June 16th, 2016
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות תאים בודדים עם פלטפורמה מיקרופלואידית, המשתמשת בתפיסת עיצוב מיקרו-באר חדשה כדי לאפשר בידוד תא בודד ביעילות גבוהה ותרבית משובטת לטווח ארוך.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים את הייצור והתפעול של שבב מיקרופלואידי, המאפשר בידוד ותרבית של תא יחיד ביעילות גבוהה. שיטה זו מספקת כלי שימושי לכל אזור שיפיק תועלת מבידוד ותרבית של תא בודד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יעילה ביותר בהעמסת תאים בודדים למערכי מיקרובאר גדולים.
בנוסף, רק זרימה עדינה וכוח הכבידה משמשים להפעלת המכשיר, מה שממזער את הנזק לתאים. ההשלכה של טכניקה זו מופנית לאבחון הסופי של מחלות אנושיות כמו סרטן, בהן הטרוגניות תאית משפיעה על תגובת התא, ולכן הגענו לרעיון לפתח שיטה זו כאשר הקמנו את קו התאים של מיקרווול, מכיוון ששיטת דילול הגבול הייתה מאוד גוזלת זמן ולא יעילה. כעת שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ניתוח תאים בודדים.
ניתן ליישם אותו גם על יישומים אחרים כגון הקמה וזמן התבוננות במהלך והתנהגות התא הבודד. כדי להתחיל, לייצר תבניות מאסטר סילניות הן עבור שכבת בידוד התא הבודד והן עבור שכבת תרבית המיקרווול, תוך שימוש בפוטוליתוגרפיה סטנדרטית כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. עבור כל תבנית מאסטר, שלבו 16 גרם של בסיס PDMS עם 1.6 גרם של חומר ריפוי בכוס חד פעמית, וערבבו את התערובות עד לאיחוד.
לאחר מכן, מניחים את תבניות המאסטר לצלחות פטרי של 150 מילימטר, ויוצקים את ה-PDMS על גבי התבניות. מניחים את צלחות הפטרי לתוך מייבש ומורחים ואקום למשך שעה כדי להסיר בועות אוויר מה-PDMS. לאחר שעה, הוציאו את הכלים מהחומר המייבש והכניסו אותם לתנור רגיל בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד שש שעות כדי לרפא את ה-PDMS.
לאחר מכן, הוציאו את הכלים מהתנור ותנו להם להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר שהתקרר, קלף את מערך בארות ה-PDMS הנרפא ומערך תרבית המיקרו-באר מתבניות המאסטר וחתוך את המכשירים באמצעות סכין גילוח. לאחר מכן, השתמש באגרוף של 0.75 מילימטר כדי ליצור חור אחד בכל קצה של המיקרו-ערוץ בשכבת מערך באר הלכידה.
השתמש בסרט כדי לנקות את מה שיהפוך למשטח הפנימי של המכשיר, ולאחר מכן הנח את השכבות הבודדות כשהמשטחים הפנימיים פונים כלפי מעלה לתוך מנקה פלזמה לטיפול קצר בפלזמת חמצן. בסיום, הסר את שכבות ה-PDMS ממנקה הפלזמה והשתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי ליישר ולחבר את השכבות העליונות והתחתונות של המכשיר. הכניסו את המכשיר המיושר לתנור בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי ליצור קשר קבוע בין שכבות ה-PDMS.
לאחר מכן, הנח את מכשיר ה-PDMS המודבק במים נטולי יונים והנח את המיכל במייבש תחת ואקום למשך 15 דקות, על מנת להסיר את האוויר מהמיקרו-ערוץ של המכשיר. כאשר כל האוויר מוסר כעת מהמכשיר, הנח את מכשיר ה-PDMS במכסה מנוע לתרבית רקמות והשתמש באור UV כדי לעקר את פני המכשיר למשך 30 דקות. לאחר מכן, החלף את המים נטולי היונים במכשיר באלבומין סרום בקר של 5% ב-PBS ודגר את המכשיר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
זה יחסום את פני השטח וישפר את יעילות ההעברה של תאים מבודדים מבארות לכידה לבארות התרבית. לאחר 30 דקות, החלף את תמיסת החסימה במכשיר ב- PBS סטרילי. הכן מתלה חד תאי עם 2.5 מיליון תאים למיליליטר והעמיס פיפטה עם 50 מיקרוליטר מהמתלה.
לאחר מכן, העבר את התאים למכשיר דרך חור היציאה של המכשיר. טען עוד 50 מיקרוליטר של מתלה התאים והעביר אותו למכשיר דרך חור הכניסה כדי למלא באופן שווה את כל המיקרו-ערוץ בתאים. לאחר הטעינה, השתמש בתקע סטרילי העשוי מחוט דיג ניילון בקוטר מילימטר אחד כדי לאטום את חור היציאה של המכשיר.
לאחר מכן, מלאו מזרק סטרילי של מיליליטר אחד במדיום תרבית, הוציאו את כל בועות האוויר שנותרו והכניסו אותו למשאבת המזרק. חבר מחט קהה בגודל 23 למזרק והשתמש בצינורות פוליטטרפלואורואתילן כדי לחבר את המחט לכניסה של המכשיר. לאחר חיבור הצינור, הסר את התקע מחור היציאה והמתן שתי דקות בזמן שהתאים מתיישבים בבארות הלכידה של התא הבודד בכוח הכבידה.
לאחר מכן, הגדר את משאבת המזרק ל -600 מיקרוליטר לדקה. הסר את תקע השקע ושטוף את התאים שלא נלכדו למשך 30 שניות. המתן שתי דקות עד שהלחץ יתייצב.
לאחר מכן הסר את הצינור מכניסת המכשיר ואטום את חורי הכניסה והיציאה בעזרת תקעים ליצירת מערכת תרבות סגורה. כעת הפוך את המכשיר ביד כדי להעביר את התאים הבודדים שנלכדו למיקרו-בארות התרבות בצד השני של המכשיר. לאחר מכן, הניחו את המכשיר בתבנית תרבית רקמות בגודל 100 מילימטר, הוסיפו 10 מיליליטר PBS מעוקר סביב המכשיר והניחו את המנה בחממה.
כדי להחליף את מדיום התרבית, הנח תחילה שתי טיפות של מדיום תרבית על גבי מכשיר ה-PDMS ליד הכניסה והיציאה כדי למנוע הכנסת בועות אוויר למיקרו-ערוץ. לאחר מכן, השתמש במנקב ביופסיה של 0.75 מילימטר כדי לנקב שני חורים מהחלק העליון של מכשיר ה-PDMS ליד קצות המיקרו-ערוץ. הקפד לנקב רק את השכבה העליונה של המכשיר.
לאחר מכן, מלאו מזרק פלסטיק של מיליליטר אחד המכיל מדיום טרי שחומם מראש, והשתמשו במחט קהה בגודל 23 ובצינורות PTFE כדי לחבר אותו ליציאת הכניסה החדשה שנוצרה. הזרימו לאט כ-120 מיקרוליטר של מדיום טרי לתוך המכשיר במשך חמש דקות כדי להחליף את המדיום הישן. בסיום, אטום את יציאות הכניסה והיציאה באמצעות שני תקעים, והחזר את המכשיר לחממת תרבית התאים.
מספר התאים שמגיעים לבארות הלכידה נע בין כ-68% ל-85%, תלוי בסוג התא. בנוסף, רוב בארות הלכידה מכילות תא אחד בלבד, עבור כל שלושת סוגי התאים. לאחר העברת תאי KT98 שנלכדו לבארות התרבית, בכ-77% מהבארות היה רק תא אחד, ב-16% לא היו תאים, ב-6% היו שני תאים ובפחות מ-1% מהבארות היו שלושה תאים או יותר.
במהלך שבעה ימים, תאים בודדים מבודדים הפגינו דפוסי גדילה הטרוגניים. בעוד שחלק מהתאים התרבו, אחרים לא. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כ-20 דקות אם היא מבוצעת כראוי.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בפלטפורמת התרבית האנדוקרינלית הזו לבידוד תאים בודדים בתפוקה גבוהה כדי להגביר את הפרודוקטיביות של ניסויי התא הבודד שלך. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להימנע מבועות אוויר להיכנס למיקרו-ערוץ ולמנוע התאים להצטבר יחד ככל שהזמן עובר.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
פרוטוקול זה מדגים את הייצור והפעולה של שבב מיקרו-נוזלי המיועד לבידוד ותרבות תאים בודדים ביעילות גבוהה. הוא ממזער את הנזק לתאים על ידי שימוש בזרימה עדינה וכוח הכבידה.
This microfluidic platform addresses a critical bottleneck in single-cell analysis by enabling high-efficiency isolation and long-term culture without compromising cell viability. By reducing reliance on labor-intensive limit dilution methods, it accelerates hypothesis testing in target validation and phenotypic screening workflows. The system supports mechanistic de-risking through clonal expansion and heterogeneity assessment, directly informing go/no-go decisions in early discovery.
The platform integrates into early discovery workflows by providing a reproducible source of clonal cells for target engagement and phenotypic assays, bridging isolation to functional validation.