מדידת פונקציונליות צומת עצב-שריר

הערכה תפקודית של צומת עצב-שריר (NMJ) יכול לספק מידע חיוני על התקשורת בין שריר ועצב. כאן נתאר פרוטוקול להעריך באופן מקיף פונקציונליות NMJ והן שריר באמצעות שני תכשירים שריר-עצב שונים, קרי הסוליה-פציעה, דיאפרגמה-הסרעפת.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את פונקציונליות הצומת העצבי-שרירי באמצעות גישה ניסויית ex vivo. זה מושג על ידי גירוי הכנת עצב השריר בשתי דרכים, ישירות על קרום השריר ודרך העצב. מכיוון שגירוי הממברנה עוקף איתות שידור עצבי, כל הבדלים בין שתי תגובות ההתכווצות יכולים להיחשב כמדידה עקיפה של פונקציונליות הצומת העצבי-שרירי.

כאן אנו מציגים הליך זה בהכנת עצב סיאטי לסוליה. השריר מנותח יחד עם העצב שלו ומכניס אותו לאמבטיית רקמות. הוא מקובע לבקר כוח ואורך וזוג אלקטרודות פלטינה ממוקמות במקביל לשריר.

לאחר מכן אלקטרודת יניקה מזכוכית מועברת קרוב לקצה החתוך של העצב. לאחר מכן מיושם פרוטוקול בדיקה מקיף כדי להעריך ביסודיות הן את הצומת העצבי-שרירי והן את תפקוד השרירים. הקשר התפקודי בין השריר לעצב הוא מסקנה הן עבור החלק והן עבור שני הפלגים ששרדו.

באזור הראשון של הרמה של כל אחת משתי הרקמות מתקשרים כי הצומת העצבי-שרירי הללו, שבדרך כלל מציג לחץ כמו מורפולוגיה. עם זאת, במספר מצבים פתולוגיים הפונקציונליות המופעלת בין השריר לעצב נפגעת קשות והצומת העצבי-שרירי מאבד את הארגון המורפולוגי המורכב. המטרה הכוללת של ההליך שלנו היא לחקור פונקציונליות של צומת עצבי-שרירי על ידי שימוש בגישה ניסויית ex vivo.

זה מושג על ידי גירוי הכנת עצב השריר בשתי דרכים. האחד על ידי גירוי ישיר של קרום השריר והשני על ידי גירוי העצב וניתוח תכונות השריר. הפעל את אמבט המים במחזור והתאם את הטמפרטורה ל -30 מעלות צלזיוס.

מלאו את האמבטיה בתמיסת קרבס-רינגר. אפשר לנקודה O ארבע בר של תערובת גז לזרום דרך החמצון ולתוך האמבטיה. הפעל את מתמר המפעיל ואת שני ממריצי הדופק.

הגדר את הערכים הנוכחיים ל-300 מיליון זוגות עבור גירוי הממברנה ולחמישה מיליון זוגות עבור הגירוי העצבי. לאחר הקרבת העכבר על ידי פריקת צוואר הרחם, הסר את העור מהרגליים. כעת חותכים את גיד אכילס ותוך כדי הידוק חזק של הגיד, משוך את שריר הגסטרוקנמיוס ואת הסוליה יחד כלפי מעלה.

לאחר חשיפת הגיד הפרוקסימלי של הסוליה, חתכו את כל העגל מעליו והניחו במהירות את הדגימה באמבט הרקמות המכין הממוקם מתחת למיקרוסקופ הסטריאו. בעזרת זוג מלקחיים, מהדקים בחוזקה את הגיד הפרוקסימלי של הסוליה ומושכים אותו בעדינות כדי לחשוף את העצבוב הסיאטי. לאחר חשיפת העצבוב, הסר את הרקמות שמסביב כדי לחשוף כחמישה מילימטרים של העצב.

לאחר מכן השתמש במספריים עדינים כדי לחתוך בזהירות את העצב. השלם את כריתת השריר, העצב על ידי חיתוך גיד אכילס כדי להפריד את הסוליה מהגסטרוקנמיוס. כעת השריר, הכנת העצבים מוכנה להרכבה על מכשיר הבדיקה.

צור קשר החלקה בקצה חוט הניילון והדק אותו סביב גיד אכילס. מהדקים את הגיד הפרוקסימלי בתוך המהדק הקבוע וקושרים את חוט הניילון סביב זרוע המנוף של מתמר הכוח. אפשר לשריר להתאזן בתמיסה.

כדי לקבוע את האורך האופטימלי הראשוני, עורר את השריר בסדרה של פולסים בודדים תוך שינוי עדין של ערך עומס הזחילה. האורך האופטימלי מתקבל כאשר כוח העווית הוא מקסימלי. הנח את אלקטרודות היניקה ליד השריר ומשוך את העצב פנימה.

לאחר מכן, תוך שינוי עדין של ערך זרם הדופק, עורר את השריר בסדרה של פולסים בודדים. כוח העווית שנוצר על ידי השריר כאשר הוא מגורה דרך העצב צריך להיות שווה לערכים הנמדדים בעת גירויו על הממברנה. לאחר קביעת ערך הזרם האופטימלי, דחוף את העצב החוצה מהאלקטרודה והעביר כמה פולסים זרמים.

אם כמות הזרם שנבחרה בעבר מוגזמת, פעימות הזרם המועברות דרך אלקטרודת היניקה מעוררות את התכווצות השרירים על ידי הולכת זרם דרך האמבטיה. באמצעות תוכנה תוצרת בית פיתחנו פרוטוקול בדיקה אוטומטי לחקר פונקציונליות הצומת העצבי-שרירי של הסוליה. הפרוטוקול נמשך כ-65 דקות ומורכב מארבעה חלקים שונים.

בחלק הראשון, השריר מגורה בארבעה פולסים בודדים. שניים מועברים ישירות ושניים דרך העצב. זמן לשיא, חצי זמן הרפיה, הערך המקסימלי של נגזרת הכוח וכוח העווית נמדדים לאחר מכן מתגובות העווית.

בחלק השני, השריר מגורה בסדרה של רכבות דופק הנעות בין 20 הרץ ל-80 הרץ, שהוא תדר הטטניק. כדי לחשב את הכוח, עקומות תדר הן לגירויים עצביים והן לגירויים ישירים. בחלקים השלישי והרביעי של הפרוטוקול השריר נתון לשתי פרדיגמות עייפות כדי למדוד כשל בהולכה עצבית ועייפות תוך טטנית.

במהלך פרדיגמות עייפות אלה, השריר מגורה באופן רציף עם רכבת דופק אחת המועברת על הממברנה ואחריה 14 רכבות דופק המועברות דרך העצב. הרצף כולו חוזר על עצמו 20 פעמים. הפרדיגמה הראשונה מועברת בתדר ירי של 35 הרץ.

השני בתדר הטטני של 80 הרץ. מאמינים כי כשל בהולכה עצבית ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות עייפות מכיוון שהוא קשור לחסימה החיצונית של התפשטות פוטנציאל הפעולה, ירידה בשחרור המשדר וירידה וריגוש הצלחת של יכולת עייפות הצומת. היבט נוסף של יכולת עייפות הצומת העצבי-שרירי מתבטא בבירור בעייפות אינטרטנית שהיא הערכה של יכולת השריר לשמור על כוח במהלך התכווצות טטנית בודדת ומשקפת עייפות בתדירות גבוהה.

בסוף הפרוטוקול, אורך ומשקל השריר נטו נמדדים באמצעות קליפר אנלוגי וסולם דיוק לחישוב שטח חתך השריר. מחקרים על מודל העכבר הטרנסגני SOD1 של טרשת אמיוטרופית צידית הדגישו את הפוטנציאל של מתודולוגיה זו. למעשה, שרירי הסוליה הטרנסגניים מניבים תגובת התכווצות מופחתת הן עבור נגזרת הכוח והן עבור הכוח הטטני כאשר הם מגורים ישירות והפחתה גדולה עוד יותר כאשר הם מגורים דרך העצב.

באשר לכוח טטני, למשל, ניסויים אלה הראו כי התכווצות השרירים אחראית ל-25% מהנזק בעוד ש-45% נוספים קשורים לפגמים בהולכה עצבית. נקודה מעניינת נוספת היא היעדר כל הבדל בשרירי הבקרה כאשר מגורים באופן ישיר או עקיף. ממצא זה מוכיח שהמתודולוגיה אינה מעוררת ממצאים טכניים כלשהם מכיוון שהצומת העצבי-שרירי צפוי להיות מתפקד באופן מלא בחיות ביקורת.

באשר לעייפות אינטראטנית, התוצאות הראו ערכים נמוכים משמעותית בשרירי הסוליה הטרנסגניים מאשר במקביליהם לביקורת. מעניין ששריר הסוליה הטרנסגני נפגע משמעותית על ידי גירוי חוזר, מה שאומר שניתן להעריך את תפקוד הצומת העצבי-שרירי לזמן גירוי מקסימלי של שמונה דקות. לאחר שמונה דקות, השריר הטרנסגני חוזר לערך כמעט אפסי של כוח כאשר הוא מגורה.

לאחר הצפייה בסרטון היית אמור להבין כיצד למדוד פונקציונליות צומת עצבי-שרירי ושריר סוליה של עכבר. בהתחשב בכך שטכניקה זו מבוססת על מדידה עקיפה של פונקציונליות הצומת העצבי-שרירי, היא אינה מאפשרת לבצע כאשר פגמים מדווחים קשורים לשינויים מורפולוגיים או ביוכימיים. מצד שני, גישה זו מייצגת דרך חיונית להעריך אם תוקפנות זו משפיעה על תפקוד המשתמש של אות השידור העצבי.

לבסוף, ניתן לאמץ בקלות את הצעת הפרוטוקול למדידת פונקציונליות הצומת העצבי-שרירי של הסרעפת, שריר נוסף המעורב לעתים קרובות במחלות פתולוגיות.