Name: פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: למדו לבנות ולהפעיל שבב מיקרו-זרימה לבידוד וגידול תאים בודדים ביעילות גבוהה. השיטה מציעה כלי יעיל למחקר סרטן והבנת הטרוגניות תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענק ממכוני המחקר הלאומיים לבריאות (03-A1 BNMP11-014).

הערה: עיצובי photomask עבור ייצור מכשיר microfluidic שלנו נמשכו באמצעות תוכנת מחשב תכנון בעזרת מחשב (CAD). העיצובים נוצלו אז לפברק photomasks כרום באמצעות שירות מסחרי. מכשירי PDMS נעשו באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכות. 11 ייצור 1. של תבניות הורים על ידי ליתוגרפיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תהליך photolithography 12, השתמשו פרוסות סיליקון 4 אינץ &#39;כמו מצע מייבש את הפרוסות בתנור רגיל ב 120 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את פרוסות סיליקון מיובש באמצעות טיפול פלזמה חמצן ב 100 וואט למשך 30 שניות בתוך שואב פלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם שתי כיריים על 65 מעלות צלזיוס ו -95 מעלות צלזיוס, בהתאמה, עבור תהליך האפייה הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל 5 גרם של photoresist שלילית (PR) על פרוסות סיליקון ניקה ידי coater ספין; ספין ב -1,200 סל&quot;ד (SU-8 50) למשך 30 שניות כדי לייצר את שכבת microchannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את PRמצופה רקיק על פלטה חמה שחוממה מראש ב 65 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות ולהעביר אותו למקום אחר פלטה חשמלית שחוממה מראש ב 95 מעלות צלזיוס במשך 33 דקות (עבור 100 מיקרומטר דפוסים עבים) לבצע תהליך לאפות רך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אפייה, מניחים את פרוסות סיליקון מצופה PR על בעל aligner מסכת חצי אוטומטי וליישר אותו photomask שקיפות ברזולוציה 25,400 dpi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את פרוסות סיליקון מצופה PR לאור UV (365 ננומטר) במינון של 500 mJ / 2 ס&quot;מ כדי ליצור את דפוס יחסי ציבור על פרוסות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את אפיפית aligner ומניח אותו על פלטה חמה עבור שלאחר אפייה על 95 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרה את הפרוסות ב מפתח SU-8 (יצטט אתר monomethyl פרופילן גליקול, PGMEA) פתרון לשטוף PR uncrosslinked במשך 12 דקות ויבשות בעדינות באמצעות גז חנקן כדי לחשוף את סימני היישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב, מעיל 5 גרם של photoresist שלילית על ופלים ידי coater ספין; ספין ב 700 סל&quot;ד (SU-8 100) למשך 30 שניות ו -1,200 סל&quot;ד (SU-8 10) למשך 30 שניות ב -300 &amp;# 181; דפוס מ &#39;עובי ו -27 מיקרומטר דפוס עבה בהתאמה להפוך את שכבת microwell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פרוסות PR מצופה על פלטה חמה על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות (עבור 27 מיקרומטר שכבה ללכוד היטב עמוק); ו ב 65 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות ו 95 מעלות צלזיוס למשך 110 דקות (עבור 300 מיקרומטר שכבת התרבות-באר עמוקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקירור, מניחים את פרוסות סיליקון מצופה PR על aligner מסכה מצויד אור UV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את פרוסות סיליקון מצופה PR אל אור UV (365 ננומטר) במינון של 250 mJ / 2 ס&quot;מ (עבור 27 מיקרומטר דפוס עבה) ו -700 mJ / 2 ס&quot;מ (עבור 300 מיקרומטר דפוס עבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופים את פרוסות על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (27 מיקרומטר דפוס עבה) ו -30 דקות (300 מיקרומטר דפוס עבה), בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את ה- PR uncrosslinked ידי PGMEA במשך 6 דקות (27 מיקרומטר דפוס עבה) ו -25 דקות (300 מיקרומטר דפוס עבה), בהתאמה, ולאחר מכן לייבש אותם עם גז חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את גובהם של דפוס תכונותרקיק עם profilometer לייזר סריקה על ידי הנחת פרוסות על-הבמה XY של profilometer לייזר סריקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מישור המוקד כדי מראים בבירור את התבנית כולל על פרוסות סיליקון באמצעות &quot;תצוגת המצלמה&quot; מצב תצפית תחת עדשה אובייקטיבי 20X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את מצב התצפית מן &quot;תצוגת מצלמה&quot; ל &quot;נוף ליזר&quot;, ולהגדיר את העמדות העליונות ותחתונות של התכונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מצב המדידה, שטח, איכות, ו- Z-המגרש עד (למעלה) שקופים, 1 הקו (1,024 x 1), דיוק גבוה ו -0.5 מיקרומטר, בהתאמה, ולאחר מכן לחץ על החלקה התחתונה כדי להתחיל את המדידה. </li></ol></li></ol> 2. הכנת התקני PDMS עבור בידוד תא בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ליהוק PDMS, silanize תבניות ההורים עם trichlorosilane כדי ליצור משטח הידרופובי, מה שהופך אותו קל יותר לקלף את העתקי PDMS מן תבניות ההורים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תבניות הורים וסירה שקלול המכיל200 μl של trichlorosilane ייבוש, ולהחיל ואקום (-85 kPa) במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את הוואקום ולאחר מכן לעזוב את תבניות ההורים בבית הייבוש silanize התבניות מאסטר בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תבניות הורים מתא הייבוש ומקום כל עובש אמן בצלחת 10 ס&quot;מ פטרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בסכום כולל של ערכת פולימר PDMS 17.6 גרם המכיל בסיס ואת סוכן ריפוי ביחס של 10: 1, ואז לשפוך את PDMS על עובש אמן בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי ייבוש ולהחיל ואקום (-85 kPa) במשך שעה 1 כדי להסיר בועות אוויר בתוך PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת פטרי מן הייבוש ומניח אותו בתנור רגיל על 65 מעלות צלזיוס למשך 3 - 6 שעות כדי לרפא את PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת העותקים המשוכפלים PDMS נרפא מן תבניות הורים ומחייג שני חורים כמו מפרצון ולשקע על שני הקצוות של microchannel על העתק PDMS מערך היטב ללכוד ידי אגרופן עם קוטר פנימי של 0.75 מ&quot;מ עבור ערוץ fluidic (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קלטת לניקוי המשטח של העתקי PDMS, ולאחר מכן למקם את העתקי PDMS בתוך שואב פלזמה לטיפול פלזמת חמצן קצר (100 ואט במשך 14 שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת העותקים המשוכפלת PDMS ממכונת פלזמת חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר עליון (המכיל את microwells הלכידה) וכן PDMS תחתונה (המכיל את microwells התרבות) העתק ביד תחת סטראו ולהביאם במגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את העתקי PDMS מיושרים בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי להשיג זוגיות קבועה בין העתקי PDMS כדי ליצור את המכשיר הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את המכשיר PDMS בתוך deionized (DI) -water מיכל מלא ומניחים את המיכל ייבוש תחת ואקום (-85 kPa) במשך 15 דקות כדי להסיר אוויר מן microchannel של המכשיר PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המכשיר PDMS מלא מים DI במנדף בתרבית רקמה ולהשתמש אור UV (אורך הגל של האור: 254 ננומטר) לעקר של המכשיר עבור 30 מילn. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המים DI במכשיר PDMS עם אלבומין 5% שור (BSA) בתמיסה 1x PBS ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי למנוע מתאי יידבקו אל פני השטח PDMS. הערה: ציפוי BSA הוא קריטי כדי לשפר את יעילות העברת תאים מבודדים מתפיסה-היטב-היטב בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את פתרון BSA 5% במכשיר PDMS עם פתרון 1x PBS מעוקר. </li></ol> 3. הכנת ההשעיה תא בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצבי תרבות בתאי גזע KT98, ו A549 תאי קרצינומה אדם מד&quot;א- MB-435 אנחנו בצלחת פטרי תרבית תאי חממה קונבנציונלית (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו -95% לחות) להכין תאים לניסוי תא מכשיר PDMS . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר וזורק את מדיום תרבות בילו (בינוני הבזליים DMEM מסופק עם 10% בסרום שור עובריים 1% אנטיביוטיקה) מצלחת התרבות עם תאים שגודלו עד 70 - 80% מפגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את התאים עם פעמים מעוקרות שלושה PBS. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר וזורק את PBS, ולהוסיף 2 מיליליטר של תערובת אנזים רקומביננטי עם פרוטאוליטים, collagenolytic, ופעילויות DNase (עיין הרשימה חומר המידע המפורט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את מנת התרבות בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות, ולאחר מכן קש על מנת התרבות להקל ניתוק תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ&quot;ל של עיקור PBS לפזר תאים, ולאחר מכן להעביר את ההשעיה לתא צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב XG 300 במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend התא גלולה ב 1 מ&quot;ל מעוקר PBS ולספור את מספר תא חי בשיטת הרחקה Trypan כחול תקן 13. הערה: צעד resuspension זה הוא קריטי עבור הכנת השעית תא בודד ניתקת גם כדי לשפר את יעילות בידוד התא הבודד. </li></ol> 4. בידוד תא בודד ותרבות משובטת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 50 μl של השעית תא בריכוז של 2.2 - 2.5 x10 <sup&gt; 6 תאים / מ&quot;ל לתוך microchannel של המכשיר PDMS דרך החור לשקע של המכשיר עם טפטפת כף יד. הערה: פיפטה טעינת תא ההשעיה שחייבת להיפסק והחזיק במיקום התחנה הראשון כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתוך microchannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען עוד 50 μl של השעית תא דרך חור המפרצון כדי למלא את microchannel כולו באופן שווה עם תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את החור לשקע עם תקע (ארוך 3 מ&quot;מ, 1 מ&quot;מ חוט חכת ניילון לחתוך קוטר), כדי למנוע זרימת מושרה על ידי לחץ ההידרוסטטי מן הטיפין על חורי כניסה ויציאה. הערה: התקעים היו UV עיקור בתוך ברדס בתרבית רקמה לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את מזרק סטרילי 1 מ&quot;ל עם המדיום תרבות, להוציא בועות אוויר ממנו, ולהגדיר אותו על משאבת מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את המזרק טעון בינוני עד החור מפרצון של המכשיר PDMS באמצעות מחט 23 G בוטה בצינור פולי-tetrafluoroethene (PTFE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התקע לשקע חור וכלow מרווח זמן של 2 דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב לתוך בארות לכידת תא בודד על ידי כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים שלא נלכדו עם 300 μl של מדיום התרבות בקצב זרימה של 600 μl / min מונע על ידי משאבת המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 2 דקות כדי לייצב את המכשיר, ולאטום את חורי מפרצון ו לשקע עם אטמים כדי ליצור מערכת תרבות סגורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהפוך את המכשיר ביד להעביר את חד תאים שנתפסו על microwells התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המכשיר PDMS בצלחת בתרבית רקמה 100 מ&quot;מ, ולהוסיף 10 מ&quot;ל של PBS מעוקרים סביב המכשיר כדי למנוע אידוי תרבות בינוני מן microchannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את מנת תרבות חממת תרבית תאים קונבנציונלית (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו -95% לחות) לתרבות המשובטת של-תאים הבודדים. </li></ol> 5. רענון בינוני תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1 ד תרבות, להחליף את מדיום תרבות מכשיר PDMS עם מדיום חדש לשיפור יחסי ציבור תאoliferation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח שתי טיפות של מדיום תרבות על גבי מכשיר PDMS ליד אזורי חורי כניסה ויציאה כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתוך microchannel בעת ביצוע השלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פאנץ שני חורים מהחלק העליון של המכשיר PDMS ליד שני הקצוות של microchannel כקובץ מפרצון ולשקע עבור microchannel. הערה: אל אגרוף דרך שתי שכבות שלמות של המכשיר PDMS; במקום, רק אגרוף דרך השכבה העליונה של PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר מזרק פלסטיק 1 מ&quot;ל המכיל מדיום חדש אל מפרצון באמצעות מחט 23 G בוטה צינורות PTFE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימה בינונית טרי 120 μl לתוך המכשיר למשך 5 דקות כדי להחליף את המדיום הישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס שני תקעים לאטום את הכניסה ויציאה חורה, ולהחזיר את המכשיר אל האינקובטור תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן את מדיום התרבות כל 2 ד בתקופת התרבות ידי הסרת תקעי איטום, ואחריו חזרה על שלבי 5.4 עד 5.5. </li></ol>

<ol><li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+cloning+of+colon+cancer+stem+cells+reveals+a+multi-lineage+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+flow+cytometry%22">Practical flow cytometry</a>. , John Wiley & Sons. (2005).</li>
<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).</li>
<li>Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing-based+technologies+will+revolutionize+whole-organism+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science.</a> Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).</li>
<li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+single-cell+trapping+and+imaging+using+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays.</a> Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+fibrin+gels+promote+selection+and+growth+of+tumorigenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells.</a> Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).</li>
<li>Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+column%3A+microwell+arrays+for+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture.</a> Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).</li>
<li>Lindstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+microwell+chip+for+culture+and+analysis+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells.</a> PloS one. 4 (9), e6997(2009).</li>
<li>Lin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+dual-well+device+for+high-throughput+single-cell+capture+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture.</a> Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).</li>
<li>Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturization+of+biological+assays+-+Overview+on+microwell+devices+for+single-cell+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Bba-Gen+Subjects%22%5BJournal%5D)">Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses.</a> Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).</li>
<li>Lecault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+single+hematopoietic+stem+cell+proliferation+in+microfluidic+cell+culture+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays.</a> Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).</li>
<li>Park, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+trapping+in+larger+microwells+capable+of+supporting+cell+spreading+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation.</a> Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).</li>
<li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+solid+tumors%3A+an+overview+and+new+approaches+for+their+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization.</a> FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).</li>
<li>Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEMS+microwell+and+microcolumn+arrays%3A+novel+methods+for+high-throughput+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays.</a> Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).</li>
<li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Screening+Using+a+Library+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Reveals+Disease-Specific+Patterns+of+Cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מערכות מכשירות מבוסס microwell 6,14 כבר נוצלו עבור מניפולצית תא בודד וניתוח, כגון תא בודד בקנה מידה גדולה השמן 6 ובחלוקה של תאי גזע hematopoietic יחיד 15. למרות גודל היטב, מספר, וצורה יכולה להיות מותאם עבור יישומים ספציפיים, את יעילות בידוד התא היחיד נפגעה תמיד כאשר הגודל של הבאר הוא גדל. 9,15 כדי להתגבר על מגבלה זו, פרק et al. דיווח על שבב microfluidic עם micr...

כרגע הצבת תאים בודדים בנפרד בחלל תרבות מושגת בדרך כלל באמצעות דילול מגביל או תא מופעל קרינת מיון (FACS). למעבדות רבות, הגבלת דילול היא שיטה נוחה, כמו זה רק דורש צלחות תרבות פיפטה ורקמות, אשר זמינות. במקרה זה, השעית תא הוא מדולל סדרתי צפיפות תאים מתאימה, ולאחר מכן להציב לתוך בארות תרבות באמצעות פיפטה ידנית. תאים בודדים המחולקים אלה משמשים לניתוח תא, כגון מגוון גנטי הקרנת היווצרות 1 ו מושבת 2. עם זאת, שיטה זו היא נמוכה תפוקה ועבודה אינטנסיבית, ללא ניצול זרוע רובוטית עבור סיוע, כי טבעו התפלגות פואסון של שיטת הדילול המגבילה מגביל אירועים-תא בודד כדי הסתברות מקסימלית של 37% 3. מכונית FACS עם זרוע רובוטית משולבת יכול להתגבר על המגבלה של התפלגות פואסון ידי במדויק Placing מתא בודד אחד בתרבות היטב בכל פעם 4. עם זאת, לחץ הגזירה המכאני הגבוה (ובכך, הוריד כדאיויות תא) 5 ורכישת מכונית ועלויות תפעול מוגבלות השימוש שלה במעבדות רבות. כדי להתגבר על המגבלות לעיל, התקנים microscale פותחו כדי מאוד ביעילות לטעון תאים בודדים לתוך microwells 6. עם זאת, microwells אינו מספק מרחב מספיק עבור התאים הטעונים להתרבות, בשל הצורך של עשייה את הגודל של כל microwell קרוב לזה של תא בודד כדי להגביר את סיכוי טעינת תא הבודד. כמו מבחני תרבות נדרשים ביישומים רבים מבוסס תאים (למשל, clonogenic assay 7), microwells הגדול (מ 90 - 650 מיקרומטר בקוטר או באורך צד) גם כבר נוצל כדי לאפשר בתרביות תאים מורחבות. עם זאת, כמו שיטת הדילול המגבילה, הם גם בעלי יעילות טעינת תא בודדת נמוכה, הנעים בין 10 -. 30% 8, 9 בעבר, פיתחנו פלטפורמה microfluidic תפוקה גבוהה לבודד תאים בודדים microwells הפרט להפגין היישום שלה assay clonogenic של תאים בודדים. 10 המכשיר נעשתה עם פולי-dimethylsiloxane (PDMS), ונחלק לשני סטים של מערכים microwell עם גדלי microwell שונים, אשר יכול לשפר את היעילות בעיקר בטעינת תא בודד בתוך microwell שגודל הוא גדול יותר באופן משמעותי מאשר התא. יש לציין, זה &quot;כפול גם&quot; המושג מאפשר גודל השטח תרבות להיות מותאם באופן גמיש מבלי להשפיע על יעילות לכידת תא בודד, מה שהופך אותו פשוט כדי להתאים את העיצוב של המכשיר כדי להתאים סוגים ויישומים סלולריים שונים. שיטת יעילות גבוהה זה צריכה להיות שימושי עבור ניסויים בתרביות תאים לטווח ארוכים ללימודי ההטרוגניות תא הקמת קו סלולארי חד שבטית.

<table><tbody><tr><td>תוכנת AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD LT 2011</td><td>חלק מס' 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>רקיק סיליקון&nbsp;</td><td>אלטק קורפרציה</td><td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>תנור קונבנציונאלי</td><td>חברת YEONG-SHIN</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>מנקה פלזמה</td><td>נורדסון</td><td>AP-300</td><td>מערכת טיפול בפלזמה ספסל</td></tr><tr><td>SU-8 50 שלילי פוטו-רזיסט</td><td>MicroChem</td><td>Y131269</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 100 שלילי פוטו-רזיסט</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>ציפוי ספין</td><td>Synrex Co., בע"מ.</td><td>SC-HMI 2 "~ 6"</td><td></td></tr> <tr><td>פלטה חמה</td><td>חברת</td><td>YOTEC YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Msak aligner</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 מפתח</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>פרופילן גליקול מונומתיל אתר אצטט פרופילן גליקול</td></tr><tr><td>סריקת לייזר פרופילומטר</td><td>KEYENCE</td><td>VK-X 100</td><td></td></tr><tr><td>Trichlorosilane</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. מסוכנים. מאכל לדרכי הנשימה, מגיב באלימות עם מים.</td></tr><tr><td>מייבש מוצרי</td><td>בל-ארט</td><td>F42020-0000</td><td>מייבש ואקום חוסך מקום 190&nbsp; מ"מ בסיס</td></tr><tr><td>לבן Polydimethylsiloxane (PDMS) ערכת</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core</td><td>אגרוף טד פלה בע"מ.</td><td>15072</td> עם סרט נשלף <td>בקוטר פנימי 0.75 מ"מ</td></tr><tr><td>3M</td><td>חברת</td><td>סקוטש נשלף קלטת 811</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td> <td>Bersing Technology</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM בינוני בסיסי</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>תרמו היקלון</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>גלוטמין-פניצילין-סטרפטומיצין</td></tr><tr><td>תערובת אנזימים רקומביננטית</td><td>טכנולוגיית תאים חדשנית</td><td>AM-105</td><td>Accumax</td></tr><tr><td>DiIC12(3) צבע קרום התא</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>משמש כמעקב אחר תאים</td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>703007</td><td></td></tr><tr><td>פלסטיק מזרק (1 מ"ל)</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>מחטים קהות 23 מד</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td>צינורות <td>TD21</td><td></td></tr><tr><td>פולי-טטרפלואורואתן (PTFE)</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>קוטר פנימי TFT-23T</td><td>, 0.51&nbsp; מ"מ; קוטר חיצוני, 0.82&nbsp; מ"מ</td></tr></tbody></table>

פלטפורמת microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

חקר ההטרוגניות של תאים בודדים הוא חיוני לשאלות ביולוגיות רבות, אך הוא קשה מבחינה טכנית. לפיכך, יש צורך בשיטה פשוטה, אך בעלת תפוקה גבוהה, לביצוע ניסויים בתרבית תא בודד. כאן, אנו מדווחים על אסטרטגיה מבוססת שבב מיקרופלואידית לבידוד תא בודד ביעילות גבוהה (~77%) ומדגימים את יכולתה לבצע תרבית תא בודד לטווח ארוך (עד 7 ד') וניתוח הטרוגניות תאית באמצעות בדיקה קלונוגנית. יישומים אלה הודגמו עם תאי גזע עצביים של עכבר KT98, ותאי סרטן אנושיים A549 ו-MDA-MB-435. יעילות בידוד גבוהה של תא יחיד ויכולת תרבית לטווח ארוך מושגות על ידי שימוש בגדלים שונים של מיקרו-בארות בחלק העליון והתחתון של התעלה המיקרופלואידית. מערך המיקרובאר הקטן מיועד לבידוד מדויק של תאים בודדים, ומערך המיקרובאר הגדול משמש לתרבית שיבוט של תא בודד בשבב המיקרופלואידי. פלטפורמה מיקרופלואידית זו מהווה גישה אטרקטיבית ליישומי תרבית תאים בודדים, בשל הגמישות שלה של חללי תרבית תאים מתכווננים לאסטרטגיות תרבית שונות, מבלי להפחית את יעילות הבידוד.

פלטפורמת microfluidic לבידוד תא בודד והתרבות כוללת microchannel (200 מיקרומטר גובה) עם שני סטים של מערכי microwell (איור 2 א). שני סטים של מערכים microwell מכונים כמו-גם ללכוד (25 מיקרומטר בקוטר 27 מיקרומטר עומק) ו-גם תרבות (285 מיקרומטר בקוטר 300 מיקרומטר עומק) לבידוד תא בודד והתרבות, בהתאמה, וכל אחד לכידת היטב ממוקם במרכז א-היטב בתרבות כאשר הם מוצגים מתוך-מבט מלמעלה (תרשים 2B). עבור פעולת המכשיר (זרימת המבצע סכמט...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות תאים בודדים עם פלטפורמה מיקרופלואידית, המשתמשת בתפיסת עיצוב מיקרו-באר חדשה כדי לאפשר בידוד תא בודד ביעילות גבוהה ותרבית משובטת לטווח ארוך.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להדגים את הייצור והתפעול של שבב מיקרופלואידי, המאפשר בידוד ותרבית של תאים בודדים ביעילות גבוהה. שיטה זו מספקת כלי שימושי לכל תחום שיוכל להפיק תועלת מבידוד ותרבית של תאים בודדים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היעילות הגבוהה של טעינת תאים בודדים למערכים גדולים של מיקרו-בארות (microwells).בנוסף, להפעלת המכשיר נעשה שימוש בזרימה עדינה ובכוח הכבידה בלבד, דבר הממזער את הנזק לתאים. השמעות של טכניקה זו מופנית לעבר האבחנה הסופית של מחלות אנוש כגון סרטן, שבהן הטרוגניות תאית משפיעה על תגובת התא; הגענו לרעיון פיתוח שיטה זו בעת הקמת שורת תאים במיקרו-בארים, מאחר ששיטת דילול מוגבל (limit dilution method) הייתה גובהה מאוד ואינה יעילה. כעת, שיטה זו יכולה לספק תובנות בניתוח של תאים בודדים.ניתן ליישם זאת גם עבור יישומים אחרים, כגון הקמה ומעקב לאורך זמן אחר מהלך והתנהגגות של תא בודד. ראשית, ייצרו תבניות מאסטר סיליניזציה (silanized master molds) הן עבור שכבת בידוד התא הבודד והן עבור שכבת תרבית המיקרו-בארים, באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. עבור כל תבנית מאסטר, ערבבו 16 גרם של בסיס PDMS עם 1.6 גרם של חומר מעקב (curing agent) בכוס חד-פעמית, וערבבו את התערובות עד לאיחוד.לאחר מכן, הניחו את התבניות הראשיות בתוך צלחות פטרי בנפח 150 מילימטר, ושפ

a-microfluidic-platform-for-high-throughput-single-cell-isolation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בפרוטוקול זה מוצג הייצור, ההתקנה והתפעול הבסיסי של ביו-ריאקטור פיקוליטר מיקרופלואידי (PLBR) לניתוח תאים בודדים של מיקרואורגניזמים פרוקריוטיים. מיקרואורגניזמים רלוונטיים מבחינה תעשייתית נותחו כהוכחה עקרונית המאפשרת תובנות לגבי קצב גדילה, מורפולוגיה והטרוגניות פנוטיפית על פני תקופות זמן מסוימות, בקושי אפשרי בשיטות קונבנציונליות.

ביו-ריאקטור מיקרו-נוזלי פיקוליטר לניתוח מיקרוביאלי של תאים בודדים: ייצור, הגדרת מערכת ותפעול

אנחנו פיתחו תרבות תא אוטומטית וחקירת פלטפורמה לניסויי גירוי תא מיקרו בקנה מידה. הפלטפורמה מציעה שליטה פשוטה, תכליתית, ומדויקת בטיפוח ועידוד אוכלוסיות קטנות של תאים, ומחל lysates לניתוחים מולקולריים. הפלטפורמה מתאימה גם למחקרים המשתמשים בתאים ו / או חומרים כימיים יקרים.

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון.

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבית תאים ראשוניים, מודלים של רקמות וביופסיות ניקוב בשבב מיקרופלואידי מרובה איברים למשך עד 28 ימים. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים אנושיים, אגרגטים בכבד וביופסיות עור שולבו בהצלחה במחזור מדיה משותף.

צ&#39;יפ Multi-האיבר - פלטפורמת Microfluidic לCoculture Multi-רקמה לטווח ארוך

פרוטוקול זה מתאר ארכיטקטורת מערכת לביצוע הפרדות חלקיקים אוטומטיות בנפח קטן (0.15-1.5 מ"ל) באמצעות מכשיר מיקרופלואידי, ודן בשיטות לייעול הביצועים והתפעול של מכשיר אקוסטופלואידי.

פלטפורמת microfluidic לעיבוד מדגם Precision הקטן-נפח ושימוש בו לגודל חלקיקים הביולוגיים נפרדים עם Microdevice אקוסטי

תא בודד רצף חושף הטרוגניות genotypic במערכות ביולוגיות, אך טכנולוגיות הנוכחי חוסר התפוקה הכרחי עבור פרופיל עמוק של הקהילה הרכב ותפקוד. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה microfluidic עבור רצף &gt; הגנום בתא יחיד 50,000 מ מגוונות תא אוכלוסיות.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

דוח זה מתאר שיטה מבוססת שבב מיקרופלואידיג כדי להגדיר ניסוי של תרבות תא בודדת שבה ניתן להשיג שיוך ביעילות גבוהה וניתוח מיקרוסקופי של תאים בודדים מרובים.

הקמת תרבויות בודדות מבוססות-משותפות באופן דטרמיניסטי עם שבב מיקרופלואידיסי

אנו מציגים מערכת מיקרופלואידית למחקרי תפוקה גבוהה על מכונות חיים מורכבות, המורכבת מ-1500 יחידות תרבות, מערך של משאבות פריסטליות משופרות ומודולוס ערבוב באתר. השבב המיקרופלואידי מאפשר ניתוח של התנאים המיקרו-סביבתיים המורכבים והדינמיים ביותר ב-vivo.

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

השבב המיקרופלואידי הקליני הוא טכניקת ניתוח ביו-רפואית חשובה המפשטת עיבוד מקדים של דגימות דם קליניות של מטופלים ומכתימה באופן אימונופלואורסצנטי תאי גידול במחזור הדם (CTCs) באתרם על השבב, ומאפשרת זיהוי וזיהוי מהירים של CTC יחיד.

פלטפורמת שבבים מיקרופלואידית קלינית לבידוד תאי גידול רב-תכליתיים במחזור הדם

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במערכת Omics של תרבית מיקרוליטר טיפה חד-תאית (תא MISS) כדי לבצע בידוד, טיפוח וקטיף חד-שבטי מיקרוביאלי. תא ה-MISS משיג זרימת עבודה משולבת המבוססת על טכנולוגיית מיקרופלואידית טיפות, המציעה פיזור חד-טיפתי מעולה, גידול מקביל גבוה וזיהוי ביומסה בתפוקה גבוהה.

גידול וקטיף חד-שבטי מיקרוביאלי אוטומטי ובתפוקה גבוהה באמצעות מערכת אומיקס תרבית מיקרוליטר-טיפה חד-תאית

תאי גידול במחזור (CTC) הם קריטיים לחקר התקדמות הסרטן והגרורות. מאמר זה מציג פרוטוקול משולב בעל תפוקה גבוהה להעשרת CTC וריצוף CTC יחיד, המשפר את יעילות הלכידה וטוהר ה-CTC תוך הפחתת עלויות הזיהום והריצוף, ובכך מקדם מחקר אונקולוגי מדויק ויישומים קליניים.

טכנולוגיית מיון תאי גידול במחזור וריצוף תאים בודדים מבוססת מיקרופלואידיקה

למדו לבנות ולהפעיל שבב מיקרו-זרימה לבידוד וגידול תאים בודדים ביעילות גבוהה. השיטה מציעה כלי יעיל למחקר סרטן והבנת הטרוגניות תאית.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

גלה סרטונים נוספים