פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים פלטפורמה מיקרופלואידית המשלבת חישת דופק התנגדות עם חלוקת קוד גישה מרובה לריבוי הזיהוי והגודל של חלקיקים במספר תעלות מיקרופלואידיות. טכנולוגיה זו, הנקראת microfluidic CODES יכולה לסייע במימוש התקני שבב מעבדה משולבים וניידים באמת המתאימים היטב לבדיקת נקודת הטיפול של דגימות ביולוגיות בסביבות מוגבלות במשאבים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לעקוב אלקטרונית אחר מניפולציה מרחבית וזמנית של חלקיקים על השבב המיקרופלואידי, ומבטלת את הצורך במכשיר חיצוני כגון מיקרוסקופ.

הטכנולוגיה שלנו תואמת לליתוגרפיה רכה וניתן לשלב אותה בקלות במכשיר מיקרופוטי שבו חלקיקים מפוצלים כדי לספק קריאה אלקטרונית ישירה בדומה למונה קולטר. כדי להתחיל בבניית המכשיר המיקרופלואידי, צור קבוצה של ארבעה, שבעה קודי זהב סיביות. לאחר מכן תכנן ארבע פריסות אלקטרודות ייחודיות המבוססות על קודי הזהב באמצעות עיצוב בעזרת מחשב, או תוכנת CAD כגון AutoCAD.

לבסוף, יש את ה-Photommask עם פריסת האלקטרודות המעוצבת המיוצרת על ידי ספק Photomask. לאחר מכן, השרו פרוסת זכוכית בורוסיליקט בגודל 4 אינץ' בתמיסת פיראנה של חמישה עד אחד בטמפרטורה של 120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר הניקוי, מחממים את הוופל על פלטה חמה בחום של 200 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לאידוי שאריות מים.

מניחים את הוופל הנקי והיבש בציפוי מסתובב. מרחו 2 מיליליטר של תמיסת פוטו-רזיסט שלילית על הפרוסה וסובבו את המעיל במהירות של 3000 סיבובים לדקה למשך 40 שניות. יבש את הוופל המצופה ספין על פלטה חמה בחום של 150 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.

מכסים את הוופל במסכת כרום בתבנית האלקטרודה הרצויה. חשוף את משטח הפוטו-רזיסט המוסווה לאור UV של 365 ננומטר כדי להגיע ל-225 מילי-ג'אול לסנטימטר מרובע. אופים את הפוטו-רזיסט החשוף על פלטה חמה בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך דקה.

טבלו את הוופל במפתח פוטו-רזיסט למשך 15 שניות, ולאחר מכן שטפו את פרוסת התבנית בתרסיס עדין של מים נטולי יונים וייבשו את הוופל תחת זרם של גז חנקן. לאחר מכן, הנח את הוופל המעוצב במאייד מתכת קרן אלקטרונים. הניחו שכבת כרום בעובי 20 ננומטר ושכבת זהב בעובי 80 ננומטר על הפרוסה בקצב של אנגסטרום אחד לשנייה.

לאחר מכן חרטו את הפוטו-רזיסט הבסיסי על ידי חימום קולי של פרוסת המתכת המצופה באצטון למשך 30 דקות ב-40 קילו-הרץ ו-100% משרעת. השתמש במסור קוביות כדי לחתוך את הוופל לחתיכות קטנות יותר לפי הצורך. כדי להתחיל לייצר את תבנית התעלה המיקרופלואידית, נקה וייבש פרוסת סיליקון בגודל 4 אינץ' באותו אופן כמו פרוסת הבורוסיליקט שתוארה קודם לכן.

הניחו את פרוסת הסיליקון בציפוי מסתובב ומרחו ארבעה מיליליטר של תמיסת פוטו-רזיסט שלילית. סובב את הוופל ב-500 סל"ד למשך 15 שניות, לאחר מכן ב-1,000 סל"ד למשך 15 שניות, ולבסוף ב-3,000 סל"ד למשך 60 שניות. הנח את הוופל עם הפנים כלפי מעלה על מגבון חדר נקי ספוג אצטון כדי להסיר שאריות פוטו-רזיסט מהגב ומשולי הוופל.

אופים את הוופל בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך דקה ולאחר מכן בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. הניחו תבנית מסכת כרום לתעלות המיקרופלואידיות על הוופל היבש. חשוף את הפוטו-רזיסט לאור UV של 365 ננומטר ב-180 מילי-ג'אול לסנטימטר רבוע ולאחר מכן אפה את הוופל שוב ב-65 ו-95 מעלות צלזיוס למשך דקה ושתי דקות בהתאמה.

הניחו את הוופל המעוצב במיכל של מפתח פוטו-רזיסט ונערו בעדינות את המיכל למשך שלוש דקות. שוטפים את הוופל המפותח באיזופרופנול ומייבשים את הוופל תחת זרם של גז חנקן. אופים את הוופל בחום של 200 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז השתמשו בפרופילומטר כדי לבדוק שהתבנית פוטורסיסט עבה באופן אחיד על פני הוופל.

מניחים את הוופל במייבש ואקום יחד עם 200 מיקרוליטר טריכלורוסילן בצלחת פטרי חשופה. הניחו לוופל לשבת בחומר המייבש עם הטריכלורוסילן למשך שמונה שעות כדי לסנן את פני השטח של הוופל. כדי להתחיל בהרכבת המכשיר, השתמש בסרט חדר נקי לשימוש כללי כדי להדביק את תבנית פרוסות הסיליקון בצלחת פטרי בקוטר 150 מילימטר.

מוסיפים לצלחת פטרי 50 גרם של תערובת של 10 לאחד של פרה-פולימר פולידימתילסילוקסן ומסירים את התערובת במייבש ואקום למשך שעה. מרפאים את התערובת נטולת הגז בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות. השתמש באזמל כדי לחתוך את שכבת ה- PDMS המתרפאת ולאחר מכן לקלף את השכבה המתרפאת מהתבנית בעזרת פינצטה.

חותכים את ה-PDMS לחתיכות קטנות. אגרוף את חורי התעלה המיקרופלואידית של הכניסה והיציאה בעזרת מנקב ביופסיה. הנח את דפוס שכבת ה-PDMS עם הפנים כלפי מטה על סרט חדר שקוף כדי לנקות את המשטח המיקרו-מכונה.

שוטפים את מצע הזכוכית הנושא אלקטרודה שהוכן בעבר באצטון, איזופרופנול ומים נטולי יונים. יבש את המצע מתחת לזרם גז חנקן. הנח את שכבת ה-PDMS ואת המצע בגנרטור פלזמה RF המוגדר ל-100 מילי-וואט כשדפנות המיקרו-מכונה פונות כלפי מעלה.

הפעל את משטחי המיקרו-מכונה בפלזמת חמצן למשך 30 שניות. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ אופטי כדי ליישר את שכבת ה-PDMS של התבנית עם אלקטרודות פני השטח. לאחר היישור, אפשר למשטחים לבוא במגע פיזי כדי לאטום את שכבת ה-PDMS על מצע הזכוכית.

חיוני שדפוס אלקטרודות הציפוי על מצע הזכוכית יהיה מיושר כראוי עם התעלות המיקרופלואידיות של PDMS. לאחר יישור נכון, אינטראקציית החלקיקים עם אלקטרודת פני השטח תיצור צורת גל קוד רצויה לריבוב. אופים את המכשיר המורכב בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, כשצד הזכוכית כלפי מטה.

לבסוף הלחמו חוטים לרפידות המגע של האלקטרודה כדי לסיים את הרכבת ההתקן. כדי להתחיל בניסוי, הנח את המכשיר המיקרופלואידי על במת מיקרוסקופ אופטי. חבר את אלקטרודת הייחוס של המכשיר ליציאת פלט האות של נעילה ampחיים יותר והפעל גל סינוס של 400 קילו-הרץ.

חבר את אלקטרודות החיישן החיובי והשלילי לשני מגברי טרנס-אימפדנס עצמאיים. חבר את שני מגברי הטרנס-אימפדנס לכניסות המתח הדיפרנציאלי של מגבר הנעילה עם אות החיישן החיובי שיש להפחית מאות החיישן השלילי. חבר את יציאת הדמודולטור של הנעילה ampחיים יותר ליחידת רכישת נתונים.

בתוכנת רכישת הנתונים, הגדר קצב דגימה עבור יציאת מגבר הנעילה של 1 מגה-הרץ. הגדר מצלמה במהירות גבוהה כדי להקליט אופטית את פעולת המכשיר כפי שהיא נראית במיקרוסקופ. צייר מתלה תאים מוכן למזרק.

אבטח את מזרק הדגימה במשאבת מזרק וחבר את המזרק לתעלת הכניסה. כוון את תעלת היציאה למיכל פסולת. השתמש במשאבת המזרק כדי להניע את מתלה התא דרך המכשיר בקצב זרימה קבוע תוך רישום אות אפנון העכבה.

לאחר סיום הניסוי, עבד את הנתונים החשמליים באמצעות תוכנת ניתוח. השווה את האות החשמלי המעובד לתמונות מהמצלמה המהירה כדי ליצור עקומת כיול לגודל התא. תרחיף תאים הוזרם דרך מכשיר חיישן מיקרופלואידי עם ארבע דפוסי אלקטרודות ייחודיים שמקורם בקודי חיישנים אורתוגונליים.

כל ארבעת אותות החיישן נרשמו מפלט חשמלי יחיד. החיישן הבודד המשויך לכל אות מוקלט זוהה על ידי מתאם של אותות החיישן המוקלטים עם כל הקודים האפשריים, מה שיצר שיאי מתאם אוטומטי מובחנים בבירור. צורות גל שנוצרו על ידי האותות המפריעים מזיהוי בו זמנית של תאים בכל ארבעת הערוצים נפתרו באמצעות אלגוריתם איטרטיבי.

צורת גל מוקלטת הייתה בקורלציה עם כל הקודים האפשריים וזוהה שיא המתאם האוטומטי הגדול ביותר. אות החיישן הבודד המתאים שוחזר והופחת מצורת גל הכניסה. האות השיורי הועבר לאיטרציה הבאה כקלט והתהליך נמשך עד שהאות השיורי לא ייצר שיאי מתאם אוטומטי.

האותות המשוערים שוכללו על סמך אלגוריתם אופטימיזציה המחפש את ההתאמה הטובה ביותר בין צורות הגל המשוחזרות לצורות הגל המוקלטות המקוריות באמצעות קירוב הריבועים הפחותים. מיקום התא, הגודל והזמן לחצות את החיישן נקבעו לאחר מכן ממספר הערוץ, המשרעת, משך הזמן והתזמון היחסי של אותות החיישן המשוערים. ההליך אומת על ידי השוואה של האותות החשמליים עם מדידות אופטיות מהמצלמה המהירה.

לאחר שליטה, טכניקה זו קלה מאוד ליישום, מכיוון שהיא פשוטה מאוד מבחינת חומרה. אין לו רכיב פעיל על השבב. הוא תואם ישירות לליתוגרפיה רכה ועיבוד האותות מסתמך על אלגוריתם חישובי פשוט.

בעקבות פרוטוקול זה ניתן לייצר שבבים מיקרופלואידיים עם חיישנים חשמליים מרובים מבוססי קוד ולפענח אותות חשמליים למדידה ביואנליטית. טכנולוגיית חישה אלקטרונית רב-תכליתית וניתנת להרחבה זו, ניתנת לשילוב בקלות במכשירים מיקרופלואידיים שונים כדי לממש בדיקות כמותיות על ידי מעקב זמני מרחבי אחר חלקיקים בזמן שהם מעובדים על השבב. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לתכנן, לייצר וליישם טכנולוגיית CODES מיקרופלואידית.