ניתוח מבוסס Cytometry Imaging- והזרימה של עמדת תא ומחזור התא בSpheroids מלנומה 3D
December 28th, 2015
אנו מתארים שתי שיטות משלימות המשתמשות באינדיקטור מחזור התא של הפלואורסצנציה (FUCCI) וניתוח תמונה או ציטומטריית זרימה כדי לזהות ולבודד תאים באזורי העצירה הפנימיים של G1 ובאזורים החיצוניים המתפשטים של ספרואידים תלת מימדיים.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לזהות, לאפיין ולבודד תאים מסטרואידים רב-תאיים ביחס למצב מחזור התא שלהם ומיקומם בתוך הסטרואיד בהשוואה לתרבית תאים דו-ממדית. מודל ה-OID התלת-ממדי מסכם את הביולוגיה של סרטן in vivo כאשר הוא מחקה את ארכיטקטורת הגידול ואת המיקרו-סביבה שלו על ידי זיווג ספרים עם ציטומטריית זרימה וטכניקות הדמיה. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הסרטן, כגון כיצד מיקרו-סביבת הגידול משנה את הרגישות לתרופות, תנועתיות התאים והתפשטותם.
היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה בזמן אמת של מחזור התא והיא מאפשרת טיהור של תאים חיים מאזור סטרואידים ספציפי המדגים שההליך ייעשה חד, עוזר מחקר מהמעבדה שלנו התחל להתכונן להיווצרות סטרואידים תלת מימדית על ידי מיקרוגל 1.5% aros ב-100 מיליליטר של תמיסת מלח איזון של האנק או HBSS או שלוש עד חמש דקות לסירוגין לסובב את הבקבוק כדי להבטיח שה-AROS התמוסס לחלוטין. לאחר מכן מיד פיפטה 100 מיקרוליטר מתמיסת הארוס לכל באר של צלחת תרבית רקמות שטוחה עם תחתית 96. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה כדי לאפשר לארוס להתמצק.
לאחר מכן, הסר תרבית תאי מפגש של 80% של תאי מלנומה המבטאים את מבני ה-FCI מאינקובטור תרבית התאים. שוטפים את התאים עם 10 מיליליטר HBSS. הוסף 1.5 מיליליטר של 0.05% ב-EDTA ולאחר מכן דגר על התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך כשתי דקות.
לאחר שהתאים ניתקו את הרסוס, השעו אותם ב-10 מיליליטר של תרבית תאים. בינוני. ספרו ידנית את התאים באמצעות המו, ציטומטר ומיקרוסקופ הפוך ודללו אותם ל-25,000 תאים למיליליטר במדיום תרבית תאים. לאחר מכן פיפטה 200 מיקרוליטר של מתלה התא כדי לכסות כל באר של צלחת 96 הבארות.
דגרו על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך כשלושה ימים ליצירת ספרואידים של תאים. לאחר תמונת הדגירה הספרואידים במיקרוסקופ הפוך באמצעות מטרת מט"ח ומסנן ניגודיות פאזה. ספרואידים צריכים להופיע כאגרגטים קומפקטיים וכדוריים בערך כדי להכין את סטרואיד התא לחתך והדמיה.
השתמש בפיפטה של מיליליטר אחד כדי להעביר אותם לצינור בז. לאחר מכן אפשר לסטרואידים להתיישב בתחתית החרוט. לאחר מכן, הסר את היניקה הדו-צדדית הבינונית ולאחר מכן תקן את הספרואידים על ידי דגירה שלהם בפורמין ניטרלי של 10% למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן ניתן לאחסן SP ב-HBSS בארבע מעלות צלזיוס למשך מספר ימים לאחר חתך והדמיה של התא. Sphe פתח את תוכנת ניתוח התמונה ובחר את תצורת הכימות בלבד. לאחר מכן צור ספרייה חדשה וייבא את קובץ התמונה הקונפוקלי הספרואיד על ידי גרירת קובץ הנתונים הגולמי לספרייה.
לאחר מכן, עבור ללשונית המדידות כדי לבנות פרוטוקול ניתוח תמונה על ידי גרירה ושחרור של פקודות בסדר הנכון בחלון הפרוטוקול. כדי לחפש אובייקטים בערוץ הירוק, גרור ושחרר את הפקודה חפש אובייקטים ממקטע החיפוש לחלון הפרוטוקול ובחר את הערוץ המתאים. הוסף פקודה פתוחה שנמצאת בעיבוד ולאחר מכן הוסף פקודה נפרדת של נגיעה באובייקטים כדי להפריד בין התאים.
לבסוף, מקטע הסינון, הוסף ואל תכלול אובייקטים לפי גודל. פקודה עבור אובייקטים קטנים מ-50 מיקרומטר כדי לא לכלול עצמים קטנים שאינם תאיים. לאחר מכן, גרור ושחרר פקודת חיפוש אובייקטים חדשה לחלון הפרוטוקול.
בצעו את אותם צעדים, בחרו בערוץ האדום והחילו את כל הפקודות הבאות. לאחר מציאת אובייקטים, השתמש בפקודות הסתר ערוץ או הצג ערוץ כדי לוודא חזותית שאובייקטים אדומים וירוקים תואמים לגרעינים אדומים וירוקים. במידת הצורך, לחץ על אפשרויות מדידות ולאחר מכן משוב כדי לשנות את המראה של מסיכות האובייקט.
כעת כדי למצוא אובייקטים צהובים התואמים לתאי שלב S מוקדמים, השתמש בפקודת ההצטלבות שנמצאת בקטע השילוב ובחר הצטלבות אובייקטים אדומים עם אובייקטים ירוקים. שוב, אל תכלול אובייקטים לפי גודל של פחות מ-50 מיקרומטר. לזיהוי תאי G חד-פאזיים, השתמשו בפקודה 'חיסור' שנמצאת באזור השילוב ובחרו 'הפחת עצם צהוב מעצמים אדומים' כדי למצוא עצמים אדומים בלבד.
באופן דומה, הפחיתו אובייקטים צהובים מעצמים ירוקים על מנת לזהות אך ורק עצמים ירוקים הקשורים לתאי פאזה SG two ו-MPH הן עבור האובייקטים האדומים והן הירוקים בלבד. הסר אובייקטים שאינם תאיים לפי הצורך על-ידי החלת פקודת אוכלוסיית מסנן ממקטע הסינון עם גורם צורה גדול מ- 0.25. לאחר מכן מצא את מתאר הכדור S.
שימוש בפקודה 'חפש אובייקטים' מאזור החיפוש בערוץ הירוק או האדום. השתמש בפקודה סגורה ממקטע העיבוד כדי לצרף את התאים הבודדים לאובייקט אחד. לאחר מכן הוסיפו פקודת מילוי חורים בעצמים למילוי חורים בכדור.
לאחר מכן, השתמש במסנן עדין כדי להסיר רעש מאובייקט Sphero. סיים למצוא את קווי המתאר הספרואידים על-ידי בחירה באפשרות אל תכלול אובייקטים לפי גודל כדי להסיר אובייקטים קטנים מ- 30, 000 מיקרומטר. לאחר הגדרת כל האובייקטים, הוסף מרחקי מדידה מהקטע הקשור כדי לקבוע את המרחק מכל OID לקצה מתאר הכדור S.
עשו זאת בכל אחת מהאוכלוסיות הצהובות, האדומות והירוקות בלבד. כדי להמחיש את המרחקים המינימליים מהתא לקצה הספרואיד הקרוב ביותר של S, פתח את הכרטיסייה מדידות ובחר אפשרויות משוב ואחריו קשרים. לאחר מכן בחר הצג מרחקים.
לבסוף, שמור את הפרוטוקול כדי לשמור נתונים שנוצרו על-ידי הפרוטוקול. בחר את פריט המדידה מקטע המדידה. לאחר מכן כדי לפרש את הנתונים, בחר את פריט המדידה, עבור ללשונית הניתוח בקטע המדידה ובחר נתח תחת תפריט הניתוח כדי לספור את התאים שנמצאו במרחק מסוים מקצה הסטרואידים.
צור מסנן על-ידי בחירת מסנן מכרטיסיית הניתוח. לדוגמה, הצג רק נתונים שבהם המרחק מקצה הכדור קטן מ- 100 מיקרון. כדי לייצא את הנתונים הגולמיים, בחר ייצוא מכרטיסיית הקובץ ולאחר מכן שמור את הנתונים כטקסט מופרד באמצעות פסיקים או כטקסט מוגבל באמצעות טאבים.
ניתן לפתוח נתונים אלה בתוכנת גיליון אלקטרוני להמשך ניתוח. כדור תא שנוצר מ-C 8 1 16 1. תאי מלנומה אנושיים שהומרו במערכת פוג'י תוקנו וחתכו.
בוצעה הדמיה קונפוקלית עבור AZA ירוק, המסמנת תאים בשלב SG 2M של מחזור התא וכתום ברה, המסמן תאים בשלב G אחד. כאשר תמונות אלה מכסות, ניתן לצפות בתכונות מפתח כגון ליבה נמקית כצפוי. תאי G אחד אדומים שנעצרו שולטים קרוב יותר לליבה הנמקית הזו בעוד שתאים אדומים וירוקים מתרבים גדלים בצורה שיפועית לכיוון הקצה החיצוני של הסטרואיד או הגישה לחמצן וחומרים מזינים היא הגדולה ביותר.
לאחר ניתוח תמונה אוטומטי למחצה, ניתן להגדיר את מסכות תאי הפוצ'י ואת קווי המתאר של S spheroid. תוכנת הדמיה שימשה לכימות תאים אדומים וירוקים באזור הפנימי או החיצוני של הספרואיד S. ניתוח זה הראה כי תאי מעצר שלב G אחד מועשרים באזור הפנימי בעוד שתאים מתרבים שולטים קרוב יותר לקצה הסטרואידים.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבוע עד שבועיים, מסגרת זמן הכוללת גידול סטרואידים, הדמיה וניתוח. לאחר הליך זה ניתן להשתיל ראדים במטריצת קולגן ולאחר מכן לדמות באמצעות מיקרוסקופ TimeLapse. לאחר מכן הם יכולים להיות נתונים לניתוח חלבון או RNA, וזה יכול לעזור לנו לענות על שאלות כמו האם מיקום בסטרואידים וגישה לחמצן וחומרים מזינים יכולים לשנות פנוטיפים של תאים סרטניים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג שתי שיטות משלימות המשתמשות במחוון מחזור התא של פלואורוסנטיות ושייכות לאוביקוויטין (FUCCI) לצד ניתוח תמונה וציטומטריה של זרימה. טכניקות אלו נועדו לזהות ולבודד תאים בהתבסס על מצב מחזור התא שלהם בתוך ספירואידים תלת-ממדיים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאים
- מחקר סרטן
- תרבית תאים תלת-ממדית
רקע
- ספירואידים תלת-ממדיים מחקים את הארכיטקטורה והסביבה המיקרו-סביבתית של הגידול.
- הבנת מצב מחזור התא חיונית למחקר סרטן.
- תרביות דו-ממדיות מסורתיות אינן מייצגות במדויק את התנאים in vivo.
- טכניקות צילום וציטוטמטריה משפרות את יכולות הניתוח.
מטרת המחקר
- לזהות ולאפיין תאים בשלבי מחזור תא שונים.
- לבודד אוכלוסיות תאים ספציפיות מספירואידים תלת-ממדיים.
- לחקור את ההשפעה של הסביבה המיקרו-סביבתית של הגידול על התנהגות התאים.
שיטות ששימשו
- מחוון מחזור תא של פלואורוסנטיות ושייכות לאוביקוויטין (FUCCI) לצורך הדמיה.
- ניתוח תמונה להערכת מצב מחזור התא.
- ציטוטמטריה של זרימה לצורך בידוד תאים.
- הכנת ספירואידים תלת-ממדיים באמצעות ארוז בצלחות תרבית רקמות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של תאים עם G1 פנימי עצור ותאים מתרבים חיצוניים.
- הדמיה בזמן אמת של הדינמיקה של מחזור התא הושגה.
- הוכחה בידוד של תאים חיים מאזורים ספציפיים של הספירואידים.
- תובנות לגבי האופן שבו הסביבה המיקרו-סביבתית של הגידול משפיעה על רגישות לתרופות והתרבות.
מסקנות
- השיטות מספקות גישה חזקה ללימוד ביולוגיה של סרטן.
- ניתוח בזמן אמת משפר את ההבנה של התנהגות התאים במודלים תלת-ממדיים.
- טכניקות אלו יכולות לסייע באסטרטגיות טיפוליות בטיפול בסרטן.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding spatial heterogeneity in tumor spheroids enables mechanistic de-risking of target validation by linking cell cycle status to microenvironmental cues. This approach supports predictive confidence in preclinical models by quantifying proliferation gradients and quiescent niches relevant to drug penetration and resistance. It informs portfolio triage by identifying subpopulations most likely to drive recurrence or therapeutic escape.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping G1 arrest and proliferation to spheroid regions, clarifying pathway dependencies in hypoxic versus nutrient-rich zones.
- Operational Value: Enables isolation of live cells from defined zones for downstream functional assays, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with quantifiable cell cycle readouts for compound screening, ensuring assay relevance to 3D architecture.
- Operational Value: Standardizes spatial and phenotypic outputs via image analysis, improving reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling necrosis, quiescence, and proliferation gradients observed in vivo.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking position-dependent phenotypes to microenvironmental stressors.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of microenvironmental effects on cell cycle, proceeds to screening via standardized spheroid-based assays, and supports translational research through spatially resolved biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by correlating cell position with cell cycle phases to clarify drug response mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through quantifiable red/green cell ratios in inner/outer spheroid regions, enabling compound effect tracking.
- Analytics: Provides distance-from-edge measurements and phase-specific masks as quantitative outputs for comparing conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling oxygen/nutrient gradients that influence cancer cell phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal tracking of cell viability, gene expression, or drug response across multiple spheroid generations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through spatial resolution of proliferation and quiescence, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Standardization and scalability via semi-automated image analysis and flow cytometry isolation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by de-risking targets based on microenvironmental responsiveness.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds that penetrate quiescent niches or target cycling cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in FUCCI transduction, spheroid culture, and confocal imaging.
- Dependent on fluorescence microscopy and image analysis software capable of channel segmentation and morphometric filtering.
- Necessitates standardization across cell lines and matrix conditions for reproducible spheroid formation.
- Involves adaptation considerations when applying to non-melanoma or stromal co-culture systems.
- Limited by sectioning depth and signal penetration in larger spheroids, affecting core region resolution.
