פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות
16 ביוני 2016
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות תאים בודדים עם פלטפורמה מיקרופלואידית, המשתמשת בתפיסת עיצוב מיקרו-באר חדשה כדי לאפשר בידוד תא בודד ביעילות גבוהה ותרבית משובטת לטווח ארוך.
המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להדגים את הייצור והתפעול של שבב מיקרופלואידי, המאפשר בידוד ותרבית של תאים בודדים ביעילות גבוהה. שיטה זו מספקת כלי שימושי לכל תחום שיוכל להפיק תועלת מבידוד ותרבית של תאים בודדים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היעילות הגבוהה של טעינת תאים בודדים למערכים גדולים של מיקרו-בארות (microwells).
בנוסף, להפעלת המכשיר נעשה שימוש בזרימה עדינה ובכוח הכבידה בלבד, דבר הממזער את הנזק לתאים. השמעות של טכניקה זו מופנית לעבר האבחנה הסופית של מחלות אנוש כגון סרטן, שבהן הטרוגניות תאית משפיעה על תגובת התא; הגענו לרעיון פיתוח שיטה זו בעת הקמת שורת תאים במיקרו-בארים, מאחר ששיטת דילול מוגבל (limit dilution method) הייתה גובהה מאוד ואינה יעילה. כעת, שיטה זו יכולה לספק תובנות בניתוח של תאים בודדים.
ניתן ליישם זאת גם עבור יישומים אחרים, כגון הקמה ומעקב לאורך זמן אחר מהלך והתנהגגות של תא בודד. ראשית, ייצרו תבניות מאסטר סיליניזציה (silanized master molds) הן עבור שכבת בידוד התא הבודד והן עבור שכבת תרבית המיקרו-בארים, באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. עבור כל תבנית מאסטר, ערבבו 16 גרם של בסיס PDMS עם 1.6 גרם של חומר מעקב (curing agent) בכוס חד-פעמית, וערבבו את התערובות עד לאיחוד.
לאחר מכן, הניחו את התבניות הראשיות בתוך צלחות פטרי בנפח 150 מילימטר, ושפכו את ה-PDMS מעל התבניות. הניחו את צלחות הפטרי בתוך דסיקטור והפעילו ואקום למשך שעה אחת כדי להוציא בועות אוויר מה-PDMS. לאחר שעה, הוציאו את הצלחות מהדסיקטור והניחו אותן בתנור קונבנציונלי בטמפרטורה של 65 degrees Celsius למשך שלוש עד שש שעות כדי להקשيح את ה-PDMS.
לאחר מכן, הוציאו את הצלחות מהתנור והניחו להן להגיע לטמפרטורת החדר. לאחר שהתקררו, קלפו את מערך בארי הלכידה (capture-well array) ואת מערך תרביות המיקרו-בארים (microwell culture array) מ-PDMS המקובש מתבניות המאסטר, וגזרו את ההתקנים באמצעות להב תער. לאחר מכן, השתמשו במנקב בקוטר 0.75 millimeter כדי ליצור חור אחד בכל קצה של המיקרו-תעלה בשכבת מערך בארי הלכידה.
השתמשו בסרט הדבקה כדי לנקות את מה שיהיה פני השטח הפנימי של המכשיר, ולאחר מכן הניחו את השכבות הבודדות, כאשר הפנים הפנימי פונה כלפי מעלה, לתוך מכשיר לניקוי בפלזמה לטיפול קצר בפלזמת חמצן. בסיום, הוציאו את שכבות ה-PDMS ממכשיר הפלזמה והשתמשו במיקרוסקופ סטריאו כדי ליישר ולחבר את השכבות העליונה והתחתונה של המכשיר. הניחו את המכשיר המיושר בתנור בטמפרטורה של 65 °C למשך 24 שעות כדי ליצור קשר קבוע בין שכבות ה-PDMS.
בשלב הבא, הניחו את התקן ה-PDMS המחובר במים דה-יוניים והכניסו את המכל למייבש (desiccator) תחת ואקום למשך 15 דקות, כדי להוציא את האוויר מהמיקרו-תעלה של ההתקן. לאחר שכל האוויר הוסר מההתקן, הניחו את התקן ה-PDMS במבצע לתרביות רקמה והשתמשו באור UV כדי לעקר את פני השטח של ההתקן למשך 30 דקות. לאחר מכן, החליפו את המים הדה-יוניים שבהתקן ב-5% bovine serum albumin ב-PBS והדגרירו את ההתקן בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות.
פעולה זו תחסום את פני השטח ותשפר את יעילות ההעברה של תאים מבודדים מבארי הלכידה לבארי התרבית. לאחר 30 דקות, החליפו את תמיסת החסימה במכשיר ב-PBS סטרילי. הכינו סספנסיות של תא בודד בריכוז של 2.5 מיליון תאים למילליליטר ומלאו פיפטה ב-50 µL מהסספנסיות.
לאחר מכן, העבירו את התאים אל תוך המכשיר דרך חור היציאה של המכשיר. טענו 50 µL נוספים של תרחיף התאים והעבירו אותם למכשיר דרך חור הכניסה כדי למלא באופן אחיד את כל המיקרו-תעלה בתאים. לאחר הטעינה, השתמשו בפקק סטרילי העשוי מחוט דיג ניילון בעובי של 1 mm כדי לאטום את חור היציאה של המכשיר.
לאחר מכן, מלאו מזרק סטרילי של 1 mL במצע תרבית, הוציאו בועות אוויר ששאריותיהן נותרו, והניחו אותו במשאבת המזרקים. חברו מחט קהה במידה 23 (gauge) למזרק והשתמשו בצינור polytetrafluoroethylene כדי לחבר את המחט לכניסה של המכשיר. לאחר חיבור הצינור, הסירו את הפקק מחור היציאה והמתינו שתי דקות עד שהתאים ישקעו אל תוך בארי הלכידה לתא בודד באמצעות כוח הכבידה.
לאחר מכן, כוון את משאבת המזרק ל-600 microliters per minute. הסר את פקק היציאה ושטוף את התאים שלא נלכדו למשך 30 שניות. המתן שתי דקות לייצוב הלחץ.
לאחר מכן, הוציאו את המבחנה מפתח הכניסה של המכשיר ואטמו הן את חור הכניסה והן את חור היציאה בעזרת פקקים כדי ליצור מערכת תרבית סגורה. כעת, הפכו את המכשיר ביד כדי להעביר את התאים הבודדים שנלכדו אל מיקרו-בארים של התרבית בצדו השני של המכשיר. לאחר מכן, הניחו את המכשיר בתוך צלחת תרבית רקמות בנפח 100 millimeter, הוסיפו 10 milliliters של PBS סטרילי מסביב למכשיר, והכניסו את הצלחת לאנקובטור.
כדי להחליף את מצע הגידול, הניחו תחילה שתי טיפות של מצע גידול על גבי התקן ה-PDMS בקרבת הכניסה והיציאה, כדי למנוע חדירת בועות אוויר למיקרו-תעלה. לאחר מכן, השתמשו במחורר ביופסיה של 0.75 millimeter כדי לחורר שני חורים מהחלק העליון של התקן ה-PDMS בקרבת קצות המיקרו-תעלה. ודאו שאתם מחוררים רק את השכבה העליונה של ההתקן.
בשלב הבא, מלאו מזרקה פלסטית של 1 ml המכילה מצע טרי שחומם מראש, והשתמשו במחט קהה (blunt) במידה 23 ובצינור PTFE כדי לחברה לנתיב הכניסה שנוצר. זרימו באיטיות כ-120 µl של מצע טרי אל תוך המכשיר במשך חמש דקות כדי להחליף את המצע הישן. עם הסיום, אטמו את נתיבי הכניסה והיציאה באמצעות שני פקקים, והחזירו את המכשיר לאינקובטור לתרביות תאים.
מספר התאים שמגיעים לבארות הלכידה נע בין כ-68% ל-85%, תלוי בסוג התא. בנוסף, עבור כל שלושת סוגי התאים, מרבית בארות הלכידה הכילו תא בודד בלבד. לאחר העברת תאי KT98 שנלכדו אל בארות התרבית, כ-77% מהבארות הכילו תא בודד בלבד, 16% היו ללא תאים, 6% הכילו שני תאים, ופחות מ-1% מהבארות הכילו שלושה תאים או יותר.
במהלך שבעה ימים, תאים בודדים שבודדו הראו דפוסי גדילה הטרוגניים. בעוד שחלק מהתאים התרבו, אחרים לא. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בכ-20 דקות אם היא מבוצעת כראוי.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש בפלטפורמה זו לתרבית אנדוקרינית עם בידוד תאים בודדים בתפוקה גבוהה, במטרה להגביר את הפרודוקטיביות של ניסויי התאים הבודדים שלכם. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להימנע מחדירת בועות אוויר למיקרו-ערוץ ולמנוע מהתאים להצטבר זה בזה עם חלוף הזמן.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים את הייצור וההפעלה של שבב מיקרופלואידי שתוכנן לבידוד ותרבית של תא בודד ביעילות גבוהה. השבב ממזער את הנזק לתאים על ידי שימוש בזרימה עדינה ובכוח הכבידה.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום מדע
- מיקרופלואידיקה
- תרבית תאים
- ניתוח תא בודד
רקע
- בידוד תאים בודדים הוא חיוני להבנת ההטרוגניות התאית.
- שיטות מסורתיות, כגון דילול הגבולי (limit dilution), הן גוזלות זמן ואינן יעילות.
- גישה מיקרופלואידית זו משפרת את היעילות בטעינה של תאים בודדים.
- היישומים משתרעים עד לאבחון מחלות, כולל סרטן.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לבידוד ותרביות יעילים של תאים בודדים.
- מתן תובנות לגבי ניתוח של תאים בודדים.
- שיפור ההבנה של תגובות תאיות באוכלוסיות הטרוגניות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ייצור של שבב מיקרופלואידי.
- שימוש במערכי מיקרו-בארים להעמסת תאים.
- יישום של זרימה עדינה וכוח כבידה.
- תרבית קלונאלית ארוכת טווח של תאים מבודדים.
תוצאות עיקריות
- יעילות גבוהה בבידוד תאים בודדים.
- צמצום נזקי התאים במהלך תהליך הבידוד.
- תרבית ארוכת טווח מוצלחת של תאים בודדים.
- יישומים פוטנציאליים באבחון ובמחקר של סרטן.
מסקנות
- הפלטפורמה המיקרופלואידית היא כלי בעל ערך למחקרי תא בודד.
- שיטה זו יכולה לשפר משמעותית את המחקר בתחום ההטרוגניות התאית.
- היא פותחת נתיבים חדשים להבנת מנגנוני מחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פלטפורמה מיקרופלואידית זו פותרת צוואר בקבוק קריטי בניתוח של תא בודד על ידי מתן אפשרות לבידוד ביעילות גבוהה ולתרבית לטווח ארוך מבלי לפגוע בחיוניות התאים. על ידי הפחתת ההסתמכות על שיטות דילול הגבליות (limit dilution) עתירות עבודה, היא מאיצה את בדיקת ההשערות בתהליכי תיקוף מטרות (target validation) וסריקה פנוטיפית. המערכת תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות הרחבה קלונלית והערכת הטרוגניות, ובכך מספקת מידע ישיר לקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות בידוד תאים בודדים לצורך תיקוף פונקציונלי.
- ערך תפעולי: מפחית את הזמן ואת צריכת הריאגנטים בהשוואה לשיטות מסורתיות להשגת שבטים (clonal derivation).
- ביטחון תחזיתי: תומך במיון פורטפוליו על ידי כימות ההטרוגניות השבטית בקווי תאים הרלוונטיים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצר אוכלוסיות קלונאליות סטנדרטיות וניתנות לשחזור לצורך סריקת תרכובות בשלבים הבאים.
- יכולת הרחבה (Scalability): תכנון מערך המיקרו-בארים מאפשר עיבוד מקבילי של מאות תאים בודדים בכל הרצה.
- תוצר כמותי: מאפשר מדידה של קינטיקת גדילה ופוטנציאל התמיינות כנקודות סיום של הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מערכת רלוונטית למחלה: שומרת על נאמנות פנוטיפית של תאי גזע עצביים ותאי סרטן מסוג KT98 לאורך תרבית של 7 ימים.
- הלימה עם ביומרקרים תרגומיים: מקשרת בין התנהגות של תא בודד לתגובות ברמת האוכלוסייה בתרביות הטרוגניות.
- קידום מותאם סיכונים: מזהה תתי-אוכלוסיות בעלות פרופילים שונים של צמיחה או הישרדות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
הפלטפורמה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת מקור הדיר מקבוצות תאים קלונאליים עבור בדיקות מעורבות מטרה ובדיקות פנוטיפיות, ובכך היא מגשרת בין שלב הבידוד לתיקוף התפקודי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות באמצעות תרבית תאים בודדים מבוקרת ומעקב אחר שושלות תאים.
- סריקה: מספקת אוכלוסיות קלונאליות מוכנות לבדיקה עם שונות מינימלית.
- אנליטיקה: מאפשרת כימות של התרחבות קלונאלית והטרוגניות כמדדים פנוטיפיים מרכזיים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין התנהגות של תא בודד לתגובות של אוכלוסיית תאים רחבה במודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: תהליך הייצור מאפשר שכפול בין פרויקטים וסוגי תאים שונים ללא צורך באופטימיזציה מחדש.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי הפחתת הטיות קלונאליות וארטיפקטים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בידוד תאים בודדים בין משתמשים ומעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי קיצור הזמן עד לקבלת קלון והעלאת שיעורי ההצלחה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות המבוסס על נתונים, בהתבסס על פרופילי תגובה קלונאליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בהתקני מיקרופלואידיקה ובטכניקות סטריליות לתרבית תאים.
- תלוי בגישה לציוד לאיחוי פלסמה ולמחברי נוזלים מדויקים.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי הכנת תמיחת התאים וטעינתם.
- התאמה לתאים ראשוניים עשויה לדרוש אופטימיזציה של ממדי המיקרו-בארים והכימיה של פני השטח.
- הצלחת התרבית לטווח ארוך תלויה בתדירות החלפת המצע ובמניעת בועות.
