כדאיות התא הדמיה על פיגומים ללא שקוף - לפי הדוגמה של שתל טיטניום סרוגה Novel

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לדמיין את המיקרו-מבנה של שתל גרעין טיטניום סרוג לא שקוף והדבקה של תאים עליו, תוך שימוש בטכניקות הדמיה פלואורסצנטיות. שיטה זו מקדמת את הניתוח של הנדסת רקמות עם פיגומים לא שקופים. יתרון אחד של טכניקה זו הוא שניתן לעקוב אחר כדאיות התא כמו גם אחר ההתפשטות על הפיגום עם תרבית מוגדרת.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הצביעה הפלואורסצנטית ומאוחר יותר, ההדמיה מאתגרת. תכונות פיגום בודדות כגון גודל הנקבוביות עשויות להשפיע על התזמון, ו/או הקרינה של הפיגום עשויה להשפיע על בחירת הפלואורופורים שבהם אתה משתמש. הניחו עד חמישה פיגומים בעובי שישה או שבעה מילימטרים בצינור של 50 מיליליטר, ושטפו אותם במים שלוש פעמים למשך 20 דקות בכל כביסה.

עשו זאת בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. לאחר מכן, שטפו את הפיגומים ב -30 מיליליטר של תמיסת 1% Triton X-100 באותם תנאים. לאחר מכן, בצע שתי שטיפות מים נוספות.

כעת, סוניקציה רציפה של הפיגומים בדרגת ריאגנט 99% אצטון, 99% איזופרופנול ו-99% אתנול. בצע כל שלב סוניקציה פעמיים למשך חמש דקות לכל סוניקציה. לאחר מכן, סוניקציה של הפיגום שלוש פעמים נוספות במים למשך 15 דקות בסך הכל.

סיימו בהנחת הפיגומים על טישו נטול מוך וייבשו אותם באוויר למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת, חיטוי הפיגומים למשך 15 דקות ב-121 מעלות צלזיוס ו-15 PSI. כדי לאשר שהניקוי עבד, השתמש בפלואורסצנטיות עקיפה.

טען באר אחת של צלחת 12 בארות עם 2000 מיקרוליטר של תמיסת הצביעה הטרייה גופרית-רודמין B, ובעזרת מלקחיים העבירו פיגום לבאר זו. לאחר מכן, צלם תמונות שליליות של הפיגום באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בסט מסנני קוביות LED RFP וחפש זיהומים בהגדלה גבוהה. בעזרת ארון הבטיחות הביולוגית, העבירו את הפיגומים הנקיים לבארות של צלחת 24 בארות.

הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית 37 מעלות צלזיוס לכל באר, ותן לפיגום להשרות במשך 15 דקות. בינתיים, הכינו 500,000 תאי SEP1 נגועים ב-Ad-GFP לכל מיליליטר מדיום. לאחר 15 דקות, שאפו לחלוטין את המדיום מהפיגומים, והושיבו אותם עם 100 מיקרוליטר של מתלה התאים.

לאחר מכן, דגרו אותם למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה הקצרה, הוסיפו עוד 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית, ודגרו על הפיגומים למשך 24 שעות. למחרת, שנה את מדיום התרבות כדי להסיר תאים שאינם נדבקים.

לאחר מכן, העריכו את היצמדות התאים והתפשטותם על הפיגומים, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בסט מסנני קוביות LED GFP. לקבלת צביעה חי-מת, צלח תחילה את תאי SEP1 על הפיגום כמו קודם. לאחר 24 עד 48 שעות, יש לשאוב לחלוטין את מדיום התרבות ולשטוף את הפיגומים עם DPBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

כעת, צבעו את התאים באמצעות מדיום תרבית המכיל Calcein AM, Hoechst 33342 ו-Ethidium homodimer. שלושת הפלואורופורים הללו כולם רגישים לאור, ולכן חיוני לשמור על התאים בחושך בתנועה קדימה. דגרו את התאים למשך 30 דקות עם הפלואורופורים כדי לקבל פיזור אחיד בכל הפיגום.

מאפייני פיגומים ספציפיים ישפיעו על זמן הדגירה הזה. לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם DPBS באמצעות מיליליטר אחד לבאר. בצע כל שטיפה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

מיד לאחר השטיפות, תעד את הפיגומים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי למדוד את כדאיות התאים לאורך זמן, השתמש במדידות המרה של resazurin. ראשית, שאפו לחלוטין את מדיום התרבות מתאי SEP1 היושבים בצלחת של 24 בארות ושטפו את התאים עם 500 מיקרוליטר DPBS לבאר.

לאחר מכן, כסו את התאים בנפח הנדרש של תמיסת עבודה סטרילית של רזזורין וכללו באר אחת עם רזזורין בלבד. לאחר מכן, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-30 דקות. לאחר הדגירה, העבירו 100 מיקרוליטר של הסופרנטנט המותנה מכל באר לתוך צלחת של 96 מיקרו-בארות כדי למדוד את הקרינה שלה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

להמשך גידול יש להוציא את הרזזורין מהבאר, ולשטוף שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של DPBS. בצע כל שטיפה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה השלישית, הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית לכל באר תאים, והמשיך בדגירה שלהם למדידות נוספות של מהלך הזמן.

באמצעות כתמים פלואורסצנטיים עקיפים, תועדו זיהומים לפני הניקוי כדי לייעל את פרוטוקול הניקוי. הפחתה משמעותית בעומס החומר על הפיגום מראה את היעילות של פרוטוקול הניקוי המתואר. השתלים העוקבים המשמשים לטיפול בניתוח מפרקים נקבעים על ידי אירועים המתרחשים בממשק החומר בתא.

לאחר 24 שעות של היצמדות לפיגומים, תאי SEP1 התחברו. לאחר מכן יושמו פלואורופורים כדי לבחון מוות והתפשטות תאים לאורך תקופה על הפיגומים. צביעה חיה-מתת הראתה צביעה גרעינית כחולה עם פלואורסצנטיות אדומה בתאים מתים ופלואורסצנטיות ירוקה בתאים ברי קיימא.

בנוסף, כדאיות התאים על הפיגום כומתה באמצעות בדיקת המרת רזזורין. במשך שבועיים נאספו נתונים על תאים שגודלו עם או בלי פיגומים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להתאים את הפלואורופורים שבהם אתה משתמש לפיגום ולמיקרוסקופ העומדים לרשותך.

בעקבות הליך זה, ניתן ליישם שיטות אחרות, כמו צביעה אימונו-פלואורסצנטית, על מנת לדמיין נוכחות של חלבונים, או הפעלה של מפלי איתות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול בניתוח מפרקים מכיוון שהאינטראקציה של פנים התא עם הרקמה הסובבת in vivo תגדיר את תפקודו ועמידותו.