פרוטוקול לניתוח שכפול נגיף הצהבת מסוג C

נגיף הפטיטיס C (HCV) הוא פתוגן אנושי עיקרי הגורם להפרעות בכבד, כולל שחמת וסרטן. מערכת תרבית תאים זיהומית HCV חיונית להבנת המנגנון המולקולרי של שכפול HCV ולפיתוח גישות טיפוליות חדשות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לחקירת שלבים שונים של מחזור השכפול של HCV.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור שלבים שונים של מחזור השכפול של נגיף הפטיטיס C. זה מושג על ידי יצירת RNA גנומי HCV לראשונה, תעתיקים ממבני פלסמיד HCV לינאריים. השלב השני הוא להעביר את התאים עם H-C-V-R-N-A.

לאחר מכן, התאים מצופים לנקודות זמן ומבחנים שונים. השלב האחרון הוא לאסוף את תרבית התאים למדידת טיטר ויראלי ולקצור תאים שעברו טרנספטציה לחלבון ו-RNA. בסופו של דבר מבוצעים שעתוק הפוך, בדיקת אימונופלואורסצנטיות PCR Western Blotting וטיטר HCV ומדגימים מערכת תרבית תאים זיהומית HCV חזקה.

היתרון העיקרי של מערכת תרבית תאים זיהומית זו של נגיף הפטיטיס C על פני מערכת הרפליקנטים של HCV הוא שניתן לחקור את שלבי ההרכבה והיציאה של הכניסה והיציאה של הנגיף. פרוטוקול זה יכול לעזור לענות על שאלות המפתח בתחום הווירולוגיה של הפטיטיס C, כגון ויון, מורפוגנזה ואינטראקציה של פתוגן. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על פיתוח חיסון מכיוון שהיא מאפשרת אפיון של זנים נגיפיים מוחלשים שניתן להעריך כמועמדים פוטנציאליים לחיסון.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי נגיף הפטיטיס C, ניתן ליישם אותה גם על נגיפי RNA אחרים במשפחת המעבדה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתמודדו עם האתגר של יצירת מחקר RNA גנומי HCV באיכות גבוהה. מחזור השכפול המלא של HCV הפך לאפשרי בתרבית תאים בעקבות גילוי גנוטיפ שני הפטיטיס יפנית פולמיננטית A HCV.

הדגמה ויזואלית של בדיקה וירולוגית היא קריטית מכיוון שהבדיקה תדרוש מומחיות בטכניקות מולקולריות ותאיות כאחד באמצעות נגיף כימרי תוך-גנוטיפ שניים, F-N-X-H-C-V ו-F-N-X-H-C-V סקר HCV אפס להערכת שכפול נגיפי. ליניאריזציה של פלסמידים נגיפיים שנוצרו בעבר על ידי עיכול עם אנזים הגבלה אחד XBA בצינור של שני מיליליטר. לאחר מכן טפל בפלסמידים עם נוקלאז שעועית מונג כדי ליצור קצוות קהים.

טהר את הפלסמידים המעוכלים על ידי כרומטוגרפיה של חילופי אניונים. ודא את תקינות הפלסמיד הליניארי על ידי הכפפת DNA לאלקטרופורזה של ג'ל AROS. לאחר מכן, הוסף את תבנית ה-DNA של הפלסמיד הליניארית לצינור של 0.2 מיליליטר המכיל רכיבי תגובת RNA פולימראז T שבעה כדי לסנתז תעתיקי RNA גנומיים של HCV.

טהר את ה-DNA החדש שטופל ב-RNA באמצעות ערכת טיהור RNA. לאחר מכן אמת את ייצור ה-RNA על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוס. לאחר מכן, כמת את ה-RNA על ידי פוטומטריה ספקטרלית.

נתק HU שבעה תאים דבקים מבוססים באמצעות טיפול באנזים טריפסין ואסוף את התאים לחרוט של 50 מיליליטר. שניים לאחר החייאת צנטריפוגה. השעו את כדור התא בתקשורת סרום נמוכה קרה לאחר חזרה על הצנטריפוגה, השעו מחדש את התאים במדיה נמוכה בסרום בפעם אחת 10 לשבעת התאים למיליליטר.

לאחר מכן, מערבבים בסך הכל 10 מיקרוגרם של RNA ויראלי מתומלל עם 400 מיקרוליטר של תאים מושעים לתוך וטרינר אלקטרופורציה מקורר מראש של 0.4 סנטימטר ומעביר את ה-RNA הנגיפי לתאים באמצעות אלקטרופורציה ב-270 וולט, 100 אוהם ו-950 מיקרו-ברזלים. בסיום, השעו מחדש את התאים האלקטרופוטרים ב-10 מיליליטר של מצע גידול מלא עם 15% FBS בשלב זה, צלחו את התאים בשני צלוחיות T 25 בערך פי 1.2 כפול 10 לששת התאים לבקבוק ו-48 צלחות באר בפעם אחת 10 לתאים הרביעיים לבאר למשך 4 נקודות זמן של 48 ו-96 שעות. החלף את המדיה ארבע עד שמונה שעות לאחר ההעברה במצע גידול טרי בתוספת FBS של 10% כדי להסיר פסולת תאים מתים מהצלוחיות והצלחות המתורבתות.

באמצעות פיפטה סרולוגית קצרו את הסופרנטנטים של תרבית התאים בנקודות הזמן של 48 N 96 שעות לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן הסר פסולת תאית מהדגימות שנאספו על ידי צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס לאחר צנטריפוגה. אחסן את הסופרנטנטים נטולי התאים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.

לייק את התאים לניתוח חלבון ו-RNA על ידי כתם מערבי ושעתוק הפוך PCR כמותי או R-T-Q-P-C-R בנקודות הזמן שצוינו. תמלל הפוך מיקרוגרם אחד של RNA תאי כולל באמצעות אנזים טרנסקריפטאז הפוך ופריימר ספציפי לגדיל החישה HCV שנקשר לחמשת האזורים הראשוניים הלא מתורגמים בשפופרת של 0.2 מיליליטר. כמו כן, תמלל הפוך F-N-X-H-C-V-R-N-A של עותקי גנום ידועים באמצעות פריימר גדיל חישה HCV באמצעות מערכת PCR בזמן אמת.

בצע QPCR על ידי שימוש ב-50 ננוגרם של CD NA המתועתק שנוצר באמצעות פריימרים ספציפיים של HCV וצבע ירוק קושר DNA המכיל תערובת סופר QPCR. השתמש בתנאים הבאים בעת הפעלת QPCR כדי לקבוע את מספר העותק H-C-V-R-N-A לאחר QPCR. לפתור את ליזאט התא מה-RNA הנגיפי שהועבר לאחר 96 שעות.

פרסם טרנספקציה באמצעות דף SDS. לאחר מכן העבירו את החלבונים שנפתרו בג'ל לקרום פולי גפן די פלואוריד בשיטת טורבו חלקת טרנס. יש לחסום את הממברנה באמצעות תמיסת חסימה המכילה 5% חלב דל שומן ו-0.2% בין 20 ב-PBS ולהניח במיכל.

דגרו את הממברנה עם נוגדן חד שבטי ראשוני של עכבר ו-S3 בדילול של 1 ל-1000 ובטא אקטין בדילול של 1 ל-5,000 בחדר קירור של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הוסף אימונוגלובולין עיזים נגד עכבר G מצומד לפרוקסידאז צנון סוסים בדילול של אחד ל-5,000 וגלה על ידי כימילומינסנציה. בשלב זה, תקן את התאים שעברו טרנספטציה H-C-V-R-N-A באמצעות מתנול למשך 30 דקות ב-20 מעלות צלזיוס שליליות לבדיקת האימונופלואורסצנטיות.

בסיום, שטפו את התאים עם PB S3 פעמים לאחר חסימה עם מבחן אימונופלואורסצנטי חוסם חיץ השתמש בארנב פוליקלונלי אנטי NS חמש נוגדן ראשוני ונוגדני RNA חד שבטי נגד DS J שתיים בדילול של 1 עד 200 ודגירה במשך חמש שעות עד לילה בחדר קר של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים ב-PB S3 פעמים לאחר הנוגדן הראשוני. לאחר מכן הוסיפו נוגדן משני פוליקלונלי נגד ארנב עיזים G 4 8 8 נוגדן משני פוליקלונלי ונוגדן משני פוליקלונלי נגד מוזה 5 9 4 בדילול של 1 ל-1000 ודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר על נדנדה על השולחן.

לאחר שטיפת התאים עם PB S3 פעמים מכתים את הגרעינים באמצעות הרקס וצופים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הגוון הנאיבי הבא של הצלחת, 7.5 0.1 תאים בערך פי שלושה כפול 10 לתאים השלישיים לבאר. באמצעות צלחת של 96 בארות למחרת, בצע דילול סדרתי פי עשרה של סופרנטנט תרבית נטול תאים שנקטף מתאים שעברו טרנספטציה H-C-V-R-N-A באמצעות מצע גידול וחסן במשולש על הגוון.

7.5 0.1 תאים מקבעים את התאים 72 שעות לאחר ההדבקה באמצעות מתנול למשך 30 דקות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס לאחר הוצאת התאים מכתם האמינו של המקפיא עבור חלבון H-C-V-N-S 5A באמצעות התנאים שתוארו קודם לכן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ספרו את חמשת ה-NS, מוקדי תאים חיוביים בבאר עם הדילול הנגיפי הגבוה ביותר וחישבו את המספר הממוצע של יחידות יוצרות מיקוד למיליליטר. איכות הפלסמיד הליניארית של HCV הוערכה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל.

ה-H-C-V-D-N-A היה נתון ל-T 7 RNA פולימראז בתיווך שעתוק מבחנה, שהניב תוצר RNA יחיד ב-9.6 קילו-בסיסים. R-T-Q-P-C-R התוצאות הצביעו על כך שהנגיף מסוג הבר משכפל את הגנום ביעילות. הסוג הפראי הפגין רמה גבוהה יותר של שכפול גנום ב-1 עד 3 לוג בהשוואה לנגיף האפס

הנגיף מסוג הבר ייצר את חלבון ה-NS 3 המעורב בפיצול חלבון ויראלי ושכפול הגנום. הנגיף מסוג הבר ביטא גם NS 5 חלבון ו-NS 5 חלבון ו-RNA דו-גדילי הממוקם בציטופלזמה התאית של תאים שעברו טרנספטציה מסוג בר, מה שמרמז על מדידות טיטר של נגיף השכפול הנגיפי הפעיל הצביעו על כך שהנגיף מסוג הבר הוא מדבק ומייצר למעלה מ-10,000 יחידות יוצרות מוקדים למיליליטר של חלקיק זיהומי בשש שעות לאחר הטרנספקציה. גם לנגיפי הפרא וגם לנגיפי האפס הקוטביים היו פעילויות לוציפראז דומות המצביעות על רמת קלט דומה של טרנספטד.

עם זאת, RNA תורגם 48 שעות ו-96 שעות לאחר הטרנספקציה. הנגיף מסוג הבר הראה רמות שכפול גנום מוגברות בהשוואה לנגיף האפס. הנגיף מסוג הבר ייצר גם חלבון NS 3 נגיפי.

לנגיף האפס של הסקר הייתה פעילות לוציפראז ברמת הבסיס, ואילו לנגיף מסוג הבר הייתה רמת שכפול גבוהה פי שניים עד שלושה בהשוואה לנגיף מדווח אפס סקר. לאחר שליטה בהפטיטיס TC, ניתן לבצע בדיקות וירולוגיות תוך שבועיים אם הן מבוצעות כראוי בזמן ניסיון הליך זה, חשוב שיהיו תאים חזקים ותעתיקי RNA גנומיים באיכות גבוהה של HCV. בעקבות הליך זה, ניתן לבדוק את זני ה-HCV המאפיינים במערכות מודל של בעלי חיים כדי לחקור את הכושר in vivo ואת האינטראקציות של פתוגן המארח.

הפיתוח של מערכת תרבית תאי HCV זיהומית סלל את הדרך לחוקרים לחקור את שלבי הוויריון, המורפוגנזה והיציאה הנגיפית של מחזור השכפול של HCV. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בדיקות וירולוגיות שונות לאפיון שלבים שונים במחזור השכפול של נגיף הפטיטיס C. אל תשכח שעבודה עם נגיף הפטיטיס C עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים בעת ביצוע הליך זה.