Name: מרים Auris הארוך הכנה לקראת בחינת בתרבית של התמסורת Neuromuscular בתנאים קלאמפ מתח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: למדו את פרוטוקול ההכנה לבידוד שריר ה-LAL בעכבר לצורך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בסינפסה הנוירומוסקולרית. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני העברה סינפטית במצבי בריאות ומחלה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ד ר מארק מ עשיר ומירנדה דניאל על הערות, Khedraki אחמד שעזרת להקים זה טכניקה, אוניברסיטת המדינה של רייט עבור תמיכה כספית (קרן אתחול כדי A.A.V.).

<ol><li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse%3A+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).</li>
<li>Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+the+mouse+levator+auris+longus+muscle%3A+a+convenient+preparation+to+study+muscle+and+nerve+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity.</a> J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).</li>
<li>Bertone, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrase+inhibitor+acetazolamide+shifts+synaptic+vesicle+recycling+to+a+fast+mode+at+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction.</a> Synapse. , (2017).</li>
<li>Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrusion+of+Ca2%2B+from+mouse+motor+terminal+mitochondria+via+a+Na%2B-Ca2%2B+exchanger+increases+post-tetanic+evoked+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release.</a> J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).</li>
<li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).</li>
<li>Nadal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+muscarinic+acetylcholine+autoreceptors+%28M1%2C+M2+and+M4+subtypes%29%2C+adenosine+receptors+%28A1+and+A2A%29+and+tropomyosin-related+kinase+B+receptor+%28TrkB%29+modulate+the+developmental+synapse+elimination+process+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction.</a> Mol Brain. 9 (1), 67(2016).</li>
<li>Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-glia+interactions+are+governed+by+synaptic+and+intrinsic+glial+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties.</a> Neuroscience. 167 (3), 621-632 (2010).</li>
<li>Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+neurotransmitter+release+at+the+neuromuscular+junction+in+a+mouse+model+of+polyglutamine+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease.</a> J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).</li>
<li>Takeuchi, A., Takeuchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+analysis+of+relationship+between+end-plate+potential+and+end-plate+current%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current.</a> J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).</li>
<li>McLachlan, E. M., Martin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non+linear+summation+of+end+plate+potentials+in+the+frog+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse.</a> The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).</li>
<li>Obis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+protein+kinase+C+epsilon+isoform+modulates+acetylcholine+release+in+the+rat+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction.</a> Mol Brain. 8 (1), 80(2015).</li>
<li>Silveira, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+and+inositol+triphosphate+receptors+modulate+facilitation+and+tetanic+depression+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).</li>
<li>Wood, S. J., Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+factor+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Safety factor at the neuromuscular junction.</a> Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).</li>
<li>Miranda, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+Cl-+channel+defects+reveal+disrupted+skeletal+muscle+maturation+in+R6%2F2+Huntington%27s+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice.</a> J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).</li>
<li>Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington+disease+skeletal+muscle+is+hyperexcitable+owing+to+chloride+and+potassium+channel+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).</li>
<li>Khedraki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depressed+Synaptic+Transmission+and+Reduced+Vesicle+Release+Sites+in+Huntington%27s+Disease+Neuromuscular+Junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington's Disease Neuromuscular Junctions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).</li>
<li>Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreene%2C+EC+%22The+anatomy+of+the+rat%22">The anatomy of the rat</a>. , Hafner Pub. (1955).</li>
<li>Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+that+stain+living+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes that stain living nerve terminals.</a> J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).</li>
<li>Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJack%2C+JJB+%22Electric+current+flow+in+excitable+cells%22">Electric current flow in excitable cells</a>. , Clarendon Press. (1983).</li>
<li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19805741">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors.</a> Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).</li>
<li>Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+slow+mammalian+muscles+after+denervation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Fast and slow mammalian muscles after denervation.</a> Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).</li>
<li>Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+types+of+calcium+channels+mediate+transmitter+release+during+functional+recovery+of+botulinum+toxin+type+A-poisoned+mouse+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals.</a> Neuroscience. 95 (1), 227-234 (2000).</li>
<li>Gaffield, M. A., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+mobility+in+mouse+motor+nerve+terminals+with+and+without+synapsin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin.</a> J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).</li>
<li>Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+ATPase+Inserted+into+the+Plasma+Membrane+of+Motor+Terminals+by+Exocytosis+Alkalinizes+Cytosolic+pH+and+Facilitates+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis.</a> Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

המתוארים כאן הוא הכנת השימוש בעכבר LAL שריר לשקילת התמסורת neuromuscular בתנאים מהדק זרם או מתח. ישנן מספר נקודות חשובות שיש לקחת בחשבון ניקוד החוצה לל. ניקוי עודף רקמת חיבור של כל העזרים השריר ב חלוקה בניצב אלקטרודה, כמו האלקטרודות יכול להרים רקמת החיבור כאשר והצב אותן עבור חלוקה בניצב. עם זאת, רק להסיר את רקמת החיבור יכול להילקח בקלות כדי להגביל את הסיכויים של פגיעה בשריר. הבידוד של העצב יש לבצעו בזהירות כי זה מאוד עדין. כדי למנוע נזק עצבי, זה עוזר להשאיר חלק הרקמה שמסביב המצורפת לקצה של עצב שדרכו ניתן להציב pin כדי לא...

לומד הסינאפסית באזור צומת עצב-שריר מספק תובנות לתוך מערכת היחסים דינמי בין המערכות שרירי העצבים והשלד, הוא מודל מצוין לבחינת פיזיולוגיה סינפטית. מרים auris הארוך (LAL) הוא שריר דק, המאפשר צמתי neuromuscular ניתן לאבחן בקלות. בדו"חות קודמים תיארו שם משתמש את LAL לבחון סינפטית סמים ורעלים, שאפיינו את מאפייני סוג סיבי השריר והשלד של1,לל2. מחקרים רבים ניצלו את LAL לבחון פיזיולוגיה neuromuscular3,4,5,6,7,8. עבור אלקטרופיזיולוגיה, את היכולת להבחין בקלות צמתי neuromuscular LAL מאפשר מיקום מדויק של microelectrodes-motor endplate ואת מקטינה באופן משמעותי בעיות קלאמפ שטח ההקלטות הסינאפסית. . מלחציים צולבים הנוכחי הקלטות של המאפיינים ממברנה שרירים, כגון ממברנה זמן קבוע (τמ'), התנגדות קלט (מוב) מתקבלים בקלות. יתר על כן, ניתן למדוד מאפיינים אלה של סיבי השריר אותו שימוש לתיעוד התמסורת neuromuscular, המאפשר השוואה ישירה של פונקציה סינפטית במאפיינים ממברנה שריר. ניתוח של נתונים אלה יכולים לספק תובנות מפתח במנגנונים הפיזי של מחלות נוירומוסקולריות ומדינות רבות של פעילות שונה.
היבט בטכניקה המתוארת כאן הוא השימוש של מתח-קלאמפ להקלטות סינפטית, אשר אינם כפופים הלא-linearities נתקל הנוכחי-קלאמפ ואינן תלויות המאפיינים ממברנה שריר. יתרונות השימוש מתח-קלאמפ לעומת הנוכחי-קלאמפ לבחון את התמסורת neuromuscular הוקמו על ידי חלוצי המאמצים ב שנות ה-509. תחת זרם-קלאמפ, אפסס עולה על 10-15 mV משרעת אינם תוצר ליניארי של משרעת mEPP9. לדוגמה, אם mEPP הממוצע הוא 1 mV, EPP של 5 mV אפשר להניח להיות התוצר של 5 mEPPs (קיו סי 5); הואיל EPP של 40 mV יהיה התוצר של mEPPs יותר מ-40. זה הלא-ליניאריות-אפס גדול יותר מתרחשת כיוון הכח הדוחף עבור EPP, אשר ההבדל בין פוטנציאל ממברנה פוטנציאל שיווי משקל של הקולטן אצטילכולין (~-10 mV), פוחתת באופן משמעותי במהלך אפס גדול. בעיה זו הוא נמנע בניסויים מתח-קלאמפ, כי פוטנציאל ממברנה שריר אינו משתנה במהלך הניסויים מתח-קלאמפ. החיסרון הוא מתח-קלאמפ ניסויים טכנית קשה יותר להשלים מאשר הנוכחי-קלאמפ הקלטה. עם זאת, מקלכלן ומרטין פיתח תיקון מתמטית פשוטה that חשבונות for הלא-linearities בהקלטות הנוכחי-קלאמפ אפסס10. התיקונים עובדים טוב11,12,13, אך, חשוב להניח המאפיינים ממברנה שריר לא שובשו.
המאפיינים ממברנה שריר חשובים במיוחד לשקול אם לומד תנאים או מצבי מחלה לשבש את השריר. לדוגמה, שרירי השלד מהמודל הטרנסגניים R6/2 של מחלת הנטינגטון היא hyperexcitable עקב ירידה פרוגרסיבית מנוחתו כלורי, אשלגן זרמי14,15. כתוצאה מכך, mEPPs, אפסס הם מוגבר בשרירי השלד R6/2. . בהחלט, גורמים נוספים יכולים לשנות mEPPs, אפס. עבודה עם מודל שונה של מחלת הנטינגטון עכברים (R6/1) נמצאו שינויים אפסס זה נראה להיות קשורה מוקש-חלבונים8. כדי להעריך את מנגנוני גרימת התמסורת neuromuscular מסולף, זה יהיה מועיל לחסל את ההשפעות של שריר שינו ממברנה מאפיינים באמצעות מתח-מלחציים. במחקר שנערך לאחרונה, התמסורת neuromuscular R6/2 נחקר תחת שני התנאים מהדק זרם מתח בטכניקה המתוארת במסמך זה. מכלול של endplates המנוע היו מתח מהודקי עם פחות מ- 1% השגיאה על-ידי הצבת שני microelectrodes בתוך אורך קבוע endplate ה-16. היא הוצגה על המתח-המלחציים, תיקן רשומות הנוכחי-קלאמפ הניב מדידות מנוגדים של התמסורת neuromuscular בשריר R6/2. זה מדגיש כי ייתכן שתתקשה לתיקון אפסס הלא-linearities אם המאפיינים ממברנה שריר שונתה, מציגה את היתרונות של קבלת מתח-קלאמפ רשומות שאינן תלויות המאפיינים ממברנה שריר. פרוטוקול שהוצגו במסמך זה הינו אידיאלי עבור בחינת תנאים או מצבי מחלה המשפיעות הסינאפסית והמאפיינים postsynaptic ממברנה.

<table><tbody><tr><td>אולימפוס תרכובת מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>10x אובייקטיבי</td><td>אולימפוס</td><td>UMPLFLN10XW</td><td></td></tr><tr><td>40x אובייקטיבי</td><td>אולימפוס</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>בורוסיליקט זכוכית</td><td>סאטר מכשירים</td><td>מכשירים BF150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>CCD מצלמה</td><td>סנטה ברברה מכשירים קבוצה</td><td>ST-7XMEI</td><td></td></tr><tr><td>Mater-9 דופק מחולל</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבודד גירוי איזו-פלקס</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 תוכנה לרכישת וניתוח נתונים</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>1-2500-0180</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרודה דו קוטבית קונצנטרית</td><td>FHC</td><td>מניפולטור</td> מפרק כדורי CBDSH75 <td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזרקים לא מתכתיים 34 מד</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>ניקון סטריאומיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>מס' 5 מלקחיים</td> כלים <td>מדעיים</td><td></td><td></td>עדינים</tr><tr><td>מספריים קפיצים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>מס' 2 מלקחיים</td><td>Roboz</td><td>RS-5Q41</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-חיתוך מספריים</td><td>Roboz</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>Dow Corning</td><td>2404019862</td><td></td></tr><tr><td>קרם הסרת שיער</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grass SD9 ממריץ</td><td>דשא רפואי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דגם P-1000 חולץ מיקרופיפטה</td><td>מכשירי סאטר</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Axon Digidata 1550 מערכת חימום נתונים עם רעש נמוך</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנן בסל</td> נמוך <td>מסנן וורנר אינסטרומנט קורפ.</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור שמאלי</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DL</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור ימני</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DR</td><td></td></tr><tr><td>בקרת תנועה יחידה</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MC100e</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור רולר חוצה</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641R</td><td>זה נוסף לציר ה-Z של המיקרומניפולטורים השמאליים והימניים כדי לאפשר למניע את ציר ה-z. הגדרה מותאמת אישית זו זולה יותר ופחות מגושמת מקניית מיקרומניפולטור ממונע בעל 4 צירים. זה גם מאפשר לנו לשלוט בשני המיקרומניפולטורים עם בקר אחד</td></tr><tr><td>כל הכימיקלים הוזמנו מפישר למעט,</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>BTS</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B315190</td><td></td></tr><tr><td>CTX</td><td>Alomone Labs</td><td>C-270</td><td></td></tr><tr><td>4-Di-2-Asp</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td></td><td>בדיקות מולקולריות היא כבר לא חברה. עכשיו הוזמן דרך פישר</td></tr></tbody></table>

מרים auris הארוך הכנה לקראת בחינת בתרבית של התמסורת neuromuscular בתנאים קלאמפ מתח

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

פרוטוקול זה מתאר טכניקה כדי להקליט הסינאפסית מצומת neuromuscular בתנאים הנוכחיים-קלאמפ, מתח-קלאמפ. הכנה ex-vivo של מרים auris הארוך (LAL) משמש כי זה שריר דק המעניק קל ויזואליזציה של צומת עצב-שריר חלוקה בניצב microelectrode-motor endplate. שיטה זו מאפשרת ההקלטה של פוטנציאל endplate מיניאטורי ספונטנית, זרמים (mEPPs ו- mEPCs), עורר עצב endplate פוטנציאל וזרמים (אפס ו- EPCs), כמו גם את מאפייני ממברנה motor endplate. התוצאות המתקבל בשיטה זו כוללות בתוכן quantal (קיו סי), מספר האתרים שחרור שלפוחית (n), ההסתברות של שלפוחית שחרור (prel), ההנחיה סינפטית, דיכאון, כמו גם את קרום זמן קבוע של השריר (τ מ') קלט ההתנגדות. יישום של טכניקה זו על העכבר מודלים של מחלות אנושיות יכול להאיר את מפתח פתולוגיות במצבי מחלה, לסייע בזיהוי אסטרטגיות טיפול חדשניים. מאת מלא מתח-מחבר חובק למעקה סינפסה בודדת, שיטה זו מספקת באחד הניתוחים המפורט ביותר של ההעברה הסינאפסית זמין כרגע.

איור 8 מראה דוגמה של הפולסים הנוכחי (איור 8A) ואת התגובות מתח (איור 8 ב') מסיב לל אחד תחת זרם-קלאמפ סוג בר בן שבוע 12 עכבר R6/2. הנוכחות של mEPPs מציין כי רשומות אלה לקוחים את motor endplate. הרשומות התקבלו בפתרון תמיסת מלח פיזיולוגית. רשומות הנוכחי-קלאמפ אלה ניתן לנתח כדי לקבוע את Rב , τמ' זה סיב16,19,<sup cl...

הפרוטוקול המתואר במאמר זה משתמש בעכבר השריר מרים auris הארוך (LAL) כדי להקליט ספונטנית, עורר עצב postsynaptic פוטנציאל (זרם-קלאמפ) וזרמים (מתח-קלאמפ) באזור צומת עצב-שריר. שיטה זו יכולה לספק תובנות מפתח במנגנונים של ההעברה הסינאפסית בתנאים רגיל ומחלות.

מרים Auris הארוך הכנה לקראת בחינת בתרבית של התמסורת Neuromuscular בתנאים קלאמפ מתח

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד את שריר levator auris longus ואת העצב שלו על מנת לרשום זרמים סינפטיים בצומת השרירים העצביים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בפיזיולוגיה סינפטית כגון גודל זרם לוחית הקצה, תוכן קוונטי, הסתברות לשחרור ויחסים בין הולכה עצבית וריגוש שרירים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לשלב בקלות הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מפורטות מסינפסה בודדת עם ניסויים אופטיים של תאים חיים.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד סינפטי ותקשורת משוב בין עצב לשריר, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות החל מדרוזופילה ועד יונקים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהכנת שרירי העצב של היונקים שברירית, במיוחד העצב. רכישה ופרשנות קפדנית של נתוני מהדק המתח הבאים יכולה להיות גם מאתגרת.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. מי שידגים את ההליך יהיה סטיב ברק מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו, בצע חתך קטן בעור בגב העכבר בגובה עצם השכמה.השתמש בזוג מספריים מיקרו-דיסקציה. חותכים את העור מעל הראש והגב. לאחר מכן, משוך את העור לאורך החתך ליד עצם השכמה.חתוך את השרירים הנחותים מה-LAL על ידי התחלה בעצם השכמה הימנית. לאחר מכן, הרם בעדינות את הרקמה החתוכה מימין לקו האמצע. בצע חתך לכיוון האוזן השמאלית כאשר להבי המספריים נלחצים על הגולגולת כדי להסיר כמה שכבות שריר נחותות מה-LAL השמאלי.הימנע מחיתוך העצב המעצבב את ה-LAL העוטף את תעלת האוזן ונכנס לשרירים בצד המדיאלי של האוזן. המשיכו לחתוך את תעלת האוזן תוך שמירה על כמה שיותר מהעצב מחובר. לאחר מכן, חתוך את רקמת השומן מאחורי תעלת האוזן לאורך החלק הגחוני של האוזן.חותכים לאורך עצם השכמה השמאלית בדומה להליכים שנעשים בצד ימין כדי להסיר את השריר לחלוטין מהעכבר. לאחר מכן, חתכו את אפרכסת האוזן לאורך הבסיס והשאירו את החלק הסחוסי של האוזן מחובר ל-LAL. הפוך את השריר כך שהצד התחתון פונה כלפי מעלה.כדי לבודד את שריר ה-LAL, הנח את ה-LAL ואת הרקמה שמסביב לתוך צלחת פטרי עם תחתית אלסטומר סיליקון והצמד את הרקמה המנותחת לתחתית. שטפו את הרקמה לעתים קרובות בתמיסת מלח פיזיולוגית. לאחר מכן, הנח סיכת חרקים דרך תעלת האוזן כדי להחזיק את ההכנה במקומה.בעזרת סיכות קטנות יותר, הצמד את הרקמה שנותרה בצד הנגדי של קו האמצע של ה-LAL. השתמש בזוג מלקחיים. משוך בעדינות את העור כלפי מעלה בחלק הצדדי של האוזן כדי למתוח את השריר החוצה ולהניח סיכה קטנה דרך העור.חזור על שלב זה עד שהרקמה מאובטחת היטב למנה. הסר את השרירים המכסים את ה-LAL ואת אלה הקשורים ל-LAL באמצעות רקמת חיבור והם הדוקים במיוחד ליד קו האמצע. לאחר מכן, משוך כלפי מעלה את שכבת השריר העליונה וחתוך את רקמת החיבור כשהלהבים מכוונים לכיוון שכבת השריר הנמשכת.חותכים לכיוון קו האמצע עד כ -3/4 מהדרך לקו האמצע וממשיכים להסיר את שכבות השריר עד שנשארת רק ה- LAL. במהלך תהליך הניקוי, יש לוודא שהעצבים אינם נפגעים. לאחר מכן, הסר חלק מרקמת החיבור שנותרה המכסה את ה-LAL כדי לסייע בהחדרת האלקטרודות.הסר רק רקמה שניתן לעשות זאת בקלות ללא סיכון לפגיעה ב-LAL בתהליך. כדי לזהות את העצב שמעצבב את ה-LAL, באמצעות ממריץ עצבי, גע בעצבים עם הממריץ העצבי. כאשר השריר מתכווץ, זוהה העצב הנכון.לאחר מכן, תפסו בזהירות את הרקמה ליד העצב והשתמשו במספריים קפיציים כדי להפריד את העצב מהרקמה המקיפה את האוזן. כדי למזער נזק, שמור את רוב העצב מוטבע ברקמה שמסביב שתשמש מאוחר יותר כדי לאבטח את העצב לצלחת ההקלטה. בשלב זה, החוקר יכול לקחת הפסקה של שעה כל עוד ה-LAL נשטף ב-20 מיליליטר או יותר של תמיסת מלח פיזיולוגית.לאחר מכן, שחרר והעביר את השריר לתוספת שלב מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה לניסויים אלקטרופיזיולוגיה. הצמד את השריר בקצוות ולאורך קצהו. מקם את העצב בניצב לסיבי השריר והצמד אותו לתחתית הכלי דרך רקמה עודפת שנותרה שלמה בקצה העצב.שמור על הרקמה שטופה בתמיסת מלח פיזיולוגית בכל עת. לניסוי אלקטרופיזיולוגיה, אבטח את תא הזלוף עם ה-LAL לשלב המיקרוסקופ. הנח את אלקטרודת הייחוס בכוס מלאה באשלגן כלורי תלת מולארי המחובר לתא ההקלטה באמצעות גשר אגר.בשלב זה, מקם את האלקטרודה המגרה את העצב על העצב. חשוף את הכנת ה-LAL ל-4-Di-2-Asp למשך 10 דקות כדי להשיג תפרחת נאותה להדמיית צומת עצבי-שרירי. לאחר 10 דקות, החלף את תמיסת 4-Di-2-Asp בתמיסת הסידן הרגילה.בינתיים, מלאו את נימי הזכוכית בפתרונות המתאימים לאלקטרודות חישת המתח והעברת הזרם. הקש בעדינות על הנימים כדי להסיר בועות אוויר ולהדק את הנימים הממולאים לתוך מחזיק האלקטרודה על ה-headstage. באמצעות מיקרוסקופ זקוף עם שדה בהיר סטנדרטי ותאורת פלורסצנטיות, חפש פס בהיר של צמתים עצביים-שריריים ירוקים פלואורסצנטיים העוברים בניצב לסיבי השריר לאורך ההכנה עם יעד מים בהגדלה נמוכה.לאחר מכן, עבור למטרה של הגדלה גבוהה יותר כדי לזהות צומת עצבי-שרירי בשכבה העליונה של השריר על מנת לבחון באמצעות אלקטרופיזיולוגיה. באמצעות שדה בהיר בעיקר, מקם את האלקטרודה מעל קרום השריר בטווח של 100 מיקרון מהצומת העצבי-שרירי שזוהה. איור זה מציג דוגמה לפולסים הנוכחיים ולתגובות המתח מסיב LAL אחד תחת מהדק זרם מעכבר R62 בן 12 שבועות.הרשומות הושגו בתמיסת מלח פיזיולוגית רגילה ונוכחותם של mEPPs מצביעה על כך שרשומות אלה נלקחו מלוחית הקצה של המנוע. להלן הקלטה מייצגת של EPC ושני mEPCs המתקבלים בתנאי מהדק מתח. איור זה מציג את ה-EPCs וה-mEPCs המונחים על גבי סיב מייצג.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיית תאים חיים עם צבעי ממברנה כגון FM143 או היסטולוגיה על מנת לענות על שאלות הקשורות לספיגת שחרור שלפוחית או שינויים מורפולוגיים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפיזיולוגיה לחקור העברה סינפטית ותקשורת בין תאי עצב באורגניזמים החל מדרוזופילה ועד יונקים.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד את שריר ה-levator auris longus העצבני על מנת להקליט זרמים סינפטיים בצומת העצבי-שרירי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לנקוט משנה זהירות בהסרת רקמת השריר המחוברת ל-LAL ובידוד העצב.

levator-auris-longus-preparation-for-examination-mammalian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים שיטות אלקטרו למדידת בשידור סינפטי בצומת neuromuscular של הזחל תסיסנית. שחרור עורר היא יזמה באופן מלאכותי על ידי המרצת הנוירונים אקסונים מוטוריים, והעברת דרך NMJ ניתן למדוד התגובה postsynaptic עורר בשריר.

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

יישום electrophysiology כדי סינפסות נגיש מספק מדד לכימות הפעילות הסינפטית, שימושי בניתוח מוטנטים הסינפטי. מאמר זה מתאר שיטה לנתיחה נהג לחשוף את בצמתים neuromuscular (NMJ)...

הביתור, הקלטה מ צומת C. elegans Neuromuscular

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

השריר פותחן של הרגל סרטנים מוצג חשיבותו ההיסטורית צדדיות ניסיוני פנוטיפ שרירים, פיזיולוגיה ואת הפלסטיות הסינפטית.

צפה היסטורי הפגנה לפיזיולוגיה NMJ של השריר פותחן סרטן הנהרות

אנו מתארים נהלים לניהול חוזרות ונשנות של מעכבי איתות muscarinic כדי longus levator auris (LAL) השרירים של עכברים בוגרים צעירים עבור immunostaining הבאות של צמתים neuromuscular שלה (NMJs) ב wholemounts. השריר LAL יש יתרונות ייחודיים עבור...

תת עורי מינהל היריבים Muscarinic ו Triple-Immunostaining של השריר Levator Longus Auris של עכברים

שיטה חדשה זו מאפשרת הקלטה התאית סימולטני של motoneuron אחת מבוגר עכבר והמדידה של הכח הנוצר על ידי סיבי השריר שלה. החקירה בשילוב של תכונות החשמליות ומכאניות של יחידות מוטוריות בבעלי חיים רגילים ועבר שינוי הגנטי היא פריצת דרך בחקר מערכת התוקפת.

הקלטה תאית סימולטני של Motoneuron מותנה והחיל הופק על ידי יחידת המנוע שלה בעכבר למבוגרים<em&gt; בחי</em

הערכה תפקודית של צומת עצב-שריר (NMJ) יכול לספק מידע חיוני על התקשורת בין שריר ועצב. כאן נתאר פרוטוקול להעריך באופן מקיף פונקציונליות NMJ והן שריר באמצעות שני תכשירים שריר-עצב שונים, קרי הסוליה-פציעה, דיאפרגמה-הסרעפת.

מדידת פונקציונליות צומת עצב-שריר

טכניקות דעתנית עצב לספק כלי רב עוצמה כדי לבחון פתופסיולוגיה ושינויים biophysical שקודמים אירועים ניוונית בלתי הפיך. כתב יד זה מדגים את השימוש של טכניקות אלה על עצם הגומד של חולדות מורדם.

אין ויוו מדידות אלקטרופיזיולוגיות של עצב הגומד עכברוש עם הבדיקות דעתנית עצב

הפרוטוקול מתאר את השיטה של העמסת צבע סידן פלואורסצנטי דרך העצב החתוך לתוך מסופי העצבים המוטוריים של העכבר. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לרישום ארעי סידן מהירים בקצות העצבים ההיקפיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

רישום של סידן חולף בצומת נוירומוסקולרי עכבר עם רזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב אלקטרופורציה in vivo וניתוק עצבים של שריר levator auris longus (LAL). הליך זה מאפשר לחקור את התפקיד הפוטנציאלי של חלבונים שמקורם בשריר בהתחדשות הסינפסה העצבית-שרירית.

משולב באלקטרופורציה של Vivo ועצבוב מחדש לטווח קצר של שריר השלד של שריר השלד Auris longus

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק דינמי יכולה לבסס קשרים סיבתיים בין ליקויים בירי עצבי לתפקוד לקוי של תעלת יונים. אנו מתארים שיטות ופרוטוקולים של מהדק דינמי בנוירונים של פורקינג'ה במוח הקטן של העכבר, תוך ציון משאבים שימושיים ושיקולים טכניים. במחקר מייצג, אנו מוסיפים מוליכות נתרן מעוצבת לנוירונים Tsc1-/- Purkinje כדי להציל ירי חוזר.

שיטות מהדק דינמי לחקירת ריגוש עצבי לקוי הקשור לאוטיזם

למדו את פרוטוקול ההכנה לבידוד שריר ה-LAL בעכבר לצורך הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בסינפסה הנוירומוסקולרית. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני העברה סינפטית במצבי בריאות ומחלה.

מרים Auris הארוך הכנה לקראת בחינת בתרבית של התמסורת Neuromuscular בתנאים קלאמפ מתח

גלה סרטונים נוספים