אנגיוגנזה להמחיש באמצעות מיקרוסקופ Multiphoton Vivo ב מהונדסים גנטית לגרדום 3D-PLGA/nHAp Calvarial תיקון פגם קריטי של העצם
7 בספטמבר 2017
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להמחיש כלי דם היווצרות ויוו ואת בזמן אמת ב- 3D פיגומים על ידי מיקרוסקופ multiphoton. אנגיוגנזה פיגומים מהונדסים נחקרה מודל פגם מאתר calvarial עצם קריטי. עוד כלי דם חדשים התגלו בקבוצה טיפול יותר שולטת.
המטרה הכללית של ניסוי זה היא להמחיש ויזואלית היווצרות של כלי דם In Vivo בתוך פיגומים תלת-ממדיים בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה רב-פוטונית. מדידות אלו הן שאלות מפתח בתחום ייצור העצם, כגון כיצד לנטרל ולהערים על היווצרות כלי דם in vivo בפיגומים תלת-ממדיים בזמן אמת. יתרון אחד של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנטרל בו-זמנית את CERES, מטריצות חוץ-תאיות ורשתות מולקולריות סביבתיות in vivo.
בתחילה, הכינו תמיסה הומוגנית המכילה 20 גרם של PLGA ו-20 מיליליטר של 1, 4 dioxane. לאחר מכן, הוסיפו לתמיסה שני גרם של nHAP באבקה. בעזרת מערבל מגנטי, ערבבו את התוךבסוף בעוצמה ב-1500 rpm בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות כדי ליצור משחה אחידה שתשמש להדפסת פיגומים נקבוביים של PLGA NHAP.
לאחר ההדפסה, ייבשו את הפיגומים בפריזה למשך 48 שעות כדי להסיר לחלוטין כל ממס. לאחר מכן, עקרו אותם ב-75% אתנול למשך שעה אחת. לאחר מכן, בצעו ליופיליזציה פעם נוספת כדי לקבל חומר ניטרלי ואנטיספטי.
בשלב הבא, הוסיפו 4.5 × 10⁵ חלקיקי lentiviral לכל פיגום (scaffold) והמתינו לספיגת החלקיקים באינקובטור לח עם טמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. לאחר שחלקיקי ה-lentiviral נספגו בפיגומים, שטפו את הפיגומים פעמיים עם 2 mL של PBS כדי להסיר שאריות שאינן קשורות. הקפיאו את הפיגומים השטופים באופן מהיר (Snap freeze) בחנקן נוזלי.
ולאחר ליפיליזציה פעם נוספת, אחסנו אותם במינוס 80 °C למחקרים עתידיים. העבירו פיגומים תלת-ממדיים שצופו מראש ב-4.5×10⁵ חלקיקים לנטיביריאליים הנושאים חלבון פלואורסצנציה ירוק למבחנות קריוגניות של 2.0 mL המולאות ב-1 mL של DMEM מלא, והדגרירו אותם ב-37 °C עם ניעור למשך חמישה ימים. בכל 12 שעות של הדגרה, אספו דגימות של 1 mL מהמדיום המכיל חלקיקים לנטיביריאליים ששוחררו מהפיגומים, והחליפו אותם ב-1 mL של מדיום טרי.
כדי לבצע טרנסדוקציה של תאי HEK293T, הסר תחילה את המצע מתאי HEK293T המגודלים בלוח 12 בארות ושטוף את התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של המצע שנאסף קודם לכן לתאי ה-HEK293T השטופים והדגר את הלוח למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח.
ראשית, חלק באופן אקראי שש עכברי C57 black לשלוש קבוצות טיפול: ביקורת, PH ו-PHp, כאשר בכל קבוצה 14 חיות. גדל את העור באזור הראש של עכבר מורדם וחטא את הפני השטח באמצעות תמיסת יוד ולאחר מכן תמיסת אלכוהול בריכוז 75%. מקם את ראש העכבר במכשיר סטריאוטקטי, חתוך את העור באמצעות סכין מנתחים ולאחר מכן, באמצעות מספריים, בצע חתך קווי באורך של one centimeter.
בעזרת מקלון צמר סטרילי, גרדו את הפריוסטום (periosteum) מעצם הגולגולת כדי לחשוף את פניה. לאחר מכן, בצד שמאל של הגולגולת, צרו באמצעות מקדח טרפין (trephine bur) פגם בגודל קריטי (critical size defect) בקוטר של ארבעה מילימטרים. השתילו את הפיגום (scaffold) לתוך פגם העצם.
השתמשו בפינצטה אופתלמית כדי לכסות בעדינות את אתר הניתוח בעזרת הפריוסטאום (קליפת העצם). לאחר מכן, סגרו את הפצע באמצעות שלושה תפרים לכל סנטימטר של חתך. לבסוף, ניתן את המשכך buprenorphine לשליטה בכאב שלאחר הניתוח, והשאירו את בעל החיים על פד חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלו עד להתעוררותו.
כאשר העכבר יתעורר, ספקו לו מזון ומים ועקבו אחר פעילותו היומיומית עד לסיום הניסוי. לאחר הרכבת מערכת המיקרוסקופיה הרב-פוטונית עבור דימויי TPEF ו-SHG, כווננו את לייזר הטיטניום-ספיר הפמטוסנייה ל-860 nanometers. כדי להמחיש כלי דם שנוצרו לאחרונה, מזריקו לעכבר באופן תוורידי 200 µL של תמיסת דקסטראן בריכוז 10 mg/mL במי מלח, ולאחר מכן, באמצעות מכשיר סטריאוטקטי, קבעו את בעל החיים המורדם על פלטת חימום כדי לשמור על טמפרטורת גופו ב-37 °C.
הזריק לעכבר 200 microliters של תמיסת סליין באופן אינטרהפריטוניאלי (תוך כדי חלל הבטן) כדי למנוע התייבשות. לבסוף, ספק לבעל החיים תערובת של 3% isoflurane ב-100% חמסן כדי לשמור על הרדמה ושיכוך כאבים מספיקים במהלך הדמיה. כדי להתחיל בהדמיה, סרוק זוג מראות גלוו (galvo mirrors) כדי ליצור שטח דגימה של 512 על 512 micrometer.
לאחר מכן, באמצעות עדשת שיקוע במים בעלת NA של 1.0, התמקד בקרן העירור על הדגימה ואסוף את אות ה-TPEF HSG המפוזר לאחור. הגדר את שדה הראייה כך שיכסה את אזור העצם הנורמלי ואת קצה הפגם בקבוצת הביקורת, אך רק את הפיגום המושתל בעת דימוי של בעל חיים מקבוצת PH או PHp. לאחר מכן, סרוק חמישה אתרים שונים של הפגם.
רכשו סדרות של תמונות (image stacks) מדי 12 שניות לאורך תקופת הדמיה של שעתיים. מוצגת כאן תמונה של הפיגום שהוכן בטכניקת הדפסת תלת-ממד, יחד עם תמונת micro-CT המראה את הנקבוביות הכוללת של החומר שהוכן. המבנה המיקרו-נקבובי של הפיגום מוצג בתמונת SEM שרוכזה בהגדלה של 5000 פעמים.
כפי שמוצג, תאי HEK293T שטופלו במצע המכיל חלקיקי לנטי-וירוס ששוחררו מהפיגומים ביטאו ביעילות את החלבון הפלואורסצנטי הירוק. כפי שהוערך באמצעות ציטומטריה של זרימה, מספר החלקיקים הכולל ששוחררו הגיע לכ-40 เปอร์เซ็นต์. אפקט השחרור החזק ביותר נצפה ב-24 השעות הראשונות של המחקר, ופחת בהדרגה עם הזמן, מה שמאשר שחלקיקי לנטי-וירוס המצופים על הפיגומים שומרים על פעילותם הביולוגית למשך עד 96 שעות.
ניתוח in vivo של כלי הדם שנוצרו בתוך פגם בעצם הגולגולת הראה כי כלי דם חדשים, שלא ניתן היה לזהות אותם בקבוצת הביקורת של העכברים, היו גלויים בבירור הן בקבוצת ה-PH והן בקבוצת ה-PHp שמונה שבועות לאחר השתלת הפיגום. בנוסף, בעוד שבשתי הקבוצות, PH ו-PHp, זוהו אתרי שיקוע רבים של קולגן, רק בקבוצת ה-PHp ניתן היה להבחין במספר גדל והולך של כלי דם קטנים יותר הגדלים לתוך הפיגומים, ושטח כלי הדם הכולל היה שונה באופן משמעותי. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כהלכה.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לקבע את ראשו של העכבר כדי לשמור עליו ללא תנועה במהלך הסריקה ולהימנע מארטפקטים. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון דימות פוטו-אקוסטי, על מנת לספק נתונים נוספים כגון תמונות של רקמות עמוקות. לאחר פיתחו, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום התחדשות העצם לחקור אנגיוגנזה בהשתלות.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של האופן שבו ניתן להדמות בזמן אמת היווצרות פלזמה in vivo בפיגומים תלת-ממדיים, ושל מיקרוסקופיית מיקרו-פוטונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול להדמיה של היווצרות כלי דם in vivo ובזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיית מולטי-פוטון בתוך פיגומים תלת-ממדיים. המחקר מתמקד בתהליך האנגיוגנזה בפיגומים שעברו שינוי גנטי במודל של פגם עצם קריטי בגולגולת עכבר, וחושף מספר גבוה יותר של כלי דם חדשים בקבוצת הטיפול בהשוואה לקבוצות הביקורת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- אנגיוגנזה
רקע
- היווצרות כלי דם היא קריטית להנדסת רקמות ולרפואה רגנרטיבית.
- הבנת תהליך האנגיוגנזה (יצירת כלי דם חדשים) עשויה לשפר אסטרטגיות לregenerציה (התחדשות) של עצם.
- מיקרוסקופיה רב-פוטונית מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של דינמיקה כלי דם.
- פיגומים שעברו שינוי גנטי יכולים להשפיע על תגובות אנגיוגניות.
מטרת המחקר
- להדמיות של תהליכי היווצרות כלי דם in vivo בתוך פיגומים תלת-ממדיים.
- להערכת ההשפעות של פיגומים שעברו שינוי גנטי על תהליכי אנגיוגנזה.
- לניצול מיקרוסקופיה מרובת פוטונים (multiphoton microscopy) לצורך דימיון בזמן אמת של התפתחות כלי דם.
שיטות שהשתמשו בהן
- הכנת תמיסה הומוגנית של PLGA ו-nHAP.
- שימוש במערבל מגנטי ליצירת משחה אחידה להדפסת פיגום.
- יישום מיקרוסקופיה מרובת פוטונים לוויזואליזציה בזמן אמת.
- השוואה של היווצרות כלי דם בין קבוצות הטיפול והביקורת.
תוצאות עיקריות
- נצפתה יצירה מוגברת של כלי דם בקבוצת הטיפול.
- דימות בזמן אמת סיפק תובנות לגבי תהליכים אנגיוגניים.
- הפרוטוקול הדגים בהצלחה את יעילותן של הפיגומים.
- הממצאים תורמים להבנת הווסקולריזציה בהנדסת רקמות.
מסקנות
- המחקר הצליח להמחיש תהליכי אנגיוגנזה in vivo באמצעות טכניקות דימיון מתקדמות.
- פיגומים שעברו שינוי גנטי הראו השבחה ביצירת כלי דם.
- ניתן ליישם גישה זו במחקרי המשך בתחומי התחדשות העצם והנדסת רקמות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה בזמן אמת של אנגיוגנזה בתוך פיגומים של ביו-חומרים בתלת-ממד פותרת צוואר בקבוק קריטי בהנדסת רקמת עצם, בכך שהיא מאפשרת הערכה ישירה של השילוב הווסקולרי ושל ביצועי הפיגום. מיקרוסקופיה מולטי-פוטונית מספקת דימוי ברזולוציה גבוהה ובמינימום פלישה, כדי לתמוך בביטחון חזוי ברגנרציה של עצם המונחית על ידי הפיגום. יכולת זו מסייעת בקבלת החלטות בשלבים מוקדמים של פיתוח הפורטפוליו ומפחיתה סיכונים בקידום התרגומי של מבנים מהונדסים לתיקון פגמים קריטיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של התגובה האנגיוגנית לשינויים גנטיים של פיגומים (scaffolds) באופן חי (in vivo).
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות הדמיה של אינטגרציה וסקולרית בממשק שבין הרקמה לפיגום.
- מסייע בביטחון חיזוי בתכנון פיגומים ליישומים רגנרטיביים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת תקיפה בתלת-ממד in vivo לכמותית של יצירת כלי דם בתגובה לשינויים במבנה הפיגום (scaffold).
- מאפשר תוצרי הדמיה כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הערכה השוואתית של מועמדי פיגום.
- תומך בסטנדרטיזציה של בדיקות אנגיוגנזה עבור תהליכי סינון המשכיים.
מחקר תרגומי וטרום-קלני
- מתאים את ביצועי הפיגום למדדי קולטקולציה (vascularization) רלוונטיים למחלה במודלים פרה-קליניים של פגמי עצם.
- מאפשר רצף משלב אופטימיזציית הפיגום בשלב הגילוי ועד לאידוק פרה-קליני של יעילות רגנרטיבית.
- תומך בקידום מותאם סיכונים של טכנולוגיות פיגום בהתבסס על מדדי קולטקולציה בזמן אמת.
שילוב זרימת עבודה ותהליכי עיבוד (Pipeline & Workflow Integration)
תהליך עבודה זה, המבוסס על מיקרוסקופיה מרובת פוטונים, מקשר בין שלבי הגילוי המוקדמים, אופטימיזציה של פיגומים ותיקוף פרה-קליני עבור תוכניות להחדבת עצם.
- ביולוגיה של התגליות: ויזואליזציה וכימות של אנגיוגנזה in vivo להבהרת אינטראקציות בין הפיגום למארח.
- סריקה: אספקת תוצרי הדמיה כמותיים וניתנים לשחזור להערכת פיגומים מועמדים.
- אנליטיקה: אספקת נתונים נפחיים וזמניים על היווצרות כלי דם לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: קישור בין תכנון הפיגום לתוצאות של וסקולריזציה והתחדשות עצם בשלב הפרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: ביסוס פלטפורמת הדמיה לשימוש חוזר עבור תוכניות מגוונות של הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באנגיוגנזה ובתיקון עצם המונחים על ידי פיגומים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של דימות in vivo וכמותית של כלי דם בפיגומים תלת-ממדיים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך פיתוח הפיגום על בסיס אינטגרציה ביולוגית בזמן אמת.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון של טכנולוגיות פיגום לתיקון פגמים קריטיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה רב-פוטונית ובפרוטוקולי דימות in vivo.
- נדרשת גישה למכשור דימות מתקדם ולמתקני ניתוח בעלי חיים.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי דימות וכימות.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור חומרי פיגום שונים או מודלים של פגמים.
- עלולים להיווצר ארטיפקטים של דימות כתוצאה מתנועת בעלי החיים, מה שדורש קיבוע קפדני.
שאלות נפוצות על ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Scaffold Preparation
7:00
Results: 3D Scaffolds Promote Angiogenesis in Bone Defects
8:33
Conclusion
3:51
Crtitical Bone Defect Model and Scaffold Transplantation
5:21
In Vivo Imaging of Angiogenesis within the Bone Defect
2:30
Lentivirus Particle Release and Transduction Capacity
