פלטפורמת microfluidic לעיבוד מדגם Precision הקטן-נפח ושימוש בו לגודל חלקיקים הביולוגיים נפרדים עם Microdevice אקוסטי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע הפרדות אוטומטיות של חלקיקים בנפחים קטנים באמצעות התקן פוטי מיקרופלואידי. שיטה זו יכולה לאפשר הליכי מפתח בתחום ההנדסה ביו-רפואית, כולל עיבוד והפרדה חסונים של דגימות עבור יישומי זיהוי ביולוגי ומחקר קליני. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם מודולריות, דיוק, חסון ואוטומציה, מה שהופך אותה למתאימה וגמישה לא רק עבור הפרדת רשתית, אלא עבור מגוון רחב של התקני הפרדה מיקרופלואידיים בזרימה.

ראשית, זיהינו את הצורך ביכולת זו כדי להריץ באופן שגרתי ואמין הפרדות על נפחים של דגימות ביולוגיות פחות ממילימטר, ללא דילול משמעותי או אובדן של האנליט. השילוב של מדידת דגימה וניתוב אוטומטי מהמקור למסמכי האיסוף, יחד עם פעולות סטנדרטיות של משאבת מזרק, הוא קריטי לעבודה מוצלחת בקנה מידה זה. כדי להתחיל, תכננו את התקן האקוסטי (acoustic retic) ואת הפריסה עבור שתי מסכות הפוטו-ליתוגרפיה כפי שמתואר בסעיף אחד של פרוטוקול הטקסט המצורף.

לאחר מכן, בצעו תבניתיקה של פתחי הנוזלים בצד האחורי על גבי פרוסת סיליקון 1 0 0 מלוטשת משני צדדיה. באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית של רזיסט חיובי, חרטו את הגיאומטריה הזו באמצעות תהליך deep reactive ion etching לעומק של 350 עד 400 micrometers. לאחר מכן, הפכו את הפרוסה ובצעו תבניתיקה של גיאומטריית תעלת הנוזלים בצד הקדמי.

שוב, באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית של רזיסט חיובי (positive resist), רכבו את פרוסת הסיליקון המודפסת על פרוסת נשאה שנייה של סיליקון ריקה. כעת, באמצעות רזיסט פוטו, חצבו את התעלות החשופות לעומק של 200 micrometers. השתמשו בחריטה ריאקטיבית עמוקה (deep reactive etching), ולאחר מכן השרו את פרוסת ההתקן בתמיסה להסרת רזיסט כדי להפריד אותה מפרוסת הסיליקון הריקה.

בשלב הבא, נקה את פרוסת הסיליקון של ההתקן ואת פרוסת זכוכית בורוסיליקט חלקה בעובי 0.5 millimeter באמצעות תמיסת פיראנה. לאחר הניקוי, אטום את תעלות הנוזלים על ידי קישור יוני של פרוסת הזכוכית ופרוסת הסיליקון תחת התנאים המוצגים כאן. לבסוף, חתוך את השבבים הבודדים באמצעות להב יהלום במכונת חיתוך (dicing saw) מתוך ערכת אפוקסי דו-רכיבית בעלת צמיגות נמוכה.

שקלו את היחס המומלץ של שני הרכיבים וערבבו אותם היטב. לאחר מכן, מקמו את קרמיקת ה-piezo מסוג lead Zirconate titanate או PCT במתאם (jig) מתאים, והשתמשו בפיפטה כדי למרוח כ-10 µL של תערובת an-epoxy באופן אחיד על פניה ליצירת שכבה דקה ואחידה. לבסוף, מקמו את השבב במתאם והיוו שורה את צד ה-epoxy של קרמיקת ה-piezo עם השבב המיקרופלואידי.

ייתכן שיהיה צורך לקבע את השבב בעזרת סרט דביק כדי להחזיקו במקומו בזמן הכיוון. הדקו את המכלול במלחציים תוך הקפדה שלא לסדוק אף אחד מהרכיבים, ובצעו את תהליך ההקשיה בטמפרטורה ובמשך הזמן המומלצים על ידי יצרן האפוקסי. לאחר שהאפוקסי התקשה, השתמשו במלחם בעל חוד דק כדי לחבר חוטי הובלה בעלי עובי דק לכל צד של הקרמיקה הפייזו-אלקטרית.

במידת הצורך, השתמשו בפלאקס מתאים להכנת פני השטח של ה-pizo. הקפידו על מגע קצר ככל האפשר עם ה-pizo כדי למנוע דפולריזציה תרמית שלו. הצמידו את השבב ללוח לחצים (fluidic breadboard) באמצעות מתקני קיבוע.

בנוסף, חברו מאוורר קירור ללוח הבדיקה (breadboard) כדי לווסת את הטמפרטורה במהלך ניסויי האקוסטיקה. לאחר מכן, הבריגו את השבב למחברי העולם (world connectors). רכבו את לוח הבדיקה עלבמת המיקרוסקופ וחברו את מחברי העולם לשבב לצינורות נוספים בכניסות ובפתחים.

שימוש במחברים מהוללים סטנדרטיים מסוג quarter 28. עבור צינורית בקוטר 1/16 אינץ', חברו את השבב המיקרופלואידי למשאבת המזרקים, לשסתומי בחירה רב-מעבריים הנשלטים על ידי מחשב, למדי זרימה המחוברים למחשב ולצינוריות כפי שמוצג כאן וכפי שמתואר באיור 4 של פרוטוקול הטקסט המצורף. לפני ביצוע ההפרדה, מלאו את מאגרי ריאגנט הניקוי ובצעו הטרייה (prime) לקווי הנוזלים המתאימים להם.

כמו כן, כוון את שסתומים שלוש וארבע ביציאות השבב כך שבתחילה הזרימה תהיה למכלי הפסולת. לאחר מכן, הפעל את מאוורר הקירור. חבר את מוליכי הקרמיקה הפייזו למגבר ההספק וכוון את מחולל הפונקציות לתדר התהודה עבור השבב האקוסטי שבשימוש.

כוון את נקודת הset point של המתח בגנרטור הפונקציות כך שמעגל הגברה של RF יוציא בין 12 ל-25 volts peak to peak, בהתאם להפרדה הרצויה. לאחר מכן, חבר למערכת את מבחנות האיסוף המתאימות ואת מבחנת הכנסת הבאפר. השתמש בבאפר דגימה המתאים לתאים או לחלקיקים המיועדים להפרדה, או כפי שנדרש עבור בדיקת האנליזה שתבוצע לאחר ההפרדה.

בשלב הבא, טענו את תוכנת הבקרה והשתמשו בה לשליטה בשסתומים, בחששני הזרימה ובמשאבה כדי לבצע את שגרת ההטרייה (prime) וההפרדה האוטומטית המלאה. מיד לפני תחילת הליך ההפרדה, ערבלו ב-vortex את מבחנת הדגימה לזמן קצר כדי להחזיר למצב של סספנסיה חלקיקים שייתכן ששקעו. לחלופין, בצעו פיפטור של הדגימה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב דגימות ביולוגיות הרגישות יותר לנזק או להצטברות (clumping) כתוצאה מערבבל ב-vortex.

לאחר מכן, חברו את מבחנת הדגימה לקו הכניסה והפעילו ללא עיכוב את שגרת ההכנה (prime) וההפרדה. התחילו בשימוש בתוכנה כדי להכין את כניסת האוויר של שסתומים one ו-two, על מנת לוודא שבצינורות אין נוזל. במקביל, הכינו את הצינורות המחברים את מבחנת כניסת הבאפר לשסתום two ואת מבחנת כניסת הדגימה לשסתום one.

הפעל את משאבת המזרק כך שתשאב כ-15 µL משני הבקבוקונים כדי למלא את הצינורות לחלוטין, תוך חיבורם לשסתומים. לבסוף, העבר את שסתומים אחת ושתיים למצב פסולת כדי להוציא נוזל עודף או אוויר שחדרו לסליל הטעינה. לאחר מכן, הגדר את התוכנית לטעינת סליל הדגימה על ידי שאיבה ראשונית של 25 µL אוויר בקצב של 50 µL לדקה.

לאחר מכן טוענים 250 µL של דגימה בקצב של 200 µL לדקה, ואחריהם 35 µL של בופר מוביל בקצב של 200 µL לדקה, ולבסוף 25 µL נוספים של אוויר בקצב של 50 µL לדקה. לאחר מכן, הגדירו את משאבות המזרקים להזרמת פלאגי הנוזלים שנטענו בקצב של 100 µL לדקה, ועקבו אחר קצבי הזרימה ביציאות החלקיקים הקטנים והגדולים באמצעות חיישני זרימה. ניתן לקבוע את יחס הזרימה המתאים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף.

כאשר חיישני הזרימה מזהים עלייה חדה בקצב הזרימה המעידה על מעבר של מרווח האוויר הראשון, העבירו את שסתום הפלט המתאים ממבחנת הפסולת למבחנת איסוף דגימות. ודאו שהזרימה יציבה בזמן שהדגימה עוברת בשבב ומופרדת, וזאת על ידי מעקב אחר קריאות חיישני הזרימה. בעוד הדגימה עוברת דרך השבב, הפראקציות המופרדות נאספות בשסתומי היציאה.

בסוף פלאג הדגימה, עקבו אחר חיישן הזרימה עד לגילוי מרווח האוויר השני. בנקודה זו, העבירו את שסתומי המוצא חזרה למשקעים (waste). לאחר שכל הנפח הועבר, הפסיקו את הזרקת משאבת המזרק וסיימו את שגרת האוטומציה.

לאחר השלמת ניסוי ההפרדה, נתקו את מבחנות איסוף הדגימות של החלקיקים הקטנים והגדולים ואחסנו אותן באופן מתאים לצורך אנליזה עוקבת. הצמידו את צינור שאיבת הדגימות למבחנות ריקות כדי לאסוף את עודפי תמיסונות הניקוי שיישטפו דרך הצינורות. לאחר מכן, הפעילו את שגרת ניקוי המערכת האוטומטית כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף.

במהלך תהליך זה, התוכנית תבקר את השסתומים ואת משאבת המזרק כדי להטעין באופן רצפי את סליל ההמתנה בחומרי ניקוי ולהזרים אותם דרך המערכת. עם סיום תהליך הניקוי והדקונטמינציה האוטומטי, יש להשליך את תמיסות השטיפה העודפות ואת הבקבוקונים שבהם נאספו, בהתאם לנהלים המתאימים לטיפול בפסולת ביולוגית או כימית. מוצגת כאן סריקת תדר מייצגת של רכיב פייזו ומכשיר מיקרופלואידי בעלי צימוד טוב.

כאשר הצימוד בין הפיזו למכשיר המיקרופלואידי הוא טוב, החלקיקים מתמקדים באופן הדוק בתדר התהודה, מה שמוביל לשיא ברור בעוצמת הפלואורסצנציה ולנדידה לעמדת המיקוד הצפויה. לעומת זאת, במקרים של צימוד לקוי, החלקיקים לא יתמקדו היטב, והמכשיר לא יהיה מתאים כאשר מיקוד באיכות גבוהה או זרימה מהירה הם קריטיים ליישום הנדרש. כל קו בגרף זה מייצג תוצאות הפרדה תוך שימוש בגדלים שונים של חלקיקי פוליסטירן ובמתחי הפעלה שונים של הפיזו.

באופן כללי, נדרשים מתחים גבוהים יותר כדי להוציא חלקיקים קטנים יותר. עם זאת, לא ניתן להעלות את המתחים היבשים ללא הגבלה, וזאת בשל פיזור חום רב יותר והשפעות גוברות של זרימה אקוסטית. כדי להדגים את התועלת של פלטפורמה זו להפרדת חלקיקים ביולוגיים, תאי raji אנושיים בעלי קוטר ממוצע של 8 עד 10 µm הועשרו בנגיף הדנגי בעל קוטר מקורב של 50 nm, ולאחר מכן הופרדו באמצעות ההתקן המיקרופלואידי האקוסטית.

ברגע שמערכת כזו מורכבת ומתוכנתת, ניתן לבצע הפרדות באופן שגרתי בתוך כחמש דקות. ניתן לעבד כשלושה דגימות בשעה, כולל ניקוי ודקונטמינציה מלאים בין הדגימות. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ספירת תאים, western blotting או רצף הדור הבא (next generation sequencing) כדי לאשר את טוהר ההפרדה ולה 규ל את המשמעות הביולוגית.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הייצור של התקן הפרדה מיקרופלואידי טיפוסי. השתמשו בחיבורים בין העולם החיצוני לשבב כדי להתממשק עם החומרה ולהריץ הליך הפרדה אוטומטי באופן מדויק ואמין. זכרו כי עבודה עם חומרים זיהומיים עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לבצעה אך ורק על ידי כוח אדם שהוכשר כראוי, תוך שימוש בציוד ובנהלים לבטיחות ביולוגית כפי שהוגדרו על ידי המוסד.