מדידת פונקציונליות צומת עצב-שריר

המטרה הכללית של הליך זה היא לחקור את התפקוד של המפגש העצבי-שרירי (neuromuscular junction) באמצעות גישה ניסויית ex vivo. זאת על ידי גירוי של הרכיב העצבי-שרירי בשתי דרכים: ישירות על קרום השריר ובאמצעות העצב. מכיוון שגירוי הקרום עוקף את סיגנל התמסורת העצבית, ניתן לראות בכל הבדל בין שתי התגובות התכווצות כמדידה עקיפה של תפקוד המפגש העצבי-שרירי.

כאן אנו מציגים את הפרוצדורה בהכנה של עצב סיאטיק ושריר סולאוס (soleus). השריר מבודד יחד עם העצב שלו ומונח בתוך אמבט רקמה עם זרימה (perfused tissue bath). הוא מקובע לבקר כוח ואורך, וזוג אלקטרודות פלטינה ממוקמות במקביל לשריר.

לאחר מכן, מקרבים אלקטרודת יניקה מזכוכית לקצה החתוך של העצב. לאחר מכן, מיושם פרוטוקול בדיקה מקיף כדי להעריך ביסודיות הן את הצומת העצבי-שרירי והן את תפקוד השריר. החיבור התפקודי בין השריר לעצב מהווה מסקנה עבור שני החלקים ושני השברים השורדים.

באזור הראשון של רמה זו בכל אחת משתי רקמות התקשורת הללו נמצאים צמתי עצב-שריר (neuromuscular junction), המציגים בדרך כלל מורפולוגיה דמוית לחץ. עם זאת, במספר מצבים פתולוגיים, התפקוד המשותף בין השריר לעצב נפגע קשות וצמתי העצב-שריר מאבדים את הארגון המורפולוגי המורכב שלהם. המטרה הכללית של הפרוצדורה שלנו היא לבחון את התפקוד של צמתי העצב-שריר באמצעות גישה ניסויית ex vivo.

פעולה זו מבוצעת על ידי גירוי של תכשיר עצב השריר בשתי דרכים. הראשונה באמצעות גירוי ישיר של ממברנת השריר, והשנייה באמצעות גירוי העצב ובדיקת תכונות השריר. הדליקו את אמבט המים עם הסירקולציה וכווןו את הטמפרטורה ל-30 degrees celsius.

מלאו את האמבט בתמיסת Krebs-Ringer. אפשרו לערבוב גזים בלחץ של 0.4 bar לזרום דרך ה-oxitube אל תוך האמבט. הפעילו את המתמר של המפעיל ואת שני מעוררי הפולסים.

הגדירו את ערכי הזרם ל-300 מיליון זוגות עבור גירוי הממברנה ולחמישה מיליון זוגות עבור גירוי העצב. לאחר הקטלת העכבר באמצעות פריקה צווארית, הסירו את העור מהרגליים. כעת חתכו את גיד האכילס ובזמן לחיצה חזקה על הגיד, משכו את שריר הגסטרוכנמיוס ואת שריר הסולאוס יחד כלפי מעלה.

לאחר חשיפת הגיד הפרוקסימלי של שריר ה-soleus, יש לחתוך את כל השריר התאומים מעליו ולהעביר במהירות את הדגימה לאמבט רקמות להכנה הממוקם מתחת למיקרוסקופ הסטריאו. באמצעות פינצטה, יש לתפוס בחוזקה את הגיד הפרוקסימלי של ה-soleus ולמשוך אותו בעדינות כדי לחשוף את העצבים של עצב ה-sciatic. לאחר חשיפת העצבים, יש להסיר את הרקמות שסביבם כדי לחשוף כ-5 מילימטרים של העצב.

לאחר מכן, השתמשו במספריים עדינים כדי לחתוך בזהירות את העצב. השלימו את כריתת השריר והעצב על ידי חיתוך גיד אכילס כדי להפריד את שריר הסולאוס (soleus) משריר הגסטרוknמיאוס (gastrocnemius). כעת, תכשיר השריר והעצב מוכן להרכבה על מכשיר הבדיקה.

צרו קשר החלקה בקצה חוט הניילון והדקו אותו סביב גיד אכילס. קבעו את החלק הפרוקסימלי של הגיד בתוך התפסן הקבוע וקשרו את חוט הניילון סביב זרוע המנוף של חיישן הכוח. אפשרו לשריר להגיע לשיווי משקל בתוך התמיסה.

כדי לקבוע את האורך האופטימלי הראשוני, גרה את השריר באמצעות סדרה של פולסים בודדים תוך שינוי עדין של ערך עומס הזחילה (creep load). האורך האופטימלי מושג כאשר כוח העווית (twitch force) הוא מקסימלי. מקם את אלקטרודות היניקה בקרבת השריר ומשוך את העצב פנימה.

לאחר מכן, תוך שינוי עדין של ערך זרם הפולס, גרה את השריר באמצעות סדרה של פולסים בודדים. כוח העקירה (twitch force) שייווצר בשריר בעת גירוי דרך העצב צריך להיות שווה לערכים שנמדדו בעת גירויו על הממברנה. ברגע שנקבע ערך הזרם האופטימלי, דחף את העצב החוצה מהאלקטרודה והעבר מספר פולסי זרם.

אם כמות הזרם שנבחרה מראש היא גבוהה מדי, פולסי הזרם המועברים דרך אלקטרודת השאיבה גורמים לכיווץ השריר על ידי הולכת זרם דרך האמבט. באמצעות תוכנה שהוכנה במעבדה, פיתחנו פרוטוקול בדיקה אוטומטי לחקר תפקודה של הצומת העצבי-שרירי בשריר ה-soleus. הפרוטוקול נמשך כ-65 דקות ומורכב מארבעה חלקים שונים.

בחלק הראשון, השריר מעורר באמצעות ארבעה פולסים בודדים. שניים מועברים באופן ישיר ושניים דרך העצב. לאחר מכן, נמדדים תגובות העירור (twitch responses) כדי לקבוע את הזמן לשיא, זמן חציית ההרפיה, הערך המקסימלי של נגזרת הכוח וכוח העירור.

בחלק השני, השריר מעורר באמצעות סדרה של רכבות דחפים (pulse trains) בטווח שבין 20 hertz ל-80 hertz, המהווה את התדר הטטני. זאת על מנת לחשב עקומות כוח-תדר עבור גירוי של העצב וגירוי ישיר של השריר. בחלקים השלישי והרביעי של הפרוטוקול, השריר נחשף לשתי פרדיגמות של עייפות כדי למדוד כשל בהעברה עצבית ועייפות תוך-טטנית.

במהלך פרגדימות עייפות אלה, השריר מעורר באופן רציף באמצעות רצף פולסים אחד המועבר לממברנה, ולאחריו 14 רצפי פולסים המועברים דרך העצב. הרצף כולו חוזר על עצמו 20 פעמים. הפרגדימה הראשונה מועברת בתדר ירי של 35 hertz.

השני בתדירות טטנית של 80 hertz. מקובל להאמין כי כשל בהעברה עצבית ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות עייפות, שכן הוא קשור לחסימה חיצונית של התפשטות פוטנציאל הפעולה, לירידה בשחרור המוליכים העצביים ולירידה בעירור של צומת העייפות.

בסוף הפרוטוקול, נמדדים אורך השריר ונשקלו נטו באמצעות קליפר אנלוגי ומאזניים מדויקים כדי לחשב את שטח החתך של השריר. מחקרים על מודל העכבר הטרנסגני SOD1 של נשירה מוטורית לצדית (amyotrophic lateral sclerosis) הדגישו את הפוטנציאל של מתודולוגיה זו. למעשה, שרירי ה-soleus הטרנסגניים מראים תגובה התכווצותית מופחתת הן עבור נגזרת הכוח והן עבור הכוח הטטני בעת גירוי ישיר, והפחתה גדולה אף יותר בעת גירוי דרך העצב.

בנוגע לכוח הטטני, למשל, ניסויים אלה הראו כי כיווצות השריר אחראית ל-25% מהנזק, בעוד ש-45% נוספים קשורים לפגמים בהעברה העצבית. נקודה מעניינת נוספת היא היעדר כל הבדל בשרירי הבקרה כאשר הם עומדים לגירוי ישיר או עקיף. ממצא זה מוכיח כי המתודולוגיה אינה גורמת לארטפקטים טכניים כלשהם, שכן הצומת העצבי-שרירי צפוי להיות תפקודי לחלוטין בבעלי החיים מקבוצת הבקרה.

בכל הנוגע לעייפות תוך-טטנית, התוצאות הראו ערכים נמוכים משמעותית בשרירי soleus טרנסגניים מאשר במקביליהם בקבוצת הביקורת. מעניין לציין כי שריר soleus טרנסגני נפגע באופן משמעותי מעירור חוזר, מה שאומר שניתן להעריך את התפקוד של המעבר העצבי-שרירי למשך זמן גירוי מקסימלי של שמונה דקות. לאחר שמונה דקות, השריר הטרנסגני חוזר לערך כוח כמעט אפסי כאשר הוא מעורר.

לאחר צפייה בסרטון, עליכם להבין כיצד למדוד את התפקוד של הצומת העצבי-שרירי ואת שריר הסולאוס (soleus) של עכבר. בהינתן שטכניקה זו מבוססת על מדידה עקיפה של תפקוד הצומת העצבי-שרירי, היא אינה מאפשרת לקבוע אם הפגמים המדווחים קשורים לשינויים מורפולוגיים או ביוכימיים. מאידך, גישה זו מהווה דרך חיונית להעריך האם פגיעות אלו משפיעות על התפקוד הממשי של אות ההולכה העצבית.

לבסוף, ניתן להתאים בקלות את הצעת הפרוטוקול למדידת התפקוד של הצומת העצבי-שרירי של הסרעפת, שריר נוסף המעורב לעיתים קרובות במחלות פתולוגיות.