קומפלקס polyelectrolyte למשלוח גורם הגדילה osteogenic דומיין כריכה הפרין

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר מעטפת קומפלקס פוליאלקטרוליטים. נשא שיכול ללכוד ולווסת את השחרור של מגוון רחב של גורמי גדילה עם תחום קשירת הפרין. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הנדסת רקמות אורטופדית ללכידה יעילה ואספקה של גורמי גדילה ייעודיים.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא אינה דורשת שימוש בחומרים אורגניים לעתים קרובות. מה שידוע כמשפיע על הפעילות הביולוגית של גורמי גדילה. ממיסים 200 מיליגרם של נתרן אלגינט שאינו מוקרן או 400 מיליגרם של נתרן אלגינט מוקרן שמונה מגה-ראד ב-10 מיליליטר מים מזוקקים כפולים.

ולנער במשך שעה. אחסנו את תמיסת האלגינט בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. סנן את תמיסת האלגינט עם מסנן מזרק סטרילי של 0.2 מיקרון לפני ייצור מיקרו-חרוזי אלגינט.

חיטוי מחולל ה-BE האלקטרוסטטי ומשאבת המזרק עם אתנול 70% והנח אותם בארון בטיחות ביולוגי מסוג שתיים. לאחר מכן הנח כיור זכוכית עם מוט ערבוב מגנטי בתוך מחולל ה- BE. הגדר את אלקטרודת הזרוע של מחולל ה- BE תשעה סנטימטרים מעל האגן.

חבר את כבל האלקטרודה של מחולל ה-BE לבורג הנוירולוגי שניים של אלקטרודת הזרוע. ושופכים 80 מיליליטר תמיסת סטרונציום כלוריד לאגן. לאחר מכן, טען חמישה מיליליטר של תמיסת אלגינט מסוננת 0.2 מיקרון למזרק בצינור גומי.

לאחר חיבור צינור הגומי לאלקטרודת הזרוע, הפעל את משאבת המזרק בחמישה מיליליטר לשעה. במשך שתי דקות. כדי להוציא את האוויר בתוך הצינור ולהעביר את תמיסת האלגינט לקצה הזרבובית.

לאחר מכן, כבה את משאבת המזרק. כדי להתחיל בייצור מיקרו-חרוזים, הגדר את האנקפסולטור ל-5.8 קילו-וולט. ואחריו משאבת המזרק בקצב זרימת אלגינט של חמישה מיליליטר לשעה.

השליכו את המיקרו-חרוזים שנוצרו במהלך שתי הדקות הראשונות מכיוון שהמיקרו-חרוזים האלה נוטים להיות בגודל ובצורה לא סדירים. אסוף מיקרו-חרוזים עוקבים בתמיסת סטרונציום כלוריד 0.2 טוחנת. כבה את משאבת המזרק ואחריה את המעטפת.

לאחר שאיבת הנפח המתוכנן מראש של תמיסת אלגינט. חזור על כך עבור קבוצות הבאות של ייצור מיקרו-חרוזים. אחסן את המיקרו-חרוזים ב-20 מיליליטר של תמיסת סטרונציום כלוריד 0.2 טוחנת בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להשלים קישור צולב ולייצב את הג'ל.

אוספים 0.5 מיליליטר מיקרו-חרוזי אלגינט בעזרת פיפטה מפלסטיק. והניחו אותו על מגלשת זכוכית. צפו במיקרו-חרוזים תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה של פי 10.

צלם 10 תמונות של המיקרו-חרוזים עם מצלמת מיקרוסקופ CCD. שמור את התמונות עם סרגל קנה מידה של 500 מיקרון בפורמט TIFF ברזולוציה של 2048 על 1536. בעזרת כלי האורך בתמונה J, מדוד את גודל המיקרו-חרוזים.

וסרגל קנה המידה. לאחר מכן המר את אורך המיקרו-חרוז מפיקסלים למיקרומטרים. לחץ על כלי הקו וצייר קו על פני אמצע חרוז האלגינט.

לחץ על נתח בשורת התפריטים ובחר מדידה. יופיע חלון מוקפץ. חזור על שלבים אלה כדי למדוד את כל חרוזי האלגינט בתמונה.

מדוד את סרגל קנה המידה בתמונה. אוספים את המיקרו-חרוזים באמצעות מסננת ניילון 100 מיקרון. ושוטפים את החרוזים במים מזוקקים כפולים.

בעזרת מרית, העבירו את כל המיקרו-חרוזים העשויים מ-0.1 מיליליטר מתמיסת האלגינט לצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר וכסו בגזה כדי למנוע ייבוש. לבסוף, יש לעקר את המיקרו-חרוזים על ידי חיתוך אוטומטי במצב נוזלי או בהתאם למפרט היצרן. הוסף 1.5 ליטר מים מזוקקים לתא כדי למנוע התייבשות חרוזים.

בתוך מכסה המנוע BSL2, דגרו את המיקרו-חרוזים הסטריליים עם מיליליטר אחד של שני מיליגרם מעוקרים לתמיסת פרוטמין מיליליטר למשך שעה בטמפרטורת החדר. שטפו את המיקרו-חרוזים המצופים בפרוטמין פעמיים במים מזוקקים כפולים. לאחר מכן סובב כלפי מטה, באמצעות צנטריפוגה ספסל ב -200 פעמים G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הצנטריפוגה יש לשאוב את המים באמצעות מזרק. דגרו מיקרו-חרוזים מצופים פרוטמין עם מיליליטר אחד של תמיסת הפרין מעוקרת של 0.5 מיליגרם למיליליטר למשך 30 דקות. זה יוצר מעטפת קומפלקס פוליאלקטרוליטים עם זיקה נלהבת לגורמי גדילה קושרים להפרין.

לאחר הדגירה יש לשאוב את הפרין באמצעות מזרק. ושטפו את הפרין הלא קשור ממתחמי הפוליאלקטרוליטים על ידי שטיפה פעמיים במים מזוקקים כפולים. טען 13.3 מיקרוליטר של 1.5 מיליגרם למיליליטר עצם חלבון מורפוגנטי 2 או תמיסה דמוית NELL מולקולה 1 על 100 מיקרוגרם של קומפלקס הפוליאלקטרוליטים.

דגרו את קומפלקס הפוליאלקטרוליטים בארבע מעלות צלזיוס מתחת ל -30 סל"ד, תוך נענוע במשך 10 שעות. לאחר מכן, טבלו את המיקרו-חרוזים במיליליטר אחד של מי מלח חוצצים פוספט, או PBS, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור מתמיד. אסוף מיליליטר אחד של הסופרנטנט והחלף אותו מיליליטר אחד של PBS לאחר יום, שלושה, שישה, 10 ו -14 ימים.

הערך את יעילות הספיגה והשחרור של NELL כמו מולקולה אחת באמצעות שיטת בדיקת חלבון CBQCA על פי פרוטוקול היצרן. לחלופין, בצעו אליסה. הפעילות הביולוגית של מולקולה דמוית NELL המשתחררת מקומפלקס הפוליאלקטרוליטים מוערכת על ידי מדידת יכולתה להגביר את הביטוי של פוספטאז אלקליין בתאי גזע של מח עצם ארנב.

זרע 20,000 תאי גזע של מח עצם ארנב לבאר בצלחת של 24 בארות. ואפשרו להם לגדול ליום אחד עם מיליליטר אחד של מדיום הנשר המותאם של דולבקו בתוספת 10% סרום בקר עוברי ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. לאחר 24 שעות, החלף את המדיום במיליליטר אחד של מדיום אוסטאוגני למשך שבעה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

ו-5% CO2. הניחו 300 מיקרוגרם של קומפלקס פוליאלקטרוליט וקומפלקס פוליאלקטרוליט NELL כמו מולקולה אחת בתוך תוספות תרבית תאים כדי לשמור על הקומפלקסים נפרדים מהתאים. הנח את התוספת לצלחת 24 הבארות כדי למנוע שטיפה של מיקרו-חרוזים מורכבים מפוליאלקטרוליטים במהלך החלפת המדיום האוסטיאוגני.

אחת לשלושה ימים, שאפו מיליליטר אחד מהמדיום האוסטיאוגני על ידי הנחת מחט מחוץ לתוספת. והחלף במיליליטר אחד של מדיום אוסטאוגני טרי. לאחר שבעה ו-14 ימים של דגירה, קבע את פעילות הפוספטאז האלקליין עם ערכת בדיקת פוספטאז אלקליין.

בהתאם לפרוטוקול יצרן הערכה. ארוז את קומפלקסי הפוליאלקטרוליטים לתוך הנקבוביות של פיגום פוליקפרולקטון טרי סידן פוספט הניתן לספיגה רפואית. באמצעות מרית מעוקרת בתוך תא BSL2.

הוסף תמיסה של 1.5 מיליגרם או מיליליטר של חלבון מורפוגנטי עצם שתיים או מולקולה דמוית NELL אחת על הפיגום העמוס בקומפלקס פוליאלקטרוליטים. ולדגור למשך הלילה בחום של 4 מעלות צלזיוס. מיקרו-חרוזי אלגינט נבדקים תחת מיקרוסקופ כדי לעקוב אחר גודלם ומורפולוגיה.

מיקרו-חרוזי אלגינט שאינם מוקרנים הם כדוריים והמקביל המוקרן הוא בצורת דמעה. התפלגות הגודל היא גורם חשוב בקליטת גורם הגדילה. והקטנת הגודל מגדילה את יחס פני השטח לשטח.

כאשר מודדים מיקרו-חרוזי אלגינט עם תוכנת תמונה J, ממוצע של 100 מיקרו-חרוזים מספק הערכה טובה של התפלגות הגודל בכל התאמה של מיקרו-חרוזים. מכיוון שקליטת גורם הגדילה תלויה בטכניקת ציפוי נכונה, עובי השכבה של כל ציפוי נצפה על ידי מיקרוסופיה קונפוקלית. כאן, מוצגות תמונות מיקרוסופיות סריקת לייזר קונפוקליות של מיקרו-חרוזי אלגינט המודגרים עם אנלוגים פלואורסצנטיים של פרוטמין, הפרין, מולקולה דמוית NELL אחת וחלבון מורפוגנטי עצם שני.

פעילות פוספטאז אלקליין משמשת למדידת פעילות ביולוגית של גורם גדילה משוחרר. עלייה של פי 2.2 בפעילות הפוספטאז האלקליין נצפתה לאחר הדגירה עם מולקולה דמוית NELL קומפלקס פוליאלקטרוליט ביום 14. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שריכוזי האלגינט משפיעים על יציבות המיקרו-חרוזים. עבור אלגינטים מוקרנים, נדרשנו ארבעה אחוזי דרך. עבור עמיתים שאינם מוקרנים, דרשנו שני אחוזים כיווניים.

בעקבות הליכים אלה, אנו יכולים להגדיל עוד יותר את העמסת גורם הגדילה על ידי ציפוי רב שכבתי. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום הנדסת הרקמות לחקור את העברת גורמי הגדילה במודלים אחרים של מחלות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה יכול לייצר קומפלקס פוליאלקטרוליטים עם חלוקת גודל צרה.