מרים Auris הארוך הכנה לקראת בחינת בתרבית של התמסורת Neuromuscular בתנאים קלאמפ מתח

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד את שריר levator auris longus ואת העצב שלו על מנת לרשום זרמים סינפטיים בצומת השרירים העצביים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בפיזיולוגיה סינפטית כגון גודל זרם לוחית הקצה, תוכן קוונטי, הסתברות לשחרור ויחסים בין הולכה עצבית וריגוש שרירים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לשלב בקלות הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מפורטות מסינפסה בודדת עם ניסויים אופטיים של תאים חיים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד סינפטי ותקשורת משוב בין עצב לשריר, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות החל מדרוזופילה ועד יונקים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהכנת שרירי העצב של היונקים שברירית, במיוחד העצב. רכישה ופרשנות קפדנית של נתוני מהדק המתח הבאים יכולה להיות גם מאתגרת.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. מי שידגים את ההליך יהיה סטיב ברק מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו, בצע חתך קטן בעור בגב העכבר בגובה עצם השכמה.

השתמש בזוג מספריים מיקרו-דיסקציה. חותכים את העור מעל הראש והגב. לאחר מכן, משוך את העור לאורך החתך ליד עצם השכמה.

חתוך את השרירים הנחותים מה-LAL על ידי התחלה בעצם השכמה הימנית. לאחר מכן, הרם בעדינות את הרקמה החתוכה מימין לקו האמצע. בצע חתך לכיוון האוזן השמאלית כאשר להבי המספריים נלחצים על הגולגולת כדי להסיר כמה שכבות שריר נחותות מה-LAL השמאלי.

הימנע מחיתוך העצב המעצבב את ה-LAL העוטף את תעלת האוזן ונכנס לשרירים בצד המדיאלי של האוזן. המשיכו לחתוך את תעלת האוזן תוך שמירה על כמה שיותר מהעצב מחובר. לאחר מכן, חתוך את רקמת השומן מאחורי תעלת האוזן לאורך החלק הגחוני של האוזן.

חותכים לאורך עצם השכמה השמאלית בדומה להליכים שנעשים בצד ימין כדי להסיר את השריר לחלוטין מהעכבר. לאחר מכן, חתכו את אפרכסת האוזן לאורך הבסיס והשאירו את החלק הסחוסי של האוזן מחובר ל-LAL. הפוך את השריר כך שהצד התחתון פונה כלפי מעלה.

כדי לבודד את שריר ה-LAL, הנח את ה-LAL ואת הרקמה שמסביב לתוך צלחת פטרי עם תחתית אלסטומר סיליקון והצמד את הרקמה המנותחת לתחתית. שטפו את הרקמה לעתים קרובות בתמיסת מלח פיזיולוגית. לאחר מכן, הנח סיכת חרקים דרך תעלת האוזן כדי להחזיק את ההכנה במקומה.

בעזרת סיכות קטנות יותר, הצמד את הרקמה שנותרה בצד הנגדי של קו האמצע של ה-LAL. השתמש בזוג מלקחיים. משוך בעדינות את העור כלפי מעלה בחלק הצדדי של האוזן כדי למתוח את השריר החוצה ולהניח סיכה קטנה דרך העור.

חזור על שלב זה עד שהרקמה מאובטחת היטב למנה. הסר את השרירים המכסים את ה-LAL ואת אלה הקשורים ל-LAL באמצעות רקמת חיבור והם הדוקים במיוחד ליד קו האמצע. לאחר מכן, משוך כלפי מעלה את שכבת השריר העליונה וחתוך את רקמת החיבור כשהלהבים מכוונים לכיוון שכבת השריר הנמשכת.

חותכים לכיוון קו האמצע עד כ -3/4 מהדרך לקו האמצע וממשיכים להסיר את שכבות השריר עד שנשארת רק ה- LAL. במהלך תהליך הניקוי, יש לוודא שהעצבים אינם נפגעים. לאחר מכן, הסר חלק מרקמת החיבור שנותרה המכסה את ה-LAL כדי לסייע בהחדרת האלקטרודות.

הסר רק רקמה שניתן לעשות זאת בקלות ללא סיכון לפגיעה ב-LAL בתהליך. כדי לזהות את העצב שמעצבב את ה-LAL, באמצעות ממריץ עצבי, גע בעצבים עם הממריץ העצבי. כאשר השריר מתכווץ, זוהה העצב הנכון.

לאחר מכן, תפסו בזהירות את הרקמה ליד העצב והשתמשו במספריים קפיציים כדי להפריד את העצב מהרקמה המקיפה את האוזן. כדי למזער נזק, שמור את רוב העצב מוטבע ברקמה שמסביב שתשמש מאוחר יותר כדי לאבטח את העצב לצלחת ההקלטה. בשלב זה, החוקר יכול לקחת הפסקה של שעה כל עוד ה-LAL נשטף ב-20 מיליליטר או יותר של תמיסת מלח פיזיולוגית.

לאחר מכן, שחרר והעביר את השריר לתוספת שלב מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה לניסויים אלקטרופיזיולוגיה. הצמד את השריר בקצוות ולאורך קצהו. מקם את העצב בניצב לסיבי השריר והצמד אותו לתחתית הכלי דרך רקמה עודפת שנותרה שלמה בקצה העצב.

שמור על הרקמה שטופה בתמיסת מלח פיזיולוגית בכל עת. לניסוי אלקטרופיזיולוגיה, אבטח את תא הזלוף עם ה-LAL לשלב המיקרוסקופ. הנח את אלקטרודת הייחוס בכוס מלאה באשלגן כלורי תלת מולארי המחובר לתא ההקלטה באמצעות גשר אגר.

בשלב זה, מקם את האלקטרודה המגרה את העצב על העצב. חשוף את הכנת ה-LAL ל-4-Di-2-Asp למשך 10 דקות כדי להשיג תפרחת נאותה להדמיית צומת עצבי-שרירי. לאחר 10 דקות, החלף את תמיסת 4-Di-2-Asp בתמיסת הסידן הרגילה.

בינתיים, מלאו את נימי הזכוכית בפתרונות המתאימים לאלקטרודות חישת המתח והעברת הזרם. הקש בעדינות על הנימים כדי להסיר בועות אוויר ולהדק את הנימים הממולאים לתוך מחזיק האלקטרודה על ה-headstage. באמצעות מיקרוסקופ זקוף עם שדה בהיר סטנדרטי ותאורת פלורסצנטיות, חפש פס בהיר של צמתים עצביים-שריריים ירוקים פלואורסצנטיים העוברים בניצב לסיבי השריר לאורך ההכנה עם יעד מים בהגדלה נמוכה.

לאחר מכן, עבור למטרה של הגדלה גבוהה יותר כדי לזהות צומת עצבי-שרירי בשכבה העליונה של השריר על מנת לבחון באמצעות אלקטרופיזיולוגיה. באמצעות שדה בהיר בעיקר, מקם את האלקטרודה מעל קרום השריר בטווח של 100 מיקרון מהצומת העצבי-שרירי שזוהה. איור זה מציג דוגמה לפולסים הנוכחיים ולתגובות המתח מסיב LAL אחד תחת מהדק זרם מעכבר R62 בן 12 שבועות.

הרשומות הושגו בתמיסת מלח פיזיולוגית רגילה ונוכחותם של mEPPs מצביעה על כך שרשומות אלה נלקחו מלוחית הקצה של המנוע. להלן הקלטה מייצגת של EPC ושני mEPCs המתקבלים בתנאי מהדק מתח. איור זה מציג את ה-EPCs וה-mEPCs המונחים על גבי סיב מייצג.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיית תאים חיים עם צבעי ממברנה כגון FM143 או היסטולוגיה על מנת לענות על שאלות הקשורות לספיגת שחרור שלפוחית או שינויים מורפולוגיים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפיזיולוגיה לחקור העברה סינפטית ותקשורת בין תאי עצב באורגניזמים החל מדרוזופילה ועד יונקים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד את שריר ה-levator auris longus העצבני על מנת להקליט זרמים סינפטיים בצומת העצבי-שרירי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לנקוט משנה זהירות בהסרת רקמת השריר המחוברת ל-LAL ובידוד העצב.