Name: לחקר ויראלי וקטורים בתוך אוכלס מחדש תלת מימדי הכבד דגם עם הקו Cell Carcinoma Hepatocellular האדם HepG2 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: חקור וקטורים ויראליים במודל כבד תלת-ממדי מחודש בתאי HepG2 אנושיים. שיטה זו מאפשרת מחקר ביולוגי במערכת וסקולרית תוך שיפור רווחת בעלי חיים והחלפת ניסויים בחיות חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לברנד קרוסטיץ על הסיוע הטכני, לרדוסלב קדז'ירסקי על התרומות הראשוניות לפרויקט, לאריק ווייד על ההגהה ומתן הערות מועילות, ולפרופ' הייקה וולס על אספקת הביוריאקטור ושיתוף הניסיון היקר שלה עם דה-סלולריזציה של איברים. אנו אסירי תודה גם על מימון הפרויקט והפרסום על ידי האוניברסיטה הטכנולוגית של ברלין.

הערה: RL קיבלה אישור האתי של explantation של האיברים מן Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). כבדים היו explanted חולדות וויסטר. הווריד הנבוב הנח וריד השער של הכבד היו cannulated עם צינורית 22 G. שיטות עבור decellularization של כבדי explanted תוארו בעבר. 4,5 מטריצות תאיים משמשות כאן התקבלו על ידי זלוף המוגזם של כבד עכברוש עם deoxycholate נתרן 1%. 1. Recellularization של תאי מטריקס (ECM) של כבד עכברוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחבת HepG2 שורת תאים בכבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות הקו הסלולרי קרצינומה hepatocellular HepG2 רוזוול פרק מכון זיכרון (RPMI) בינוני 1640 בתוספת 10% בסרום עוברי עגל, 2 מ&quot;מ גלוטמין, ו 2 מ&quot;מ של פניצילין סטרפטומיצין, כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי 1.5 x 10 7 תאים בבקבוקי T175 ולגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 </sub&gt;. קציר תאים לאחר 4 ימים על ידי trypsinization במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים ב 300 XG resuspend אותם 4 מ&quot;ל PBS ולספור את התאים עם תא נויבאואר תחת מיקרוסקופ. בקבוק T175 אחת יניב כ 4.5 x 10 7 תאים. הערה: ודא התרבות מכיל מספרים סלולריים מספיקות recellularization של ECM עכברוש הכבד עם 6 x 10 8 תאים HepG2 לכל ECM (10 x 175 ס&quot;מ 2 צלוחיות תרבות עם 4-5 x 10 8 תאים כל אחת). </li></ol></li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig1.jpg" /> מערכת bioreactor באיור 1.. א) זה מערכת bioreactor היה מחוייט. זה שומר על מודלי האיבר ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. שיעורי הזרימה של משאבות פריסטלטיות ניתן לווסת באופן אינדיבידואלי. B) הכבד ממוקם בתא צמיחה ולהתחברed למעגל זלוף, אשר מורכב של משאבת peristaltic, מאגר בינוני, מלכודת בועת חיישן לחץ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Recellularization של ECM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מערכת bioreactor, המכילה תא זלוף כבד, מערכת זלוף, מאגר של מדיום ואת מלכודת בועה. לעקר את מערכת bioreactor (121 ° C, 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המערכת bioreactor עם משאבה peristaltic ולמקם אותו באינקובטור מתן תנאים מתאימים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). מניח פיגומים כבדים עכברוש decellularized 8 בתא הכבד זלוף של מערכת bioreactor (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את וריד שער cannulated ואת הווריד הנבוב באמצעות קטעי צינור למערכת זלוף. לאזן פיגום עם 150 מ&quot;ל בינוני RPMI (כמתואר 1.1)מעל 5 ד עם קצב הזרימה של 1.25 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את הפיגום הכבד מן המעגל התקשורת ולחסן את הפיגום עם 3 x 10 8 תאים HepG2 (5 מ&quot;ל) דרך וריד הפורטל באמצעות מזרק 5 מ&quot;ל, למנוע היווצרות בועת אוויר ולאפשר לתאים כדי לאכלס מחדש את ECM על ידי דוגרים אותם hr 1 ב הפיגום עם המשאבה כבוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהדרגה להגדיל את קצב הזרימה על ידי התאמת המשאבה, החל 1.25 מ&quot;ל / דקה במשך 10 דקות; 2.5 מ&quot;ל / דקה במשך 20 דקות ולבסוף 3.75 מ&quot;ל / דקה במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.2.4-1.2.5 להגיע למספר תא כולל של 6 x 10 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מערכת bioreactor בקצב זרימה של 3.75 מ&quot;ל / דקה. תרבות בכבד חולדה recellularized עבור 2 שבועות. הערה: החלף שליש בינוני עם בינוני טרי (50 מ&quot;ל) פעם ביומיים. בואו לטעום את מדיום התרבות למדוד פרמטרים פיסיולוגיים, כגון פעילות לקטט דהידרוגנאז, ה- pH של דגימות בינוניות ואת הריכוז של הגלוקוז ומיניקה. </li></ol></li></ol> 2. התמרה של כבד עכברוש Recellularized <ol start="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצור בקנה מידה גדולה של וקטורי AAV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Produce, לטהר, ולכמת וקטורים AAV כפי שתואר לעיל: 11 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, לייצר וקטורים AAV בקבוקי רולר ולטהר אותם על ידי צנטריפוגה שיפוע iodixanol. הסר iodixanol שיורי על ידי סינון על עמודות סינון ג&#39;ל PD10. קבע את הריכוז וקטור AAV ידי qPCR באמצעות DNA AAV גנומי כסטנדרט. הערה: וקטור עצמית משלימים, Pseudotyped AAV2 / 6 השתמשו במחקר הנוכחי מקודד EmGFP ככתב להפגין יעילות התמרה ואת קלטת ביטוי shRNA עבור מציאה של גנים הביע באופן אנדוגני (B cyclophilin האדם (hCycB), איור 2) . ודא כמות מספקת של וקטורי scAAV Pseudotyped של סרוטיפ 6 (2.7 x 10 13 וקטורי AAV לפי מודל כבד). </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig2.jpg" /> מפת איור 2. של הווקטור העצמי משלימים, Pseudotyped AAV2 / 6 השתמש במחקר הנוכחי. הגנום מורכב החוזר המסוף ההפוך (ITR) של AAV2 ומקודד EmGFP תחת השליטה של אמרגן CMV וכן shRNA תחת שליטה של אמרגן U6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמרה של דגם כבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הפתרון וקטור AAV לריכוז סופי של 2.7 x 10 13 הגנום וקטור ב 5 מ&quot;ל על ידי הוספת נפח בהתאמה של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתק את הכבד מן מעגל התקשורת על ידי הסרת הצינורות מן הצינורית. חבר מזרק 5 מיליליטר ל הצינורית של וריד השער ולהזריק פתרון וקטור AAV המלא (5 מיליליטר). הערה: Optionally, להוסיף פנול אדום (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) כדי לעקוב אחר חלוקת הפתרון וקטור AAV בתוך הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 1 ללא שאיבה. בהדרגה להגדיל את שיעור הזרימה, החל 1.25 מ&quot;ל / דקה במשך 10 דקות; 2.5 מ&quot;ל / דקה במשך 20 דקות ו 3.75 מ&quot;ל / דקה במשך 30 דקות. תרבות בכבד חולדה recellularized מעל 6 ימים. הערה: חלף שליש המדיום כפי שהם מתפרסמים הערה תחת 1.2.7 </li></ol></li></ol> 3. הערכה של הכבד Recellularized transduced עכברוש <ol start="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hematoxylin ו eosin (HE) מכתים וניתוח immunohistochemical <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח דגימות (0.5 x 0.5 x 1.5-2 סנטימטר) מכל אונה כבדה באמצעות אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות (מ 3.1.1) ב paraformaldehyde 4% (PFA) + תמיסת סוכרוז 4% עבור 1.5 שעות ב 4 ° C. (זהירות: PFA הוא רעילים ומסרטנים תמיד לשמור PFA בתוך במנדף וללבוש ביגוד מגן מתאים..) לשטוף שלוש פעמים עם PBS (1 דקות לכל שלב לשטוף) דגירה ב -8%לילה סוכרוז ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים תיקון בינוני לתוך cryomolds פלסטיק, למקם את הדגימות לתוך תיקון בינוני ללא בועות אוויר. הוסף בינוני לתקן עד מדגם מכוסה היטב. חנות מוטבעת דגימות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן-סעיפי קריו (10 מיקרומטר) עם cryotome 12. להעריך recellularization ידי מכתים hematoxylin + eosin 8. להעריך את היעילות התמרה על ידי מכתים immunohistochemical עבור הגן של עניין (כאן: EmGFP). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימה ביולוגית מולקולרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו לטעום כל אונה כבדה עם ביופסיה (4 מ&quot;מ קוטר). לבודד הכולל RNA, DNA וחלבונים על פי הוראות היצרן להערכת ביטוי transgene של EmGFP, ו hCycB להפיל 8. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+and+spheroid+culture+of+human+liver+hepatocellular+carcinoma+cell+line+cells+demonstrate+distinct+global+gene+expression+patterns+and+functional+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes.</a> Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).</li>
<li>Butler, D., Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientists+in+the+dark+after+French+clinical+trial+proves+fatal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal.</a> Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).</li>
<li>Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+penetrate+human+solid+tumor+tissue+in+vivo+more+effectively+than+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394(2011).</li>
<li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+Decellularization+of+Rat+Livers+in+an+Oscillating-pressure+Perfusion+Device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device.</a> J. Vis. Exp. (102), e53029(2015).</li>
<li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).</li>
<li>Yagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-scale+whole-organ+bioengineering+for+liver+transplantation%3A+a+regenerative+medicine+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach.</a> Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).</li>
<li>Wagner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+three-dimensional+humanized+liver+model+for+the+study+of+viral+gene+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors.</a> J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).</li>
<li>Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+gene-based+therapies%3A+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).</li>
<li>Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endgame%3A+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li>
<li>Wagner, A., Röhrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+quantification+of+adeno-associated+virus+vectors+for+RNA+interference+applications+using+quantitative+polymerase+chain+reaction+and+purified+genomic+adeno-associated+virus+DNA+as+a+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard.</a> Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).</li>
<li>Takagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissected+region-specific+gene+expression+analysis+with+methacarn-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+by+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR.</a> J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כבדי 3D מחדש המתוארים כאן לספק מודל ללמוד וקטורים ויראליים במערכת אנושית. ואכלוס של ECM של כבד עכברוש עם קו תא קרצינומה אדם hepatocellular מייצר מערכת כלי דם המאפשרת חקר תרופות ביולוגיים גדולות. תוצאות אלה מספקות הוכחה של קונספט שהמודל הכבד מחדש ניתן transduced ביעילות עם וקטור ויראלי. עבור הניסויים המוצגים כאן, כל אונה של הכבד הייתה transduced ידי וקטור AAV. עם זאת, בכמה ניסויים ראשוניים, אונות יחידה לא אוכלסה מחדש עם תאים. לכן חשוב למנוע פסולת התא או רכיבים אחרים מהעמוד שאטם את מערכת כלי הדם. כדי לבדוק אם כל האונות ניתן perfused, צבע רעיל כגון פנול אדום יכול להיות סמוק דרך המודל הכבד. עוד עניין מכריע הוא שמירה על הפיגום הכבד סטרילי. למרות שטיפול עם אתנול או אנטיביוטיקה הוא disadvantageous עבור מערכת כלי הדם, הקרנה של תאי מטריקס עם קרינת γ שמר על כלי ולחטא המדגם. יתר על כן, בגודל של כבדי explanted יהיה שונה, כך שמספר התאים המשמשים עבור הליך recellularization והזמן והאכלוס עשוי להיות מותאם כדי להשיג תוצאות לשחזור. כבדי העכברוש השתמשו במחקר הנוכחי הם גדולים יחסית ודורשים כמויות גדולות של תאי ריאגנטים בדיקה (למשל, וקטורי AAV). בנוסף, ההליך ואכלוס לקח יותר משבועיים. זה מגביל את מספר משכפל אשר ניתן לעשות במאמץ סביר. בשלב זה אנו מקימים את המודל עבור כבדי העכבר, שהן רק כחמישית מהיקף כבדי חולדה, המאפשר שימוש של פחות תאים ריאגנטים מבחן פחות. למרות למטה בקנה מידה היחסי של המספר הסלולרי נראה סביר, את הסכומים המדויקים צריכים להיקבע furtהניסויים שלה. עוד חיסרון של המודל הנוכחי הוא השימוש של הקו הסלולרי HepG2 hepatocellular. ניסויים נמשכים לפתח את השימוש של hepatocytes הבדיל מתאי גזע מושרים, אשר תספק מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית יותר. יתר על כן, הכבד מורכב של סוגי תאים מרובים בנוסף hepatocytes, למשל, תאי Kupffer ואת sinosoids. אנו מניחים כי תאים מסוגים שונים יהיה לאכלס מחדש בסביבתם הטבעית כאשר ECM הוא recellularized עם סוגי תאים מרובים. המודל הכבד 3D משלב מספר יתרונות. החיסרון העיקרי של קונבנציונאלי במודלים vivo הוא כי פיזיולוגיה של בעלי חיים שונה באופן מהותי מן הפיזיולוגיה האנושית. תופעות לוואי רעילות של טיפול של חולה אנוש ולכן עשוי להישאר מבלי שיבחינו בו. חיסרון זה ניתן להתגבר על ידי reconstituting המודל הכבד 3D עם תאים אנושיים כי יותר מקרוב משקף את הביולוגיה של huחולי גבר. היתרון השני של המודל הכבד הוא תרומתה רווחת בעלי החיים. למרות רכיבים מן החי נדרשים עבור ניסויי הכינון מחדש, הגישה עדיין עוקבת אחר המטרות של עיקרון 3R (החלפה, הפחתה, עידון), כחיות עודפות יכולות לשמש כי הוקרבו לניסויים בבעלי חיים אחרים, כלומר, לא חיות נוספות נדרשות ו הגישה לחלוטין תמנע סבל של בעלי חיים אשר מזוהים לעתים קרובות עם ניסויי in vivo. Spheroids הם כלים חלופיים ללמוד תהליכים תאיים במערכת 3D. עם זאת, spheroids אינו vascularized כך חומרים גדולים בתחום תרופות ביולוגיות אינם חודרות עמוק לתוך החלקים הפנימיים של המבנה. בעיות אלה הוכרעו עם המודל הכבד 3D vascularized. בניסויים שתוארו כאן, וקטורי AAV נחקרו, שכן הם בין המועמדים המבטיחים ביותר עבור טיפולי גןיישומים. כפי גישות טיפוליות רב גן לכוון מיקוד הכבד, למשל, לטיפול בדלקות עם וירוסים הפטיטיס או של אלפא-1-antitrypsin חסר, כבד 3D ניתן להשתמש בתהליך של פיתוח הווקטור אלה AAV. זהו, כמובן, גם מתאים ללימוד וקטורים ויראליים hepatotropic אחרים, למשל, וקטורים adenoviral. בנוסף, ניתן להשתמש בו כדי ללמוד וירוסי צהבת זיהומית כגון הפטיטיס B או C וירוס. זה יכול, למשל, להיות מועסק על מנת לעצב אסטרטגיות נגיפים חדשים. יתר על כן, מודלי איבר 3D מייצגים כלים מבטיחים לפתח תרופת cytostatic חדשה לטיפול בסרטן לבצע מחקרים טוקסיקולוגית. ביום בטווח הארוך, כבדים מלאכותיים עשויים לשמש ברפואה רגנרטיבית כמו השתלות. יחדיו, המודל הכבד 3D מציעה מגוון רחב של יישומים בביולוגיה זיהום ותחומים אחרים של מחקר ביו-רפואי.

רוב המחקר הביו-רפואי הנוכחי מסתמך על אחת משתי גישות, או ניסויים דו-ממדיים בתרבית תאים או מודלים של בעלי חיים, שהם תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) מעצם טבעם. עם זאת, לגישות אלה יש כמה חסרונות חמורים. תאים שגדלו בתרבית דו-ממדית הוכחו כשונים בדפוסי ביטוי הגנים ובפיזיולוגיה של התא מאלה שגודלו בתנאים תלת-ממדיים. 1 מודלים של בעלי חיים, בנוסף להיותם קשורים לחששות אתיים, לעתים קרובות אינם מדגימים היטב את הפיזיולוגיה האנושית. למרות שיש לאשר את היעדר ההשפעות הרעילות הברורות של תרכובת במודלים של בעלי חיים לפני המנה הראשונה בבני אדם, תועדו מקרים רבים בהם התרחשו תופעות לוואי חמורות, לעיתים קטלניות, בניסויים קליניים. 2
כדי להתגבר על החסרונות הללו, מודלים תלת-ממדיים של איברים מחוץ לגוף הפכו לכלי מחקר חשובים. כאשר מעובדים בתנאים מתאימים, תאים מתאספים בעצמם למבנים תלת-ממדיים הידועים בשם ספרואידים. עם זאת, לספרואידים אלה חסרה מערכת כלי דם, המגבילה את התפוצה של תרכובות מולקולריות קטנות, תרופות ביולוגיות גדולות ווקטורים נגיפיים כאחד. לדוגמה, וקטורים אדנו-ויראליים התמרו רק את שכבות התאים החיצוניות של ספרואידים שהוכנו מגליובלסטומה אנושית. 3 פתרון לבעיה זו הוא שימוש במודל איברים המכיל מערכת כלי דם. לשם כך, ניתן להשתיל את האיבר המעניין מבעל חיים, ולהחליף את תאי בעלי החיים בתאים אנושיים. תוארו שיטות שונות לדה-סלולריזציה של כבד בעלי חיים על ידי טיפול בחומרי ניקוי או נתרן כולאט. 4-6 המטריצה החוץ-תאית (ECM) המתקבלת מכילה ציטוקינים וגורמי גדילה המווסתים תהליכים תאיים שונים. 7 זה יכול לשמש כפיגום לתאית מחדש עם תאים אנושיים כדי להשיג מודל איברים פונקציונלי.
במחקר שנערך לאחרונה, השתמשנו במודל כבד תלת-ממדי אנושי כדי לחקור את התפלגות וביטוי הטרנסגנים של וקטור וירוס הקשור לאדנו (AAV). 8 וקטורים של AAV שייכים לווקטורים הוויראליים המבטיחים ביותר ליישומים טיפוליים בגנים. 9 ההתערבות הטיפולית הגנטית הראשונה, והיחידה עד כה, בעולם המערבי משתמשת בווקטור AAV להעברת ליפופרוטאין ליפאז. 10

<table><tbody><tr><td>חממה</td><td>Fraunhofer</td> <td>/</td><td></td></tr> <tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>Fraunhofer</td> <td>/</td><td></td></tr> <tr><td>אוגן עם חריץ</td><td>Duran</td><td>2439454</td><td>שונה על ידי gaffer</td></tr><tr><td>O-Ring שקוף</td><td>Duran</td><td>2922551</td><td></td></tr><tr><td>מהדק שחרור מהיר</td><td>Duran</td><td>2907151</td><td></td></tr><tr><td>מכסה אוגן שטוח</td><td>Duran</td><td>2429857</td><td>שונה על ידי</td></tr><tr><td>גאפר בורג חוט צינור</td><td>דוראן</td><td>2483802</td><td>שונה על ידי גאפר</td></tr><tr><td>בורג חוט צינור</td><td>דוראן</td><td></td><td>2483602 שונה על ידי גאפר</td></tr><tr><td>סיליקון טבעת איטום</td><td>דוראן</td><td>2862012</td><td></td></tr><tr><td>כובע בורג</td><td>דוראן</td><td>2924013</td><td></td></tr><tr><td>כובע בורג</td><td>דוראן</td><td></td> 2924008 <td></td></tr><tr><td>כובע בורג עם צמצם</td><td>דוראן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכסה בורג 2922709 עם צמצם</td><td>מסנן 2922705</td><td></td><td></td>דוראן</tr><tr><td></td><td>Sarstedt</td><td>831,826,001</td><td></td></tr><tr><td>צינורות סיליקון</td><td>VWR</td><td>228-1500</td><td></td></tr><tr><td>מחבר צינור</td><td>Ismatec</td><td>ISM556A</td><td></td></tr><tr><td>צינורות ביו-תואמים</td><td>Ismatec</td><td>SC0736</td><td></td></tr><tr><td>T175 צלוחיות תרבות</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>660 160</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0501-500</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמין</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>X0551-100</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0940-100</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>cc pro</td><td>S-10-M</td><td></td></tr><tr><td>טישו-טק O.C.T.</td><td>Weckert-Labortechnik</td><td>600001</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>DSMZ</td><td>ACC 180</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold 15 x 15 x 5 מ"מ</td><td>סאקורה</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>ביופסיה אגרוף 4 מ"מ</td><td>pfm רפואי</td><td>48401</td><td></td></tr><tr><td>נוקלאוספין miRNA</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740971.10</td><td></td></tr><tr><td>סט מאגר RNA/DNA נוקלאוספין</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740944</td><td></td></tr></tbody></table>

לחקר ויראלי וקטורים בתוך אוכלס מחדש תלת מימדי הכבד דגם עם הקו cell carcinoma hepatocellular האדם hepg2

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

פרוטוקול זה מתאר את הדור של (3D) תלת מימדי מודל כבד vivo לשעבר ויישומו במחקר ופיתוח של מערכות וקטור ויראלי. המודל מתקבל על ידי repopulating המטריצה ​​התאית של כבד עכברוש decellularized עם קו תא hepatocyte אנושי. המודל מאפשר לימודי מערכת תאי 3D vascularized, החלפת ניסויים מזיקים עם בעלי חיים. יתרון נוסף הוא הטבע האנושי של המודל, שדומה יותר פיזיולוגיה אנושית מאשר במודלים של בעלי חיים. במחקר זה, אנו מדגימים את התמרה של מודל הכבד הזה עם וקטור ויראלי נגזר וירוסים adeno הקשורים (וקטור AAV). מעגל זלוף המספק המודל הכבד 3D עם תקשורת מספק אמצעי קל ליישום הווקטור. המערכת מאפשרת ניטור של פרמטרים מטבוליים העיקריים של הכבד. עבור בסופו של דבר, דגימות רקמה שניתן לנקוט כדי לקבוע את מידת recellularization ידי טכניקות היסטולוגית. הפצה של וקטור וירוס וביטוי של transgene נמסר יכול להיות מנותח על ידי PCR כמותי (qPCR), סופג אימונוהיסטוכימיה המערבי. יישומים רבים של מודל הווקטור במחקר בסיסי בפיתוח יישומים רפואיים גן יכולים להיות שחזה, כוללים פיתוח תרופות אנטי רומן, חקר הסרטן, ואת המחקר של וקטורים ויראליים ותופעות הלוואי האפשריות שלהן.

להערכת מידת recellularization, קריו-סעיפים הוכנו מכל אונה של כל דגם כבד recellularized. הסעיפים נותחו לאחר מכן על ידי hematoxylin ו eosin מכתים. כפי שניתן לראות באיור 3, כל תנוך השלושה הדגמים הכבדים, המסומן כמו TLM1, TLM2 (transduced מודלים כבדים 1 +2) ו- Ctrl (דגם כבד פקד היה recellularized, אבל לא transduced), אוכלס מחדש עם תאי HepG2. שורת תאי קרצינומה hepatocellular זו הוקמה מרקמת הגידול של ילד ארגנטיני בן 15 שנה. באזורים מסוימים של המודלים הכבדים היו recellularized יותר אינטנסיבי יותר מאחרים. סיבות הווריאציות הללו להישאר שייקבעו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig3.jpg" /> איור 3. Hematoxylin ו eosin כתם של כל אונה של השלוש נתחו מודלים כבדים TLM1 + 2:. כבד transducedמודלים 1 ו -2; מודל הכבד מלא .: Ctrl כי היה recellularized אבל לא transduced. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (Re-מודפס באישור Ref. 8.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> בשלב הבא, התמרה של המודלים הכבדים הוערכה. לשם כך, DNA הוכן מ -28 ביופסיות אגרוף של כל אחד מן המודלים כבדים כייל הווקטור היה לכמת ידי qPCR. בממוצע, 55 ו -90 הגנום וקטור הפנימו לכל תא (VG / תא) נמדדו עבור שני המודלים הכבדים transduced. ניסויי תרבית תאי 2D הראו 30 VG / תא מספיק ביטוי transgene חזק והשתקה בתיווך RNAi. הפקה של EmGFP נותחה על ידי RT-PCR ו מערבי סופג. למעשה, הביטוי של עיתונאי זוהה 80-90% של ביופסיות על רמות ה- mRNA וחלבונים, בהתאמה.8 על מנת לקבל תמונה מקיפה של יעילות התמרה, קריו-סעיפים נותחו immunohistologically. כפי שניתן לראות באיור 4, באזורים של המודל הכבד שהיו recellularized בהצלחה, כמו מדמיינים ידי מכתים DAPI, גם נתנו אותות ניאון חזקים בניתוח immunohistochemical ביטוי EmGFP. כצפוי, המודל הכבד השליטה, שלא טופל ב- וקטורי AAV, לא הראה שום ביטוי EmGFP. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig4.jpg" /> איור 4. ניתוח immunohistochemical ביטוי EmGFP תאים אוכלסו מחדש המודלים הכבדים היו דמיינו ידי מכתים DAPI (כחול).; ביטוי EmGFP היה דמיין ידי מכתים חיסון ייחודי (אדום). TLM1 + 2: מודלים כבדים transduced 1 ו -2; מודל הכבד מלא .: Ctrl כי היה recellularized אבל לא transduced. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (Re-מודפס באישורמ Ref. 8.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> במבחן סופי, מציאה בתיווך AAV של hCycB נותחה על ידי qRT-PCR. המציאה של hCycB נמצאה בין 70 ל 90%, בממוצע לכל כל האונות של שני מודלים הכבדים transduced (איור 5). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig5.jpg" /> איור 5. מציאה בתיווך RNAi של hCycB במודלים הכבד 3D-transduced AAV. השתקת hCycB נקבע על ידי qRT-PCR. ערכים ממוצעים וסטיות תקן (SD) חושבו עבור כל הדגימות של כל דגם כבד 3D transduced (TLM1 ו -2, בהתאמה) ו מנורמל הערך הממוצע של השליטה הלא transduced (Ctrl.). (Re-מודפס באישור REF. 8.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

המטריצה החוץ-תאית של כבד חולדה נטול תאים יכולה לשמש כמודל ex vivo תלת מימדי אנושי כדי לחקור את התפוצה והביטוי הטרנסגני של נגיף או וקטור ויראלי.

לחקר ויראלי וקטורים בתוך אוכלס מחדש תלת מימדי הכבד דגם עם הקו Cell Carcinoma Hepatocellular האדם HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לפתח מודל כבד תלת-ממדי למחקר של וירוסים ווקטורים ויראליים. שיטה זו מאפשרת לחקור תהליכים ביולוגיים במערכת תלת-ממדית מועורקת (vascularized) עם תאים אנושיים, אשר פיזיולוגייתם שונה מזו של תאי מכרסמים במודלים של עכבר או חולדה. בנוסף, זהו צעד לשיפור רווחת בעלי החיים, שכן הדבר מונע ניסויים בבעלי חיים חיים ונועד, בטווח הארוך, להחליף באופן מלא רכיבים מבעלי חיים.אף על פי שפיתחנו שיטה זו כדי לחקור וקטורים ויראליים להעברה גנטית, ניתן ליישמה גם למחקר של נגיפים חיוניים זיהומיים ולתחומי מחקר אחרים כמו מחקר הסרטן. את הפרוצדורה תדגים ויולה רוהርስ (Viola Rohrs), טכנאית מהמעבדה שלי. למען רווחת בעלי החיים, במחקר הנוכחי נעשה שימוש בבעלי חיים עודפים בלבד שהוקרבו עבור ניסויים אחרים בבעלי חיים, כלומר:לא נדרשו בעלי חיים נוספים כדי להשיג את פיגומי הכבד. כדי להתחיל, ראשית הרחבו את שורת התאים הכבדית Hep G2. זרעו 15 מיליון תאים לבקבוקי T175 ב-30 milliliters של מצע המכיל 10% fetal calf serum ושני millimoles של gulatmine, penicillin, ו-streptomycin. לאחר ארבעה ימי תרבית, השתמשו בחשיפה של חמש דקות לתמיסת trypsin בתנאי תרבית כדי לשחרר את התאים, ולאחר מכן אספו אותם.לאחר מכן, סובב את התאים בצנטריפוגה ב-300 Gs למשך שלוש דקות. לאחר מכן, השהה אותם מחדש ב-4 milliliters של PBS ובצע ספירת תאים. כל בקבוק אמור להניב כ-45 מיליון תאים.נדרשים 600 מיליון תאים כדי לבצע רסלולריזציה (recellularization) של ECM של כבד חולדה. לצורך רסלולריזציה של ה-ECM, הגדירו תחילה את מערכת הביוריאקטור הכוללת תא פרפוזיה לכבד, מערכת פרפוזיה, מאגר מצע גידול ומלכוד בועות. ישנם שני שלבים קריטיים בהליך הרסלולריזציה.ראשית, יש להימנע כלואת בועות אוויר במערכת הפרפוזיה. שנית, יש לשמור על סטריליות של המערכת כולה. ראשית, עקרו רכיבים אלה של מערכת הביוריאקטור ב-121 °C למשך 15 דקות.שנית, מלאו את הצינורות ואת תא הפרפוזיה הסטרילי במצע. לאחר מכן, הניחו את פיגום כבד החולדה לאחר הסרת התאים (decellularized) בתוך תא הפרפוזיה לכבד. השלב הבא הוא שימוש בתפסני צינור כדי לחבר את הווריד הפורטלי הקנונלי למערכת הפרפוזיה.כעת הניחו את מערכת הביוראקטור בתוך האינקובטור וחברו אותה למשאבה פריסטלטית. לאחר מכן, בצעו שיווי משקל של הפיגום עם 150 milliliters של מצע מועשר למשך חמישה ימים. הגדירו את קצב הזרימה ל-1.25 milliliters לדקה.לאחר חמישה ימים, נתק את מערכת הביוריאקטור מהמשאבה והעבר אותה למנדף סטרילי. נתק את פיגום הכבד ממעגל המצע. לאחר מכן, טען מזרק בחמישה מיליליטר של מצע המכיל 300 מיליון תאי Hep G2 והזרק את התאים דרך הווריד השער (portal vein), תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר.לאחר מכן, יש לאפשר לתאים לאכלס מחדש את ה-ECM למשך שעה ללא הפעלת המשאבה. לאחר שעה, הפעילו את המשאבה בקצב של 1.25 milliliters per minute. לאחר 10 דקות, הגבירו את הלחץ ל-2.5 milliliters per minute.לאחר 20 דקות נוספות, כוון את המשאבה למהירות העבודה של 3.75 milliliters per minute. לאחר 30 דקות במהירות משאבה מלאה, כבה את המשאבה, הוסף 300 מיליון תאים נוספים, והנח לתאים לאכלס את ה-ECM למשך שעה. לאחר שעה, הגבר בהדרגה את הסירקולציה על ידי התאמות מדורגות של מהירות המשאבה כפי שבוצע קודם לכן.כעת אפשרו לתרבית לבצע רצולריזציה (recellularization) של הכבד לאורך שבועיים. מדי יומיים, החליפו 50 milliliters של המצע ומדדו את הפרמטרים הפיזיולוגיים מדגימה של המצע המשומש. ייצור של וקטורי AAV הוא הליך מורכב הכולל שלבים רבים המסוכמים בפרוטוקול הטקסט.בסרטון זה, מוצגים כמה מהשלבים המכריעים. ראשית, יש להפיק, לטהר ולכמת את וקטורי ה-AAV. בקצרה, הפק את וקטורי ה-AAV בבקבוקי גלגול (roller bottles) וטהר אותם באמצעות סנטריפוגציה במדרג iodixanol.הסר את שאריות ה-iodixanol באמצעות סינון בעמודי ג'ל סינון מסוג PD10. לאחר מכן, קבע את ריכוז וקטור ה-AAV באמצעות QPCR תוך שימוש ב-DNA גנומי של AAV כסטנדרט. נדרשים סך של 27 טריליון וקטורי AAV לכל מודל.כעת בצעו טרנסדוקציה למודל הכבד. ראשית, העבירו 27 טריליון וקטורים בחמישה מיליליטר של PBS לתוך מזרק. ניתן להוסיף Phenol red בריכוז של 5 micrograms per milliliter.לאחר מכן, נתקו את הכבד ממעגל המצע והזריקו את הווקטורים למערכת. לאחר ההזרקה, דגרו את המערכת למשך שעה אחת ללא שאיבה. לאחר מכן, הגבירו בהדרגה את הזרימה כפי שמתואר קודם לכן.בהמשך, בזמן שהכבד שעבר טרנסדוקציה מדוגר במשך שישה ימים, החליפו 50 milliliters של המצע בכל יום שני. בעזרת סכין מנתחים, חתכו דגימות מכל אונה של הכבד בעובי של כחצי סנטימטר ובאורך של 1.5 עד שני סנטימטרים. דגרו את הפרוסות ב-4%paraformaldehyde עם 4%sucrose למשך 90 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, שטפו את הדגימה שלוש פעמים ב-PBS למשך דקה לכל שטיפה. לאחר השטיפות, דגרו את הדגימות למשך הלילה ב-8% sucrose בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את הדגימות לתבניות הקפאה (cryomolds) המכילות מעט תוך מקבע.הימנעו מהכנסת בועות אוויר. לאחר הטעינה, כסו את הדגימות לחלוטין בתהליכי קיבוע והניחו אותן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. לאחר ההקפאה, הכינו חתכים קריוסטטיים בעובי 10 מיקרון מהדגימות באמצעות קריוטום.צבעו את הדגימות לפי הצורך כדי לאשש את הרקוולריזציה (recellularization). לצורך ניתוח ביטוי גנים, קחו דגימות באמצעות מחץ ביופסיה של ארבעה מילימטרים. כדי להעריך את הרקוולריזציה, נצבעו חתכים קריוסטטיים בהמטוקסילין ואאוזין.אונות משני כבדים שעברו טרנסדוקציה ומכבד בקרה אחד שעבר רסלולריזציה אך לא טרנסדוקציה, אוכלסו מחדש בתאי Hep G2. ביטוי RNA וכמות הווקטור (titre) נמדדו מ-28 ביופסיות מסוג punch מכל מודל כבד. בשני מודלי הכבד שעברו טרנסדוקציה, נמדדו 55 ו-90 גנומים של ווקטור לתא, כמות מספיקה של ווקטור כדי להשריץ השתקת גנים.כצפוי, לא נמדדו גנומים בביקורת. ביטוי של EmGFP נחקר באמצעות RT-PCR ו-western blotting. ברוב הביופסיות נצפה ביטוי mRNA של EmGFP וביטוי חלבון של EmGFP.צביעה אימונוהיסטוכימית של נתחים קפואים הראתה שבכל מקום שבו התבצעה רקולריזציה מוצלחת של המודל, ניתן היה לראות גם ביטוי של EmGFP. דבר זה מעיד על ביטוי גנים יעיל של AAV. לאחר מכן, נותח ה-knockdown של ציקלופילין B אנושי בתיווך AAV באמצעות quantitative RT-PCR.ההשתקה הממוצעת של cyclophilin B אנושי הייתה בין 70 ל-90% בכל האונות של שני הכבדים שעברו טרנסדוקציה. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים ללמוד על התהלוצות של וירוסים ווקטורים ויראליים במערכת איברים תלת-ממדית ומכוסה בכלי דם. מחקרים אלו יסייעו בשיפור הטכניקות הנוכחיות להעברת גנים ויעזרו בפיתוח אסטרטגיות אנטי-ויראליות חדשות.

study-viral-vectors-three-dimensional-liver-model-repopulated-with

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

במאמר זה, אנו מתארים את הזיהוי של adeno הקשורים וירוס סרוטיפ 3 (AAV3) כווקטור היעילה ביותר להכוונת האדם תאים סרטניים בכבד.

יעילות גבוהה התמרה של תאים סרטניים בכבד על ידי סרוטיפ Adeno-Associated וירוס רקומביננטי 3 וקטורים

נגיף הפטיטיס C (HCV) הוא פתוגן אנושי עיקרי הגורם להפרעות בכבד, כולל שחמת וסרטן. מערכת תרבית תאים זיהומית HCV חיונית להבנת המנגנון המולקולרי של שכפול HCV ולפיתוח גישות טיפוליות חדשות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לחקירת שלבים שונים של מחזור השכפול של HCV.

פרוטוקול לניתוח שכפול נגיף הצהבת מסוג C

כאן אנו מתארים מערכת הכתב החדש שפותח הפטיטיס B וירוס (HBV) לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור החיים HBV. זה פשוט יותר במערכת במבחנה יסייע ההקרנה של תרופות אנטי-HBV משתמש באסטרטגיה תפוקה גבוהה.

פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול

המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק מדריך צעד אחר צעד כדי לבצע ניסויים זיהום "כבד-על-שבב" תלת-ממדי עם הנגיף הפטיטיס B.

"כבד-על-שבב" תרבויות של ראשי Hepatocytes ותאים Kupffer על זיהום בנגיף הפטיטיס B

פרוטוקול זה נועד לתאר hepatocyte חזירי בידוד ו- ex-vivo המסירה הגן כדי לרפא את הדגמים של מחלות מטבוליות באמצעות השתלת תאים עצמיים. אף על פי המודל הזה נהנה יתרונות ייחודיים לטובת טיפול מוצלח, היישום הוא בסיס רלוונטי להתייחס אינדיקציות ומחלות נוספות.

Lentiviral בתיווך וקטור ריפוי גנטי של Hepatocytes לשעבר Vivo עבור השתלת עצמיים של החזירים

מתוארים כאן היא שיטה יעילה כיצד לייצר מניות סיכוייו גבוהה ויראלי של וירוס הפטיטיס E (האוהב) כדי להדביק ביעילות תאים hepatoma. עם השיטה המוצגת, הן לא מעטפת, כמו גם חלקיקים ויראלי מעטוף ניתן לקצור ומשמש לצורך הצגת קווי תאים שונים.

מודל תרבות התא להפקת צהבת מניות וירוס מסוג Titer גבוהה

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור הפטיטיס B וירוס (HBV) זיהום בתאי 293T מהונדסים הרומן (293T-NE-3NRs, הבעת NTCP אנושי, HNF4α, RXRα ו PPARα) ותאי הכבד המסורתית (HepG2-NE, ביטוי האדם NTCP).

דוגמנות דלקת כבד B וירוס ב-t-הפטיטיס 293T-NE-3NRs תאים

פרוטוקול זה מציג מודל ביומימטי תלת מימדי עם תא סטרומה פיברוטית נלווית. מוכן עם הידרוג'לים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ביחסים המחקים את התכונות הביו-פיזיקליות של המטריצה החוץ-תאית הסטרומלית, מתווך פעיל של אינטראקציות תאיות, צמיחת גידולים וגרורות.

מודל ביומימטי לסרטן הכבד לחקר אינטראקציות גידול-סטרומה בסביבה תלת מימדית עם תכונות ביו-פיזיקליות מתכווננות

מודלים מקיפים במבחנה המשיבים נאמנה את המחלה האנושית הרלוונטית חסרים. המחקר הנוכחי מציג יצירה ותרבות תלת מימדית של גידול תלת מימדי(תלת-ממדי), כלי הפריה אמין לחקר האינטראקציה בין הגידול לסטרומלי בקרצינומה הפטוקולרית האנושית.

מודל ספרואידי תלת מימדי לחקר האינטראקציה בין גידולים סרטניים בקרצינומה הפטוקולרית

אנו מציגים פרוטוקול לסינון תרכובות נגד נגיף הפטיטיס B (HBV) המכוונות לשלבי מחזור החיים של הכניסה לפני ואחרי הנגיף, תוך שימוש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית למדידת זיקה קושרת (KD) עם פוליפפטיד קו-טרנספורטינג של נתרן טאורוכולאט מארח. היעילות האנטי-ויראלית נקבעה באמצעות דיכוי סמני מחזור חיים נגיפיים (היווצרות cccDNA, שעתוק והרכבה ויראלית).

מודל הפטוציטים מוסמך הבוחן את כניסת נגיף הפטיטיס B דרך נתרן טאורוחולאט קוטרנספורטינג פוליפפטיד כמטרה טיפולית

אורגנואידים מחוללים מהפכה במידול רקמות מותאם אישית לפיתוח איברים, גילוי תרופות וחקר מחלות. הנדסת אורגנואידים מתקדמת ליצירת רקמות סינתטיות מורכבות. המטרה היא לשלב מורפוגנזה, טכנולוגיית אסמבלואידים וביומטריצות כדי לקדם את הנדסת הרקמות. פרוטוקול זה מסייע במידול אורגנוגנזה בכבד ובקביעת הנחיות לבניית רקמות סינתטיות.

טכניקות גידול במבחנה למידול אורגנוגנזה של כבד, בניית מכלולים ותכנון רקמות סינתטיות באמצעות קווי תאים אנושיים

חקור וקטורים ויראליים במודל כבד תלת-ממדי מחודש בתאי HepG2 אנושיים. שיטה זו מאפשרת מחקר ביולוגי במערכת וסקולרית תוך שיפור רווחת בעלי חיים והחלפת ניסויים בחיות חיים.

לחקר ויראלי וקטורים בתוך אוכלס מחדש תלת מימדי הכבד דגם עם הקו Cell Carcinoma Hepatocellular האדם HepG2

גלה סרטונים נוספים