<em>Levator Auris Longus</em> Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Steven R. A. Burke; Eric J. Reed; Shannon H. Romer; Andrew A. Voss

doi:10.3791/57482

מרים Auris הארוך הכנה לקראת בחינת בתרבית של התמסורת Neuromuscular בתנאים קלאמפ מתח

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Neuroscience

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

מרים Auris הארוך הכנה לקראת בחינת בתרבית של התמסורת Neuromuscular בתנאים קלאמפ מתח

Full Text

9,795 Views

10:45 min

May 5, 2018

DOI: 10.3791/57482-v

Steven R. A. Burke¹, Eric J. Reed¹, Shannon H. Romer¹, Andrew A. Voss¹

¹Department of Biological Sciences,Wright State University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article presents a protocol for isolating the mouse levator auris longus (LAL) muscle and its innervating nerve to record spontaneous and nerve-evoked postsynaptic potentials and currents at the neuromuscular junction. This method can elucidate key aspects of synaptic transmission, including neurotransmission mechanisms under normal and disease conditions.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Electrophysiology
Synaptic physiology

Background

The protocol focuses on the mouse levator auris longus muscle.
It assesses the mechanisms of synaptic transmission.
The study aims to explore both normal and pathological states.
Combining electrophysiological recordings with optical techniques provides a broader understanding of synaptic dynamics.

Purpose of Study

To isolate the LAL muscle and its nerve for detailed synaptic measurements.
To enhance understanding of end plate current size and quantal content.
To evaluate neurotransmission relationships with muscle excitability.

Methods Used

This study employs a mouse model for nerve and muscle preparation.
Electrophysiological techniques are used, including voltage and current-clamp recordings.
No multiomics workflows are mentioned.
The procedure is expected to take about an hour when performed proficiently.
Critical steps include careful isolation of the LAL and maintenance of physiological conditions during recording.

Main Results

The protocol facilitates direct observation of synaptic function through electrophysiological data collection.
Insights into the excitation and neurotransmission mechanisms at the neuromuscular junction are anticipated.
No details on specific molecular changes or experimental results were provided.
The study aims to enhance understanding of neuronal communication and its implications for both health and disease.

Conclusions

This method enables the investigation of synaptic transmission dynamics on a per-synapse basis.
The insights gained can contribute to understanding diseases affecting neuromuscular transmission.
This study highlights the potential for detailed exploration of synaptic physiology.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using the LAL muscle for this study?

The LAL muscle provides a well-defined model for studying synaptic transmission due to its accessible location and the distensible nature of the innervating nerve.

How is the nerve-muscle preparation achieved?

The preparation involves meticulous dissection under a stereo-dissecting microscope, ensuring minimal damage to the nerves.

What parameters can be measured using this method?

Researchers can measure synaptic currents, end plate potentials, and evaluate neurotransmission characteristics.

How can this method be applied to other organisms?

While the protocol is designed for mice, the techniques can be adapted for studying similar neuromuscular junctions in species ranging from flies to mammals.

What are some limitations of this technique?

The procedure can be technically challenging due to the fragility of the nerve-muscle prep, requiring practice for successful implementation.

What insights does this research aim to provide?

The study aims to elucidate the mechanisms of synaptic transmission and their implications for neuromuscular diseases.

הפרוטוקול המתואר במאמר זה משתמש בעכבר השריר מרים auris הארוך (LAL) כדי להקליט ספונטנית, עורר עצב postsynaptic פוטנציאל (זרם-קלאמפ) וזרמים (מתח-קלאמפ) באזור צומת עצב-שריר. שיטה זו יכולה לספק תובנות מפתח במנגנונים של ההעברה הסינאפסית בתנאים רגיל ומחלות.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד את שריר levator auris longus ואת העצב שלו על מנת לרשום זרמים סינפטיים בצומת השרירים העצביים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בפיזיולוגיה סינפטית כגון גודל זרם לוחית הקצה, תוכן קוונטי, הסתברות לשחרור ויחסים בין הולכה עצבית וריגוש שרירים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לשלב בקלות הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מפורטות מסינפסה בודדת עם ניסויים אופטיים של תאים חיים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד סינפטי ותקשורת משוב בין עצב לשריר, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות החל מדרוזופילה ועד יונקים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהכנת שרירי העצב של היונקים שברירית, במיוחד העצב. רכישה ופרשנות קפדנית של נתוני מהדק המתח הבאים יכולה להיות גם מאתגרת.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. מי שידגים את ההליך יהיה סטיב ברק מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו, בצע חתך קטן בעור בגב העכבר בגובה עצם השכמה.

השתמש בזוג מספריים מיקרו-דיסקציה. חותכים את העור מעל הראש והגב. לאחר מכן, משוך את העור לאורך החתך ליד עצם השכמה.

חתוך את השרירים הנחותים מה-LAL על ידי התחלה בעצם השכמה הימנית. לאחר מכן, הרם בעדינות את הרקמה החתוכה מימין לקו האמצע. בצע חתך לכיוון האוזן השמאלית כאשר להבי המספריים נלחצים על הגולגולת כדי להסיר כמה שכבות שריר נחותות מה-LAL השמאלי.

הימנע מחיתוך העצב המעצבב את ה-LAL העוטף את תעלת האוזן ונכנס לשרירים בצד המדיאלי של האוזן. המשיכו לחתוך את תעלת האוזן תוך שמירה על כמה שיותר מהעצב מחובר. לאחר מכן, חתוך את רקמת השומן מאחורי תעלת האוזן לאורך החלק הגחוני של האוזן.

חותכים לאורך עצם השכמה השמאלית בדומה להליכים שנעשים בצד ימין כדי להסיר את השריר לחלוטין מהעכבר. לאחר מכן, חתכו את אפרכסת האוזן לאורך הבסיס והשאירו את החלק הסחוסי של האוזן מחובר ל-LAL. הפוך את השריר כך שהצד התחתון פונה כלפי מעלה.

כדי לבודד את שריר ה-LAL, הנח את ה-LAL ואת הרקמה שמסביב לתוך צלחת פטרי עם תחתית אלסטומר סיליקון והצמד את הרקמה המנותחת לתחתית. שטפו את הרקמה לעתים קרובות בתמיסת מלח פיזיולוגית. לאחר מכן, הנח סיכת חרקים דרך תעלת האוזן כדי להחזיק את ההכנה במקומה.

בעזרת סיכות קטנות יותר, הצמד את הרקמה שנותרה בצד הנגדי של קו האמצע של ה-LAL. השתמש בזוג מלקחיים. משוך בעדינות את העור כלפי מעלה בחלק הצדדי של האוזן כדי למתוח את השריר החוצה ולהניח סיכה קטנה דרך העור.

חזור על שלב זה עד שהרקמה מאובטחת היטב למנה. הסר את השרירים המכסים את ה-LAL ואת אלה הקשורים ל-LAL באמצעות רקמת חיבור והם הדוקים במיוחד ליד קו האמצע. לאחר מכן, משוך כלפי מעלה את שכבת השריר העליונה וחתוך את רקמת החיבור כשהלהבים מכוונים לכיוון שכבת השריר הנמשכת.

חותכים לכיוון קו האמצע עד כ -3/4 מהדרך לקו האמצע וממשיכים להסיר את שכבות השריר עד שנשארת רק ה- LAL. במהלך תהליך הניקוי, יש לוודא שהעצבים אינם נפגעים. לאחר מכן, הסר חלק מרקמת החיבור שנותרה המכסה את ה-LAL כדי לסייע בהחדרת האלקטרודות.

הסר רק רקמה שניתן לעשות זאת בקלות ללא סיכון לפגיעה ב-LAL בתהליך. כדי לזהות את העצב שמעצבב את ה-LAL, באמצעות ממריץ עצבי, גע בעצבים עם הממריץ העצבי. כאשר השריר מתכווץ, זוהה העצב הנכון.

לאחר מכן, תפסו בזהירות את הרקמה ליד העצב והשתמשו במספריים קפיציים כדי להפריד את העצב מהרקמה המקיפה את האוזן. כדי למזער נזק, שמור את רוב העצב מוטבע ברקמה שמסביב שתשמש מאוחר יותר כדי לאבטח את העצב לצלחת ההקלטה. בשלב זה, החוקר יכול לקחת הפסקה של שעה כל עוד ה-LAL נשטף ב-20 מיליליטר או יותר של תמיסת מלח פיזיולוגית.

לאחר מכן, שחרר והעביר את השריר לתוספת שלב מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה לניסויים אלקטרופיזיולוגיה. הצמד את השריר בקצוות ולאורך קצהו. מקם את העצב בניצב לסיבי השריר והצמד אותו לתחתית הכלי דרך רקמה עודפת שנותרה שלמה בקצה העצב.

שמור על הרקמה שטופה בתמיסת מלח פיזיולוגית בכל עת. לניסוי אלקטרופיזיולוגיה, אבטח את תא הזלוף עם ה-LAL לשלב המיקרוסקופ. הנח את אלקטרודת הייחוס בכוס מלאה באשלגן כלורי תלת מולארי המחובר לתא ההקלטה באמצעות גשר אגר.

בשלב זה, מקם את האלקטרודה המגרה את העצב על העצב. חשוף את הכנת ה-LAL ל-4-Di-2-Asp למשך 10 דקות כדי להשיג תפרחת נאותה להדמיית צומת עצבי-שרירי. לאחר 10 דקות, החלף את תמיסת 4-Di-2-Asp בתמיסת הסידן הרגילה.

בינתיים, מלאו את נימי הזכוכית בפתרונות המתאימים לאלקטרודות חישת המתח והעברת הזרם. הקש בעדינות על הנימים כדי להסיר בועות אוויר ולהדק את הנימים הממולאים לתוך מחזיק האלקטרודה על ה-headstage. באמצעות מיקרוסקופ זקוף עם שדה בהיר סטנדרטי ותאורת פלורסצנטיות, חפש פס בהיר של צמתים עצביים-שריריים ירוקים פלואורסצנטיים העוברים בניצב לסיבי השריר לאורך ההכנה עם יעד מים בהגדלה נמוכה.

לאחר מכן, עבור למטרה של הגדלה גבוהה יותר כדי לזהות צומת עצבי-שרירי בשכבה העליונה של השריר על מנת לבחון באמצעות אלקטרופיזיולוגיה. באמצעות שדה בהיר בעיקר, מקם את האלקטרודה מעל קרום השריר בטווח של 100 מיקרון מהצומת העצבי-שרירי שזוהה. איור זה מציג דוגמה לפולסים הנוכחיים ולתגובות המתח מסיב LAL אחד תחת מהדק זרם מעכבר R62 בן 12 שבועות.

הרשומות הושגו בתמיסת מלח פיזיולוגית רגילה ונוכחותם של mEPPs מצביעה על כך שרשומות אלה נלקחו מלוחית הקצה של המנוע. להלן הקלטה מייצגת של EPC ושני mEPCs המתקבלים בתנאי מהדק מתח. איור זה מציג את ה-EPCs וה-mEPCs המונחים על גבי סיב מייצג.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיית תאים חיים עם צבעי ממברנה כגון FM143 או היסטולוגיה על מנת לענות על שאלות הקשורות לספיגת שחרור שלפוחית או שינויים מורפולוגיים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפיזיולוגיה לחקור העברה סינפטית ותקשורת בין תאי עצב באורגניזמים החל מדרוזופילה ועד יונקים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד את שריר ה-levator auris longus העצבני על מנת להקליט זרמים סינפטיים בצומת העצבי-שרירי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לנקוט משנה זהירות בהסרת רקמת השריר המחוברת ל-LAL ובידוד העצב.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos