פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים פלטפורמה מיקרופלואידית המשלבת חישוש בדחף התנגדותי (resistive pulse sensing) עם גישה לריבוי גישה באמצעות קוד (code division multiple access) כדי לבצע מולטיפלקס של זיהוי ומדידת גודל של חלקיקים במספר ערוצים מיקרופלואידיים. טכנולוגיה זו, הנקראת microfluidic CODES, יכולה לסייע במימוש התקני מעבדה על שבב (labware chip) המשולבים באופן מלא וניידים באמת, המתאימים לבדיקות בנקודת הטיפול (point of care) של דגימות ביולוגיות בסביבות עם משאבים מוגבלים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לעקוב באופן אלקטרוני אחר מניפולציה מרחבית וזמנית של חלקיקים על השבב המיקרופלואידי, ובכך לבטל את הצורך במכשיר חיצוני כגון מיקרוסקופ.

הטכנולוגיה שלנו תואמת לליתוגרפיה רכה וניתן לשלבה בקלות במכשיר מיקרו-פוטוני שבו חלקיקים מופרדים כדי לספק קריאה אלקטרונית ישירה הדומה למונה קולטר (Coulter counter). כדי להתחיל בבניית המכשיר המיקרופלואידי, צרו סט של ארבעה קודי זהב (gold codes) בני שבעה ביטים. לאחר מכן, תכננו ארבעה פריסות אלקטרודות ייחודיות המבוססות על קודי הזהב באמצעות תוכנה לתכנון בעזרת מחשב, או תוכנת CAD, כגון AutoCAD.

לבסוף, הזמינו ייצור של המסכה הפוטוגרפית (Photomask) עם תכנון האלקטרודות המתוכנן מספק מסכות פוטוגרפיות. לאחר מכן, השרו פרוסת זכוכית בורוסיליקט בקוטר של ארבעה אינץ' בתמיסת פיראנה ביחס של חמישה לאחד בטמפרטורה של 120 °C למשך 20 דקות. לאחר הניקוי, חממו את הפרוסה על פלטה חמה בטמפרטורה של 200 °C למשך 20 דקות כדי לאדות שאריות מים.

הניחו את הפרוסה (wafer) הנקייה והיבשה במכשיר סיבוב לציפוי (spin coater). מרחו 2 milliliters של תמיסת פוטורזיסט שלילי על הפרוסה ובצעו ציפוי בסיבוב במהירות של 3000 revolutions per minute למשך 40 seconds. ייבשו את הפרוסה המצופה על פלטה חמה בטמפרטורה של 150 degrees Celsius למשך דקה אחת.

כסו את הפרוסה במסיכת כרום בתבנית האלקטרודות הרצויה. חשפו את פני הפוטורזיסט הממוסכים לאור UV באורך גל של 365 nanometer כדי להגיע ל-225 millijoule per centimeter squared. לאחר מכן, אפו את הפוטורזיסט החשוף על פלטה חמה בטמפרטורה של 100 degrees Celsius למשך דקה אחת.

טבול את הפרוסה במפתח פוטורזיסט למשך 15 שניות, לאחר מכן שטוף את הפרוסה המודפסת תחת רסס עדין של מים דאיוניים וייבש את הפרוסה תחת זרם של גז חנקן. לאחר מכן, הנח את הפרוסה המודפסת במאדה מתכת באמצעות קרן אלקטרונים. שקדק שכבת כרום בעובי 20 nanometer ושכבת זהב בעובי 80 nanometer על הפרוסה בקצב של אנגסטרם אחד לשנייה.

לאחר מכן, בצעו תכסית (etch) של הפוטורזיסט התחתי על ידי חימום אולטרסוני של הפרוסה המצופה במתכת באצטון למשך 30 דקות בתדר של 40 kilohertz וב-100% amplitude. השתמשו במסור חיתוך (dicing saw) כדי לחתוך את הפרוסה לחלקים קטנים יותר לפי הצורך. כדי להתחיל בייצור תבנית הערוץ המיקרופלואידי, נקו ויבשו פרוסת סיליקון של ארבעה אינץ' באותו אופן שבו טופלה פרוסת הבורוסיליקט שתוארה קודם לכן.

הנח את פרוסת הסיליקון במכשיר סיפינ-קוטור (spin coater) ומרח ארבעה milliliters של תמיסת פוטורזיסט שלילי. בצע סיפינ-קוטינג לפרוסה ב-500 rpm למשך 15 שניות, לאחר מכן ב-1,000 rpm למשך 15 שניות, ולבסוף ב-3,000 rpm למשך 60 שניות. הנח את הפרוסה כשהפנים כלפי מעלה על נייר ניגוב לחדר נקי ספוג באצטון כדי להסיר שאריות פוטורזיסט מגב הפרוסה ומקצוותיה.

אפו את הפרוסה בטמפרטורה של 65 °C למשך דקה אחת ולאחר מכן בטמפרטורה של 95 °C למשך שתי דקות. הניחו תבנית מסכת כרום עבור התעלים המיקרופלואידיים על הפרוסה היבשה. חשפו את הפוטורזיסט לאור UV באורך גל של 365 nm במינון של 180 mJ/cm² ולאחר מכן אפו שוב את הפרוסה בטמפרטורות של 65 ו-95 °C למשך דקה אחת ושתי דקות בהתאמה.

הנח את הפרוסת הסיליקון (wafer) המודפסת בתוך מיכל המכיל חומר מפיתח לפוטורזיסט (photoresist developer) ונער את המיכל בעדינות במשך שלוש דקות. שטוף את הפרוסת המפותחת באיזופרופנול וייבש אותה תחת זרם של גז חנקן. חמם את הפרוסת בטמפרטורה של 200 °C למשך 30 דקות, ולאחר מכן השתמש בפרופילומטר כדי לוודא שעובי הפוטורזיסט המודפס אחיד לכל אורך הפרוסת.

הניחו את הפרוסה (wafer) בתוך דסיקטור ואקום יחד עם 200 µL של trichlorosilane בתוך צלחת פטרי פתוחה. השאירו את הפרוסה בדסיקטור עם ה-trichlorosilane למשך שמונה שעות כדי לבצע סילניזציה של פני השטח של הפרוסה. כדי להתחיל בהרכבת ההתקן, השתמשו בסרט דביק רב-שימושי לחדר נקי כדי לקבע את תבנית פרוסות הסיליקון בתוך צלחת פטרי בקוטר 150 millimeter.

הוסיפו 50 גרם של תערובת ביחס של 10 ל-1 של פולידימטילסילוקסן (polydimethylsiloxane) פרה-פולימר לצחנת הפטרי, ובצעו ניתון גזים (degassing) לתערובת במייבש ואקום למשך שעה אחת. המתינו לסיום תהליך הפולימריזציה (cure) של התערובת שנוקתה מגזים בטמפרטורה של 65 °C למשך ארבע שעות לפחות. השתמשו בסקלפל כדי לחתוך את שכבת ה-PDMS המקשחת, ולאחר מכן קלפו את השכבה המקשחת מהתבנית באמצעות פינצטה.

חתוך את ה-PDMS לחתיכות קטנות. נקב את חורי תעלות המיקרופלואידיקה של הכניסה והיציאה באמצעות מחורר ביופסיה. הנח את שכבת ה-PDMS כשהצד המודפס פונה כלפי מטה על סרט דביק שקוף לחדר נקי כדי לנקות את המשטח שעבר עיבוד מיקרומכני.

שטפו את תשתית הזכוכית הנושאת את האלקטרודה שהוכנה קודם לכן באצטון, איזופרופנול ומים דה-יוניים. ייבשו את התשתית תחת זרם של גז חנקן. הניחו את שכבת ה-PDMS ואת התשתית במחולל פלזמה RF המכוון ל-100 milliwatts, כאשר הצדדים של המיקרו-מכונה פונים כלפי מעלה.

הפעל את משטחי המיקרו-מכונה בפלזמה של חמצן למשך 30 שניות. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ אופטי כדי ליישר את שכבת ה-PDMS בעלת התבנית עם האלקטרודות שעל פני השטח. לאחר היישור, אפשר למשטחים לבוא במגע פיזי כדי לאטום את שכבת ה-PDMS על מצע הזכוכית.

חיוני שדגם אלקטרודת הציפוי על תשתית הזכוכית יהיה מיושר כראוי עם תעלות המיקרופלואידיקה של ה-PDMS. לאחר יישור נכון, האינטראקציה של החלקיקים עם אלקטרודת השטח תייצר את צורת הגל המקודדת הרצויה לריבוי (multiplexing). חממו את המכשיר המורכב בטמפרטורה של 70 °C למשך חמש דקות, כאשר צד הזכוכית פונה כלפי מטה.

לבסוף, הלחים את החוטים למסדי המגע של האלקטרודה כדי להשלים את הרכבת המכשיר. כדי להתחיל בניסוי, הנח את המכשיר המיקרופלואידי על במה של מיקרוסקופ אופטי. חבר את אלקטרודת הייחוס של המכשיר ליציאת האות של מגבר lock-in והפעל גל סינוס בתדר של 400 kilohertz.

חבר את אלקטרודות החיישן החיובית והשלילית לשני מגברי טרנס-אימפדנס (transimpedance amplifiers) עצמאיים. חבר את שני מגברי הטרנס-אימפדנס לכניסות המתח הדיפרנציאלי של מגבר ה-lock-in, כך שאות החיישן החיובי יופחת מאות החיישן השלילי. חבר את יציאת הדמודולטור של מגבר ה-lock-in ליחידה לרכישת נתונים.

בתוכנת רכישת הנתונים, הגדירו קצב דגימה של 1 Megahertz עבור פלט מגבר הנעילה (lock-in amplifier). הגדירו מצלמה במהירות גבוהה כדי להקליט באופן אופטי את פעולת המכשיר כפי שהיא נראית תחת המיקרוסקופ. שאבו תרחיף תאים שהוכן למזרק.

הצמד את מזרק הדגימה למשאבת מזרקים וחבר את המזרק לתעלת הכניסה. כוון את תעלת היציאה למכל פסולת. השתמש במשאבת המזרקים כדי להזרים את תרחיף התאים דרך המכשיר בקצב זרימה קבוע, תוך כדי הקלטת אות אפלולת העכבה.

עם השלמת הניסוי, יש לעבד את הנתונים החשמליים באמצעות תוכנת ניתוח. השוו את האות החשמלי המעובד לתמונות ממצלמת המהירות הגבוהה כדי ליצור עקומת כיול לגודל התא. תרחיף תאים הועבר דרך התקן חיישן מיקרופלואידי עם ארבע תבניות אלקטרודות ייחודיות שנגזרו מקודים של חיישנים אורתוגונליים.

ארבעת אותות החיישן הוקלטו ממוצא חשמלי יחיד. החיישן הבודד הקשור לכל אות שהוקלט זוהה באמצעות קורלציה של אותות החיישן שהוקלטו עם כל הקודים האפשריים, מה שהניב שיאי אוטוקורלציה שניתן להבחין ביניהם בבירור. צורות גל שנוצרו על ידי אותות מפריעים מזיהוי סימולטני של תאים בכל ארבעת הערוצים נפתרו באמצעות אלגוריתם איטרטיבי.

צורת גל מוקלטת הועמדה במתאם (correlated) עם כל הקודים האפשריים, ושיאו הגבוה ביותר של המתאם העצמי זוהה. אות החיישן האינדיבידואלי המתאים שוחזר והופחת מצורת הגל שנכנסה. האות השאריתי הועבר לאיטרציה הבאה כקלט, והתהליך נמשך עד שהאות השאריתי לא הפיק עוד שיאי מתאם עצמי.

האותות המוערכים עובדו ודוקדקו על בסיס אלגוריתם אופטימיזציה שחיפש את ההתאמה הטובה ביותר בין צורות הגל המשוחזרות לאלו שהוקלטו במקור, תוך שימוש בקירוב ריבועים פחותים. מיקום התא, גודלו והזמן שלקח לו לחצות את החיישן נקבעו לאחר מכן על סמך מספר הערוץ, האמפליטודה, משך הזמן והתזמון היחסי של אותות החיישן המוערכים. הפרוצדורה תוקפה באמצעות השוואה של האותות החשמליים עם מדידות אופטיות ממצלמה במהירות גבוהה.

ברגע שהטכניקה נלמדת, יישומה קל מאוד, כיוון שהיא פשוטה מאוד מבחינת החומרה. היא אינה כוללת רכיב פעיל על השבב. היא תואמת ישירות לליתוגרפיה רכה, ועיבוד האותים מתבסס על אלגוריתם חישובי פשוט.

בעזרת פרוטוקול זה תוכלו לייצר שבבים מיקרופלואידיים בעלי חיישנים חשמליים מרובי-ערוצים המבוססים על קוד, ולפענח אותות חשמליים למדידה ביו-אנליטית. טכנולוגיית חישוש אלקטרונית זו, שהיא ורסטילית וניתנת להרחבה, ניתנת לשילוב קל במכשירים מיקרופלואידיים שונים לביצוע בדיקות כמותיות באמצעות מעקב מרחבי-זמני אחר חלקיקים בזמן עיבודם על השבב. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן התכנון, הייצור והיישום של טכנולוגיית CODES מיקרופלואידית.