ניתוח מבוסס Cytometry Imaging- והזרימה של עמדת תא ומחזור התא בSpheroids מלנומה 3D
28 בדצמבר 2015
אנו מתארים שתי שיטות משלימות המשתמשות באינדיקטור מחזור התא של הפלואורסצנציה (FUCCI) וניתוח תמונה או ציטומטריית זרימה כדי לזהות ולבודד תאים באזורי העצירה הפנימיים של G1 ובאזורים החיצוניים המתפשטים של ספרואידים תלת מימדיים.
המטרה הכללית של שיטה זו היא לזהות, לאפיין ולבודד תאים מתוך ספרואיד רב-תאי ביחס למצב מחזור התאים שלהם ולמיקומם בתוך הספרואיד בהשוואה לתרבית תאים דו-ממדית (2D). מודל ה-OID התלת-ממדי משחזר את הביולוגיה של הסרטן in vivo, שכן הוא מחקה את ארכיטקטורת הגידול ואת מיקרו-הסביבה שלו. באמצעות שילוב של ספרואידים עם ציטומטריית זרימה וטכניקות דימוג, שיטה זו יכולה להשיב על שאלות מפתח בתחום הסרטן, כגון כיצד מיקרו-הסביבה של הגידול משפיעה על רגישות לתרופות, ניידות תאים ופרוליפרציה.
היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של מחזור התא ומאפשרת ניקוי של תאים חיים משלב סטרואידי ספציפי. להלן הדגמה של הפרוצדורה. עוזר מחקר מהמעבדה שלנו יתחיל בהכנה ליצירת סטרואידים תלת-ממדיים על ידי חימום במיקרוגל של 1.5% agarose ב-100 milliliters של תמיסת מלחים מאוזנת של הנקס (HBSS) למשך שלוש עד חמש דקות, תוך כדי סחרור לסירוגין של הבקבוק כדי להבטיח שה-agarose נמסה לחלוטין. לאחר מכן, העבירו באופן מיידי באמצעות פיפט 100 µL של תמיסת ה-agarose לכל באר בלוח תרביות רקמה בעל 96 באערים עם תחתית שטוחה. דגרו את הלוח בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כדי לאפשר ל-agarose להתמצק.
בשלב הבא, הוצא מהדגרה של תרבית תאי מלנומה המבטאים את מבני ה-FCI בהספיקות (confluence) של 80%. שטוף את התאים עם 10 milliliters של HBSS. הוסף 1.5 milliliters של 0.05% EDTA ולאחר מכן הדגר את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך כשתי דקות.
לאחר שהתאים התנתקו, השעו אותם ב-10 milliliters של מצע גידול תאים. ספרו את התאים באופן ידני באמצעות המוציטומטר ומיקרוסקופ הפוך, ודללו אותם ל-25,000 תאים למיליליטר במצע גידול תאים. לאחר מכן, טפטפו באמצעות פיפט 200 microliters מת suspension התאים כדי לכסות כל באר בלוח 96 באר.
דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך כ שלושה ימים ליצירת ספרואידים של תאים. לאחר הדגירה, צלמו את הספרואידים במיקרוסקופ הפוך באמצעות עדשת Forex ומסנן ניגודיות פאזה (phase contrast). הספרואידים אמורים להיראות כצבירי תאים דחוסים וכמעט כדוריים, כדי להכין את הספרואידים של התאים לחיתוך ולדימיג.
השתמשו בפיפט של 1 mL כדי להעביר אותם למבחנה מסוג falcon. לאחר מכן, המתינו עד שהסטרואידים ישקעו בתחתית המבחנה הקונית. בשלב הבא, הסירו את המצע באמצעות שאיבה, וקבעו את הספרואידים על ידי הדגרה בפורמלין בבופר ניטרלי בריכוז 10% למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר.
ניתן לשמור את ה-SP ב-HBSS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך מספר ימים לאחר חיתוך התאים ודימויים שלהם. פתח את תוכנת ניתוח התמונות ובחר בתצורה של כימות בלבד. לאחר מכן, צור ספרייה חדשה וייבא את קובץ תמונת הקונפוקל של הספרואיד על ידי גרירת קובץ הנתונים הגולמי אל הספרייה.
בשלב הבא, עברו ללשונית המדידות (measurements) כדי לבנות פרוטוקול לניתוח תמונות על ידי גרירה והשמטה של פקודות בסדר הנכון לחלון הפרוטוקול. כדי למצוא אובייקטים בערוץ הירוק, גררו והשמיטו את פקודת מציאת אובייקטים (find objects) מסעיף המציאה (finding) אל חלון הפרוטוקול ובחרו בערוץ המתאים. הוסיפו פקודת פתיחה (open) הנמצאת תחת עיבוד (processing), ולאחר מכן הוסיפו פקודה נפרדת להפרדת אובייקטים נוגעים (touching objects) כדי להפריד בין התאים.
לבסוף, מחלקת הסינון, הוסף והחרג עצמים לפי גודל. פקודה עבור עצמים הקטנים מ-50 micrometers כדי להחריג עצמים לא תאיים קטנים. לאחר מכן, גרור והנח פקודת find objects חדשה לחלון הפרוטוקול.
בצעו את אותם השלבים, בחרו בערוץ האדום והשלימו את כל הפקודות הבאות. לאחר מציאת האובייקטים, השתמשו בפקודות hide channel או show channel כדי לוודא חזותית שאובייקטים אדומים וירוקים תואמים לגרעינים אדומים וירוקים. במידת הצורך, לחצו על measurements ולאחר מכן על feedback options כדי לשנות את מראה מסכות האובייקטים.
כעת, כדי למצוא אובייקטים צהובים המתאימים לתאים בשלב S המוקדם, השתמשו בפקודת intersect הנמצאת במדור ה-combining ובחרו ב-intersect red objects with green objects. שוב, הסירו אובייקטים שגודלם קטן מ-50 micrometers. כדי לזהות תאים בשלב G1, השתמשו בפקודת subtract הנמצאת במדור ה-combining ובחרו ב-subtract yellow object from red objects כדי למצוא אובייקטים אדומים בלבד.
באופן דומה, החסירו את האובייקטים הצהובים מהאובייקטים הירוקים כדי לזהות באופן בלעדי אובייקטים ירוקים המתואמים ל-SG two ולתאי שלב MPH, עבור האובייקטים האדומים הבלעדיים והירוקים הבלעדיים כאחד. הסירו אובייקטים שאינם תאים לפי הצורך על ידי הפעלת פקודת אוכלוסיית סינון (filter population) מחלק הסינון עם מקדם צורה (shape factor) הגבוה מ-0.25. לאחר מכן, מצאו את מתאר הספרואיד S.
השתמש בפקודת find objects (מציאת אובייקטים) מסעיף ה-finding (מציאה), באחד מהערוצים, הירוק או האדום. השתמש בפקודת closed מסעיף ה-processing (עיבוד) כדי לאחד את התאים הבודדים לאובייקט אחד. לאחר מכן, הוסף פקודת fill holes in objects (מילוי חורים באובייקטים) כדי למלא חורים בספירות.
בשלב הבא, השתמשו במסנן עדין כדי להסיר רעשים מאובייקט ה-Sphero. השלימו את מציאת קווי המתאר של הספרואיד על ידי בחירה באפשרות "החרגת אובייקטים לפי גודל" כדי להסיר אובייקטים הקטנים מ-30,000 micrometers. לאחר הגדרת כל האובייקטים, הוסיפו את הפעולה "מדידת מרחקים" מהסעיף הרלוונטי כדי לקבוע את המרחק מכל OID לקצה קווי המתאר של ה-S spheroid.
בצעו זאת בכל אחת מהאוכלוסיות הצהובות, האדומות בלבד והירוקות בלבד. כדי להציג את המרחקים המינימליים מהתא לקצה הקרוב ביותר של הספרואיד S, פתחו את לשונית המדידות (measurements) ובחרו באפשרויות משוב (feedback options) ולאחר מכן ביחסים (relationships). לאחר מכן בחרו בהצגת מרחקים (show distances).
לבסוף, שמרו את הפרוטוקול כדי לשמור את הנתונים שנוצרו על ידיו. בחרו בפריט make measurement מסעיף המדידה (measurement). לאחר מכן, כדי לפרש את הנתונים, בחרו את פריט המדידה, עברו ללשונית הניתוח (analysis) בסעיף המדידה ובחרו ב-Analyze תחת תפריט הניתוח כדי לספור את התאים שנמצאו במרחק מסוים מקצה הסטרואיד.
צרו מסנן על ידי בחירה ב-filter (מסנן) בלשונית הניתוח (analysis). לדוגמה, הציגו רק נתונים שבהם המרחק מקצה הספירה הוא פחות מ-100 microns. כדי לייצא את הנתונים הגולמיים, בחרו ב-export (ייצוא) בלשונית הקובץ (file) ולאחר מכן שמרו את הנתונים כטקסט מופרד בפסיקים או בטאבים.
ניתן לפתוח נתונים אלו בתוכנת גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף. ספרואידים של תאים שהופקו מ-C 8 1 16 1. תאי מלנומה אנושיים שעברו טרנסדוקציה באמצעות מערכת Fuji קובעו ונחתכו לשכבות.
בוצע דימיון קונפוקאלי עבור AZA green, המסמן תאים בשלב M2 של מחזור התא, ו-Berra orange, המסמן תאים בשלב G1. כאשר תמונות אלו מונחות זו על זו, ניתן להבחין במאפיינים מרכזיים כגון גרעין נמק, כפי שניתן היה לצפות. תאי G1 עצורים בצבע אדום שולטים בקרבת גרעין נמק זה, בעוד שתאים מתחלקים בצבעי אדום וירוק עולים באופן מדורג לכיוון הקצה החיצוני של הסטרואיד, שם הגישה לחמצן ולחומרי הזנה היא המקסימלית.
בעקבות ניתוח תמונות חצי-אוטומטי, ניתן להגדיר את מסכות התאים של fucci ואת מתאר ה-S spheroid. תוכנת דימוג שימשה לכימות תאים אדומים וירוקים באזור הפנימי או החיצוני של ה-S spheroid. ניתוח זה הראה כי תאים המעוכבים בשלב G1 מרובים באזור הפנימי, בעוד שתאים מתחלקים שולטים יותר קרוב לשולי ה-steroid.
לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להבצע אותה תוך שבוע עד שבועיים, מסגרת זמן הכוללת את גידול הסרטון (organoid), את הדימות ואת הניתוח. בעקבות הליך זה, ניתן להשתיל את הסרטונים במטריצת קולגן ולאחר מכן לדמות אותם באמצעות מיקרוסקופיה בשיטת TimeLapse. לאחר מכן ניתן להעביراًם לניתוח חלבונים או RNA, דבר שיכול לסייע במתן תשובות לשאלות כגון האם המיקום בתוך הסרטון והגישה לחמצן וליטריות יכולות לשנות את הפנוטיפים של תאי הסרטן.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שתי שיטות משלימות המשתמשות במדד מחזור התא הפלואורסצנטי לעובקיטינציה (FUCCI) לצד ניתוח תמונות וציטומטריית זרימה. טכניקות אלו נועדו לזהות ולבודד תאים על בסיס מצב מחזור התא שלהם בתוך ספרואידים תלת-ממדיים (3D spheroids).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מחקר סרטן
- תרבית תאים בתלת-ממד
רקע
- ספרואידים בתלת-ממד מדמים את ארכיטקטורת הגידול ואת הסביבה המיקרוסקופית שלו.
- הבנת מצב מחזור התא היא קריטית למחקר סרטן.
- תרביות דו-ממדיות מסורתיות אינן מייצגות במדויק תנאים in vivo.
- ציטומטריה של זרימה וטכניקות דימוג משפרות את יכולות הניתוח.
מטרת המחקר
- לזיהוי ואפיון של תאים בשלבים שונים של מחזור התא.
- לבידוד אוכלוסיות תאים ספציפיות מספרואידים תלת-ממדיים (3D).
- לבחינת השפעת הסביבה המיקרוסקופית של הגידול על התנהגות התאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מדד מחזור תאים פלואורסצנטי לעיקביטיניציה (FUCCI) לצורך ויזואליזציה.
- ניתוח תמונות להערכת מצב מחזור התאים.
- ציטומטריה זרימה לבידוד תאים.
- הכנת ספרואידים בתלת-ממד באמצעות מערכות סיבוב (aros) בצלחות לתרבית רקמה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של תאי פנימיים העצורים בשלב G1 ותאים חיצוניים בשלב proliferated.
- השגת ויזואליזציה בזמן אמת של דינמיקת מחזור התא.
- הדגמת בידוד של תאים חיים מאזורים ספציפיים של ספרואידים.
- תובנות לגבי האופן שבו מיקרו-סביבת הגידול משפיעה על רגישות לתרופות ועל proliferated.
מסקנות
- השיטות מספקות גישה חסונה לחקר הביולוגיה של הסרטן.
- ניתוח בזמן אמת משפר את ההבנה של התנהגות תאים במודלים בתלת-ממד.
- טכניקות אלו יכולות להנחות אסטרטגיות טיפוליות בטיפול בסרטן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנה של ההומוגניות המרחבית בספרואידים של גידולים מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של תיקוף מטרות, על ידי קישור מצב מחזור התא לרמזים מהסביבה המיקרוסקופית. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי במודלים פרה-קליניים באמצעות כימות של מדרגי פרוליפרציה ונישות שקטות (quiescent niches) הרלוונטיות לחדירת תרופות ולהתנגדות לטיפול. היא מסייעת במיון הפורטפוליו על ידי זיהוי תתי-אוכלוסיות בעלות הסבירות הגבוהה ביותר להוביל לחזרה של המחלה או לבריחה תרפיתית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות מיפוי של מעצר בשלב G1 ושל פרוליפרציה באזורי הספרואיד, ובכך מבהיר תלויות של מסלולים באזורים היפוקסיים לעומת אזורים עשירים בחומרי הזנה.
- ערך תפעולי: מאפשר בידוד של תאים חיים מאזורים מוגדרים לצורך בדיקות תפקודיות המשך, ובכך מפחית עמימות מכניסטית במחקרי מעורבות של מטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות מתיקים עם מדדי מחזור תא כמותיים לסריקת תרכובות, להבטחת רלוונטיות של הבדיקה למבנה תלת-ממדי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פלטים מרחביים ופנוטיפיים באמצעות ניתוח תמונות, לשיפור השחזוריות לאורך קמפיינים של סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם למערכות הרלוונטיות למחלה על ידי מידול של מדרגי נמק, שקיטות ושגשוג הנצפים in vivo.
- ערך תפעולי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי קישור פנוטיפים תלויי-מיקום לגורמי עקה של המיקרו-סביבה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בביולוגיה של גילוי על ידי מתן אפשרות לבדיקת השערות לגבי השפעות של מיקרו-סביבה על מחזור התא, ממשיכה לסריקה באמצעות בדיקות סטנדרטיות המבוססות על ספרואידים, ותומכת במחקר תרגומי באמצעות יישור סממנים ביולוגיים עם רזולוציה מרחבית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי קורלציה בין מיקום התא לשלבי מחזור התא, כדי להבהיר את מנגנוני התגובה לתרופות.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות יחסים כמותיים של תאים אדומים/ירוקים באזורים הפנימיים והחיצוניים של הספרואיד, מה שמאפשר מעקב אחר השפעת תרכובים.
- אנליטיקה: מספק מדידות של המרחק מהקצה ומסכות ספציפיות לשלב מחזור התא כפלט כמותי להשוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי מידול מדרגי חמצן/חומרי תזונה המשפיעים על פנוטיפים של תאי סרטן.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר עבור מעקב אורך של חיוניות תאים, ביטוי גנים או תגובה לתרופות על פני מספר דורות של ספרואידים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבויי באמצעות רזולוציה מרחבית של שגשוג ושקיטות, המפחיתה תוצאות חיוביות שגויות בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת הרחבה באמצעות ניתוח תמונות חצי-אוטומטי ובידוד באמצעות ציטומטריה של זרימה.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך פיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת סיכונים במטרות בהתבסס על תגובתיות לסביבה המיקרוסקופית.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם-סיכון של תרכובות חודרות נישות שקטות או כאלה המכוונות לתאים במחזור.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטרנסדוקציית FUCCI, תרביות ספרואידים ודימוג קונפוקאלי.
- תלוי במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובתוכנה לניתוח תמונות המסוגלת לביצוע סגמנטציה של ערוצים וסינון מורפומטרי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין קווי תאים ותנאי מטריקס להשגת יצירת ספרואידים הדירה.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום על מערכות של תרביות משולבות (co-culture) של סטרומה או תאים שאינם מלנומה.
- מוגבל על ידי עומק החיתוך וחדירות האות בספרואידים גדולים יותר, דבר המשפיע על הרזולוציה של אזור הליבה.
![כמותי [18F]-NAF-PET-MRI ניתוח להערכת מחזור עצם דינמי במטופל עם Facetogenic כאבי גב תחתון](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F58491.jpg%3Fv%3D2026-07-04T05%253A56%253A06.000Z&w=384&q=75)