אנגיוגנזה להמחיש באמצעות מיקרוסקופ Multiphoton Vivo ב מהונדסים גנטית לגרדום 3D-PLGA/nHAp Calvarial תיקון פגם קריטי של העצם

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לדמיין את היווצרות כלי הדם In Vivo בפיגומים תלת מימדיים בזמן אמת על ידי מיקרוסקופ רב פוטונים. אלה שנמדדו הן שאלות מפתח בתחום ייצור העצם כגון כיצד לנטרל ולהערים על היווצרות כלי דם in vivo בפיגומים תלת מימדיים בזמן אמת. היתרון היחיד של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנטרל בו זמנית CERES, מדדים חוץ-תאיים ורשתות מולקולריות מסביב in vivo.

כדי להתחיל, הכינו תמיסה הומוגנית המכילה 20 גרם PLGA ו -20 מיליליטר של 1, 4 דיאוקסן. לאחר מכן, הוסיפו לתמיסה שני גרם של אבקת nHAP. בעזרת מערבל מגנטי מערבבים את המתלה במרץ ב -1500 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות ליצירת משחה אחידה שתשמש להדפסת פיגומי PLGA NHAP נקבוביים.

לאחר ההדפסה, יש לייבש בהקפאה את הפיגומים למשך 48 שעות כדי להסיר לחלוטין כל ממס. ואז לעקר אותם ב-75 אחוז אתנול למשך שעה. לאחר מכן, יש לשחרר אותם פעם נוספת כדי לקבל חומר חיטוי ניטרלי.

לאחר מכן, הוסף ארבע נקודות חמש כפול 10 לחמישית של חלקיקי לנטי-ויראלים לכל פיגום ואפשר לחלקיקים להיספג באינקובטור לח תוך שמירה על 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. כעת, כשהחלקיקים הלנטי-ויראלים נספגים על הפיגומים, שטפו את הפיגומים פעמיים עם שני מיליליטר PBS כדי להסיר שאריות לא קשורות. הצמד להקפיא את הפיגומים השטופים בחנקן נוזלי.

ולאחר ליפליזציה שוב, אחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס להמשך לימודים. העבירו פיגומים תלת מימדיים שצופו בעבר בארבע נקודות חמש כפול עשר לחלקיקים החמישיים הנושאים חלבון פלואורסצנטי ירוק בבקבוקונים קריוגניים של שני נקודות אפס מיליליטר מלאים במיליליטר אחד של DMEM מלא ודגרו אותם ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול במשך חמישה ימים. כל שתים עשרה שעות של דגירה, אספו דגימות מיליליטר אחת של המדיה המכילה חלקיקים לנטי-ויראליים המשתחררים מהפיגומים, והחליפו אותן במיליליטר אחד של מדיה טרייה.

כדי להמיר תאים HEK293T, הסר תחילה את המדיום מהתאים HEK293T שגודלו בצלחת של 12 בארות ושטוף את התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של המדיה שנאספה בעבר לתאי HEK293T השטופים ודגר את הצלחת למשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה. לאחר 48 שעות של דגירה, מדוד את מספר תאי HEK293T החיוביים ל-GFB על ידי זרימה ציטומטרית כדי לקבוע את מספר החלקיקים הלנטי-ויראלים הביו-אקטיביים.

כדי להתחיל, חלקו באופן אקראי שישה עכברים שחורים C57 לשלוש קבוצות טיפול: ביקורת, PH ו-PHP של 14 בעלי חיים כל אחד. לגלח את העור על ראשו של עכבר מורדם ולחטא את פני השטח עם תמיסת יוד ולאחר מכן תמיסת אלכוהול של 75 אחוז. הניחו את ראש העכבר במכשיר סטריאוטקטי ומדדו את העור בעזרת אזמל ואז בעזרת מספריים, בצעו חתך ליניארי של סנטימטר אחד.

בעזרת צמר גפן סטרילי, מגרדים את הפריאוסטאום מעצם הגולגולת כדי לחשוף את פני השטח שלו. לאחר מכן, בצד שמאל של הגולגולת, צור עם בור טרפין פגם בגודל קריטי בקוטר ארבעה מילימטרים. השתל את הפיגום בצד הפגם בעצם.

השתמש במלקחיים עיניים כדי לכסות בעדינות את אתר הניתוח עם הפריאוסטאום. לאחר מכן, סגור את הפצע על ידי מריחת שלושה תפרים לכל סנטימטר חתך. לבסוף, יש לתת את משכך הכאבים בופרנורפין כדי לשלוט בכאב לאחר הניתוח ולהשאיר את החיה על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה עד שהיא מתעוררת.

כאשר העכבר חוזר להכרה, ספקו לו מזון ומים ועקבו אחר פעילותו היומיומית עד לסיום הניסוי. לאחר הרכבת מערכת המיקרוסקופיה הרב-פוטונית להדמיית TPEF ו-SHG, כוון את לייזר ספיר טיטניום פמטו-שנייה ל-860 ננומטר. כדי לדמיין כלי דם חדשים שנוצרו, הזריק לעכבר תוך ורידי 200 מיקרוליטר של תמיסת דקסטרן של 10 מיליגרם למיליליטר במי מלח, ולאחר מכן, באמצעות המכשיר הסטריאוטקטי, שתק את החיה המורדמת על צלחת חימום כדי לשמור על טמפרטורת גופה על 37 מעלות צלזיוס.

הזריק לעכבר 200 מיקרוליטר מי מלח תוך צפקית כדי למנוע התייבשות. לבסוף, ספקו לבעל החיים תערובת של שלושה אחוזים של איזופלורן ב-100 אחוז חמצן כדי לשמור על הרדמה ושיכוך כאבים מספיקים במהלך ההדמיה. כדי להתחיל בהדמיה, סרוק זוג מראות galvo כדי ליצור שטח דגימה של 512 על 512 מיקרומטר.

לאחר מכן, באמצעות עדשת אובייקט טבילה במים NA onepoint O, מקד את קרן העירור על הדגימה ואסוף את אות ה-TPEF HSG המפוזר בחזרה. הגדר את שדה הראייה כך שיכסה את אזור העצם הרגיל ואת קצה הפגם בקבוצת הביקורת, אך רק את הפיגום המושתל בעת הדמיית החיה מקבוצת PH או PHp. לאחר מכן, סרוק חמישה אתרים שונים של הפגם.

רכוש ערימות תמונות כל 12 שניות במשך שעתיים של הדמיה. מוצג כאן תצלום של הפיגום שהוכן בטכניקת הדפסת תלת מימד, יחד עם תמונת מיקרו-CT המציגה את הנקבוביות הכוללת של החומר המוכן. המבנה המיקרו-נקבובי של הפיגום מוצג בתמונת SEM שנרכשה בהגדלה פי 5000.

כפי שהוצג, תאים HEK293T שטופלו במדיה המכילה חלקיקים לנטי-ויראליים ששוחררו מהפיגומים ביטאו ביעילות את החלבון הפלואורסצנטי הירוק. כפי שהוערך על ידי ציטומטריית זרימה, המספר הכולל של החלקיקים המשוחררים הגיע לכ-40 אחוזים. אפקט השחרור החזק ביותר נצפה במהלך 24 השעות הראשונות של המחקר, וירד בהדרגה עם הזמן, מה שמאשר כי חלקיקים לנטי-ויראלים המצופים על הפיגומים שומרים על פעילותם הביולוגית עד 96 שעות.

ניתוח in vivo של כלי הדם שנוצרו בתוך פגם בעצם הגולגולת הראה כי כלי דם חדשים, למרות שלא ניתן היה לזהות אותם בקבוצת הביקורת של העכברים, נראו בבירור הן בקבוצות PH והן בקבוצות PHp שמונה שבועות לאחר השתלת פיגומים. בנוסף, בעוד שבשתי קבוצות ה-PH וה-PHp זוהו אתרי שקיעת קולגן רבים, רק בקבוצת ה-PHp ניתן היה להבחין במספר הולך וגדל של כלי דם קטנים יותר הגדלים לפיגומים ואזור כלי הדם הכללי היה שונה באופן משמעותי. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשתק את ראש העכבר כדי להשאיר אותו דומם במהלך הסריקה כדי למנוע חפצים. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון הדמיה פוטו-אקוסטית על מנת לספק נתונים נוספים כגון תמונות רקמות עמוקות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום התחדשות העצם לחקור אנגיוגנזה בהשתלות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין היווצרות פלזמה in vivo בפיגומים תלת מימדיים בזמן אמת, ומיקרוסקופ מיקרופוטון.