לחקר ויראלי וקטורים בתוך אוכלס מחדש תלת מימדי הכבד דגם עם הקו Cell Carcinoma Hepatocellular האדם HepG2

המטריצה החוץ-תאית של כבד חולדה נטול תאים יכולה לשמש כמודל ex vivo תלת מימדי אנושי כדי לחקור את התפוצה והביטוי הטרנסגני של נגיף או וקטור ויראלי.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לפתח מודל כבד תלת מימדי לחקר וירוסים ווקטורים ויראליים. שיטה זו מאפשרת לחקור תהליכים ביולוגיים במערכת תלת מימדית של כלי דם עם תאים אנושיים הנבדלים בפיזיולוגיה שלהם מתאי מכרסמים במודל של עכבר או חולדה. בנוסף, זהו צעד לשיפור רווחת בעלי החיים מכיוון שהוא נמנע מניסויים בבעלי חיים ונועד, בטווח הארוך, להחליף באופן מלא רכיבים מן החי.

למרות שפיתחנו שיטה זו לחקר וקטורים נגיפיים להעברת גנים, ניתן ליישם אותה גם לחקר נגיפים חיוניים זיהומיים ותחומי מחקר אחרים כגון חקר הסרטן. תדגים את ההליך ויולה רוהרס, טכנאית מהמעבדה שלי. למען רווחת בעלי החיים נעשה שימוש רק בבעלי חיים עודפים למחקר הנוכחי שהוקרבו לניסויים אחרים בבעלי חיים, כלומר

לא היה צורך בבעלי חיים נוספים כדי להשיג את פיגומי הכבד. כדי להתחיל, הרחב תחילה את קו תאי הכבד Hep G2. זרע 15 מיליון תאים לבקבוקי T175 ב-30 מיליליטר של מדיום המכיל 10% סרום עגל עוברי ושתי מילימול של גולאטמין, פניצילין וסטרפטומיצין. לאחר ארבעה ימים של תרבית, השתמש בחמש דקות של חשיפה לתמיסת טריפסין בתנאי גידול כדי לשחרר את התאים, ולאחר מכן לקצור אותם.

לאחר מכן סובב את התאים ב -300 G למשך שלוש דקות. לאחר מכן השעו אותם מחדש בארבעה מיליליטר PBS וקבלו ספירת תאים. כל בקבוק אמור להניב כ-45 מיליון תאים.

יש צורך ב-600 מיליון תאים כדי לבצע מחדש ECM בכבד של חולדות. כדי להחזיר את ה-ECM, הקימו תחילה את מערכת הביוריאקטור המכילה תא שפע כבד, מערכת שפע, מאגר מדיום ומלכודת בועות. ישנם שני שלבים קריטיים להליך הרסלולריזציה.

האחת היא להימנע מלכידת בועות אוויר במערכת השפע. השני הוא שיש לשמור על המערכת כולה סטרילית. ראשית, יש לעקר את הרכיבים הללו של מערכת הביוריאקטור בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

שנית, מלאו את הצינורות ואת תא השפע המעוקר במדיום. לאחר מכן הנח את פיגום כבד החולדה המפורק לתוך תא שפע הכבד. השלב הבא הוא להשתמש בקליפסים של צינור כדי לחבר את וריד הפורטל המגולגל למערכת השפע.

כעת הכניסו את מערכת הביוריאקטור לחממה וחברו אותה למשאבה פריסטלטית. לאחר מכן, יש לאזן את הפיגום עם 150 מיליליטר של מדיום משלים במשך חמישה ימים. הגדר את הזרימה ל -1.25 מיליליטר לדקה.

לאחר חמישה ימים, נתק את מערכת הביוריאקטור מהמשאבה והעביר אותה למכסה מנוע סטרילי. נתק את פיגום הכבד ממעגל המדיה. לאחר מכן טען מזרק עם חמישה מיליליטר מדיום המכיל 300 מיליון תאי Hep G2 והזריק את התאים דרך וריד הפורטל, הימנעות מהיווצרות בועות אוויר.

לאחר מכן אפשרו לתאים לאכלס מחדש את ה-ECM למשך שעה מבלי להפעיל את המשאבה. לאחר שעה, הפעל את המשאבה במהירות של 1.25 מיליליטר לדקה. לאחר 10 דקות, הגדל את הלחץ ל -2.5 מיליליטר לדקה.

לאחר 20 דקות נוספות, הגדר את המשאבה למהירות ההפעלה של 3.75 מיליליטר לדקה. לאחר 30 דקות במהירות משאבה מלאה, כבו את המשאבה, הוסיפו עוד 300 מיליון תאים ותנו לתאים לאכלס את ה-ECM למשך שעה. לאחר שעה, הגדל בהדרגה את זרימת הדם על ידי התאמות מצטברות למהירות המשאבה כמו קודם.

כעת תנו לתרבית להחזיר את הכבד במשך שבועיים. כל יומיים, החלף 50 מיליליטר מהמדיום ומדוד את הפרמטרים הפיזיולוגיים ממדגם של המדיום המשומש. ייצור וקטורי AAV הוא הליך מסובך הכולל שלבים רבים המסוכמים בפרוטוקול הטקסט.

בחלק זה של הסרטון מודגמים כמה מהשלבים המכריעים. ראשית, לייצר, לטהר ולכמת את וקטורי ה-AAV. לייצר בקצרה את וקטורי ה-AAV בבקבוקי רולר ולטהר אותם על ידי צנטריפוגה של שיפוע יודיקסנול.

הסר את שאריות היודיקסנול על ידי סינון מעל עמודי סינון ג'ל PD10. לאחר מכן קבע את ריכוז וקטור ה-AAV על ידי QPCR באמצעות DNA AAV גנומי כסטנדרט. בסך הכל דרושים 27 טריליון וקטורים של AAV לכל מודל.

עכשיו התמרו את מודל הכבד. ראשית, הכניסו 27 טריליון וקטורים בחמישה מיליליטר PBS למזרק. ניתן להוסיף פנול אדום ב-5 מיקרוגרם למיליליטר.

לאחר מכן נתק את הכבד ממעגל המדיה והזריק את הווקטורים למערכת. לאחר ההזרקה, דגרו על המערכת למשך שעה ללא שאיבה. ואז הגדל בהדרגה את הזרימה כפי שתואר קודם לכן.

מאוחר יותר, כאשר הכבד המומר מודגר במשך שישה ימים, החלף 50 מיליליטר מהמדיום כל יומיים. בעזרת אזמל פורסים דגימות מכל אונת כבד בעובי של כחצי סנטימטר ובאורך של 1.5 עד שני סנטימטרים. דגרו את הפרוסות ב-4% פרפורמלדהיד עם 4% סוכרוז למשך 90 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן שטפו את הדגימה שלוש פעמים עם PBS למשך דקה אחת לכל כביסה. עקוב אחר השטיפות על ידי דגירה של הדגימות למשך הלילה ב-8% סוכרוז בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, טען את הדגימות לתבניות קריו-תבניות המכילות מדיום קיבוע כלשהו.

הימנע מהכנסת בועות אוויר. לאחר הטעינה, כסו את הדגימות במלואן במדיום קיבוע והניחו אותן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. לאחר ההקפאה, הכינו קריוקטורים של 10 מיקרון מהדגימות באמצעות קריוטום.

צבעו את הדגימות לפי הצורך כדי לאשר את התאית מחדש. לניתוח ביטוי גנים, קח דגימות באמצעות אגרוף ביופסיה של ארבעה מילימטרים. כדי להעריך את הרסלולריזציה, הקפאה הוכתמה בהמטוקסילין ואאוזין.

אונות משני כבדים שעברו התמרה וכבד ביקורת אחד שעבר תאית מחדש אך לא התמרו אוכלסו כולן מחדש בתאי Hep G2. ביטוי RNA וטיטר וקטור כומתו מ-28 ביופסיות אגרוף מכל מודל כבד. בשני המודלים של הכבד המומר, נמדדו 55 ו-90 גנומים וקטוריים לתא, וזה מספיק וקטור כדי לגרום להשתקת גנים.

לא נמדדו גנומים בביקורת, כצפוי. ביטוי EmGFP נותח על ידי RT-PCR וכתמים מערביים. רוב הביופסיות הראו ביטוי mRNA של EmGFP וביטוי חלבון של EmGFP.

עמידה חיסונית של הקריוסקטורים הראתה שבכל מקום שבו המודל עבר תא מחדש בהצלחה, ניתן היה לראות גם ביטוי EmGFP. זה מעיד על ביטוי גן AAV טוב. לאחר מכן, ההדחה בתיווך AAV של ציקלופילין B אנושי נותחה על ידי RT-PCR כמותי.

הפלה ממוצעת של ציקלופילין B אנושי הייתה בין 70 ל-90% על פני כל האונות של שני הכבדים המומרים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור את התפלגות הנגיפים והווקטורים הנגיפיים במערכת האיברים התלת-ממדית של כלי הדם. מחקרים כאלה יעזרו לשפר את הטכניקות הנוכחיות להעברת גנים ויסייעו בפיתוח אסטרטגיות אנטי-ויראליות חדשות.