה על פניה ליצירת שכבה דקה ואחידה. לאחר מכן, הנח את השבב לתוך הג'יג ויישר את צד האפוקסי של קרמיקה הפיזו עם השבב המיקרופלואידי.

ייתכן שיהיה צורך להדביק את השבב עם סרט כדי להחזיק אותו במקומו בזמן היישור. מהדקים את המכלול בסגן, תוך הקפדה לא לפצח אף אחד מהרכיבים ולרפא את הטמפרטורה ומשך הזמן המומלצים על ידי יצרן האפוקסי. לאחר שהאפוקסי נרפא, השתמש במלחם קצה עדין כדי לחבר מוליכי חוט דק לכל צד של קרמיקה הפיזו.

במידת הצורך, השתמש בשטף המתאים להכנת משטח הפיזו. הקפד ליצור את המגע הקצר ביותר האפשרי עם הפיזו כדי למנוע דה-פולריזציה תרמית שלו. חבר את השבב ללוח לחם נוזלי באמצעות אביזרי הידוק.

כמו כן, חבר מאוורר קירור ללוח הלחם כדי לווסת את הטמפרטורה במהלך ניסויים אקוסטיים. לאחר מכן, הברג את השבב למחברי העולם. הרכיבו את לוח אב-טיפוס על במת המיקרוסקופ והצטרפו לעולם כדי לשבב מחברים לצינורות נוספים בכניסות וביציאות.

שימוש באיגודי הברגה סטנדרטיים של רבע 28. עבור צינור אחד בגודל 16 אינץ', חבר את השבב המיקרופלואידי למשאבת המזרק, שסתומי בחירה מרובי יציאות הנשלטים על ידי מחשב, מדי זרימה וצינורות ממשקי מחשב כפי שמוצג כאן ומתואר באיור 4 של פרוטוקול הטקסט הנלווה. לפני הפעלת ההפרדה, מלא את מאגרי ריאגנט הניקוי והקם את קווי הנוזל המתאימים להם.

הגדר גם את השסתומים שלוש וארבע בשקעי השבבים כדי לזרום תחילה למאגרי הפסולת. לאחר מכן, הפעל את מאוורר הקירור. חבר את מובילי הפיזו קרמיקה למגבר הכוח והגדר את מחולל הפונקציות בתדר התהודה עבור השבב האקוסטי שבו נעשה שימוש.

כוונן את כרךtagנקודת הגדרת המתח במחולל הפונקציות כך שמגבר ה-RF יציא בין 12 ל-25 וולט שיא לשיא בהתאם להפרדה הרצויה. לאחר מכן חבר את בקבוקוני האיסוף המתאימים ואת בקבוקון כניסת המאגר למערכת. השתמש במאגר הדגימה המתאים לתאים או לחלקיקים שיש להפריד או כנדרש על ידי מבחן הניתוח שישמש לאחר ההפרדה.

לאחר מכן, טען את תוכנת הבקרה והשתמש בה כדי לשלוט בשסתומים, חיישני הזרימה והמשאבה כדי לבצע את שגרת ההפרדה וההפרדה האוטומטית לחלוטין. מיד לפני תחילת הליך ההפרדה, מערבול את בקבוקון הדגימה לזמן קצר כדי להשעות מחדש את כל החלקיקים שאולי שקעו. לחלופין, פיפטה את הדגימה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב דגימות ביולוגיות הרגישות יותר לנזק או להתגבשות על ידי מערבולת.

לאחר מכן חבר את בקבוקון הדגימה לקו הקלט והתחל את שגרת הראשוני וההפרדה ללא דיחוי. התחל בשימוש בתוכנה כדי להניע את כניסת האוויר של שסתומים אחד ושניים כדי להבטיח שהצינור אינו מכיל נוזלים. ראשית בו זמנית את הצינור המחבר את בקבוקון כניסת המאגר לשסתום השני ואת בקבוקון כניסת המדגם לשסתום הראשון.

בקש ממשאבת המזרק למשוך כ-15 מיקרוליטר משני הבקבוקונים כדי למלא לחלוטין את הצינור, ולחבר אותם לשסתומים. לבסוף, החלף את שסתומי 1 ו-2 לפסולת כדי להוציא עודפי נוזלים או אוויר שנכנסו לסליל הטעינה. לאחר מכן, הגדר את התוכנית לטעינת סליל הדגימה על ידי משיכה תחילה של 25 מיקרוליטר אוויר ב-50 מיקרוליטר לדקה.

לאחר מכן העמיסו 250 מיקרוליטר דגימה ב-200 מיקרוליטר לדקה, ואחריהם 35 מיקרוליטר של חיץ מוביל ב-200 מיקרוליטר לדקה, ולבסוף, עוד 25 מיקרוליטר אוויר ב-50 מיקרוליטר לדקה. לאחר מכן הגדר את משאבות המזרק להחדיר את פקקי הנוזל הטעונים במהירות של 100 מיקרוליטר לדקה ולפקח על קצב הזרימה בשקעי החלקיקים הקטנים והגדולים באמצעות חיישני זרימה. ניתן לקבוע את יחס הזרימה המתאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

כאשר חיישני הזרימה מזהים עלייה בקצב הזרימה המציינת מעבר של פער האוויר הראשון, העבר את שסתום הפלט המתאים מבקבוקון הפסולת לבקבוקון איסוף דגימות. ודא שהזרימה יציבה כאשר הדגימה עוברת את השבב ומופרדת על ידי התבוננות בקריאות חיישן הזרימה. כאשר הדגימה עוברת דרך השבב, השברים המופרדים נאספים בשסתומי היציאה.

בקצה תקע הדגימה, התבונן בחיישן הזרימה, גלה את פער האוויר השני. בשלב זה, החזר את שסתומי הפלט לפסולת. לאחר חלוקת הנפח המלא, הפסק את עירוי משאבת המזרק וסיים את שגרת האוטומציה.

לאחר השלמת ניסוי ההפרדה, נתק את בקבוקוני איסוף דגימות החלקיקים הקטנים והגדולים ואחסן אותם כראוי לניתוח הבא. אבטח את צינור איסוף הדגימה בבקבוקונים ריקים כדי לאסוף תמיסות ניקוי עודפות שיישטפו דרך הצינורות. לאחר מכן התחל את שגרת ניקוי המערכת האוטומטית כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

במהלך תהליך זה, התוכנית תשלוט בשסתומים ובמשאבת המזרק כדי להעמיס ברצף את סליל האחיזה עם ריאגנטים לניקוי ולשטוף אותם דרך המערכת. לאחר השלמת תהליך הניקוי והטיהור האוטומטי, השליכו את תמיסות השטיפה העודפות ואת הבקבוקונים שבהם נאספו על ידי ביצוע נהלים מתאימים לטיפול בפסולת ביולוגית או כימית. מוצגת כאן סריקת תדרים מייצגת ממכשיר פיזו ומיקרופלואידיקה מצומדים היטב.

כאשר הצימוד בין הפיזו למכשיר המיקרופלואידי טוב, חלקיקים מתמקדים בחוזקה בתדר התהודה, וכתוצאה מכך שיא ברור בעוצמת הפלואורסצנט ונדידה למיקום המיקוד הצפוי. לעומת זאת, כאשר יש צימוד גרוע חלקיקי לא יתמקדו היטב וההתקן אינו מתאים כאשר מיקוד באיכות גבוהה או זרימה מהירה הם קריטיים ליישום הנדרש. כל קו בגרף זה מייצג תוצאות הפרדה באמצעות גדלים שונים של חלקיקי פוליסטירן ומתחי הנעת פיזו.

באופן כללי, נדרשים מתחים גבוהים יותר כדי לחלץ חלקיקים קטנים יותר. עם זאת, לא ניתן להגדיל את המתח היבש ללא הגבלת זמן, עקב פיזור חום גדול יותר והשפעות הולכות וגוברות של סטרימינג אקוסטי. כדי להדגים את התועלת של פלטפורמה זו להפרדת חלקיקים ביולוגית, תאי ראג'י אנושיים בקוטר ממוצע של שמונה עד 10 מיקרומטר הוכנסו לנגיף דנגי בקוטר משוער של 50 ננומטר ולאחר מכן הופרדו באמצעות המכשיר המיקרופלואידי.

ברגע שמערכת כזו מורכבת ומתוכנתת, ניתן לבצע הפרדות באופן שגרתי תוך כחמש דקות. ניתן לעבד כשלוש דגימות בשעה עם ניקוי מלא וטיהור בין הדגימות. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות נוספות כגון ספירת תאים, כתמים מערביים או ריצוף מהדור הבא על מנת לאשר את טוהר ההפרדה ולהבהיר את המשמעות הביולוגית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר מכשיר הפרדה מיקרופלואידי טיפוסי. השתמש בעולם כדי לשבב חיבורים כדי להתממשק עם חומרה ולהפעיל הליך הפרדה אוטומטי בצורה מדויקת וחזקה. אל תשכח שעבודה עם חומרים זיהומיים עלולה להיות מסוכנת ביותר וחייבת להתבצע רק על ידי צוות מיומן כראוי המשתמש בציוד ובנהלים המתאימים שנקבעו על ידי המוסד לבטיחות ביולוגית.