ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור
31 במאי 2017
כאן, אנו מתארים גישה מיקרוסקופית אור גיליון לדמיין את הלב CD45 + ליקוציט לחדור במודל Murine של שריר הלב, שריר הלב, אשר נגרמת על ידי טיפול דיפריה intraracheal intrachecheal של עכברים CD11c.DTR.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לנקות כימית את ליבו של עכבר, עם הפרעת קצב לב מושרית להדמיה של איבר שלם של חדירת הלב הלויקוציטית על ידי מיקרוסקופ גיליון אור פלואורסצנטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר איברים שלמים על תותבות ומבנים ברמת הרזולוציה התאית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הן כימות והן לוקליזציה של דלקת באיברים שלמים.
מתן פרטים פנימיים מפורטים לתותבת נוירולוגית. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר היינו זקוקים בדחיפות לכלי הדמיה לזיהוי הסברים תאיים להפרעות קצב לב במודול הדלדול. לאחר חשיפת הלב מעכבר בן שמונה עד 10 שבועות, השתמש בצנתר בגודל 21 וחדור לחדר הימני.
חתכו את אבי העורקים כדי לאפשר ניקוז דם ולאחר מכן החדרו חמישה מיליליטר של PBS בתוספת EDTA, בלחץ קבוע איטי. עקוב אחר PBS EDTA עם חמישה מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד. בסוף הזלוף, השתמש במלקחיים משוננים כדי לתפוס בעדינות את הלב הקבוע, ומשוך את האיבר מעט כלפי מעלה כדי לחתוך את כל חיבורי הרקמות.
כולל העורקים והוורידים הנכנסים והיוצאים. לאחר מכן, אחסן את הלב למשך ארבע שעות ב-4% PFA טרי לקיבוע נוסף. כדי לייבש את הרקמה, דגרו את הלב בסדרת אתנול עולה, בצינורות תגובת פוליפרופילן שחורים של חמישה מיליליטר בחושך, עם סיבוב איטי קבוע על מסובב צינור, כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.
לאחר מכן, נקה את הרקמה עם דגירה של אתר דיבנזיל של 98% עם סיבוב קבוע למשך הלילה. כדי לבצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור, הנח תחילה גושי אגרוז מיובשים לתוך מחזיק הדגימה הסטנדרטי, כדי להחזיק את הדגימה במקומה. לאחר מכן, העבירו את הדגימה למחזיק המדגם.
לאחר מכן, העבירו את מחזיק המדגם לקובטה מלאה באתר דיבנזיל בגודל מתאים. השתמש בהגדרות מסנן העירור והפליטה המתאימות, כדי לזהות את אותות הקרינה המעניינים. אז מיקום וקיבוע נכון של הדגימה הוא בסיסי כדי למזער את השפעות ההצללה במהלך ההדמיה.
יתר על כן, דגימה רופפת עלולה לגרום לחפצים נעים, שקשה להאיר במהלך העיבוד שלאחר העיבוד. לאחר דרישת כל התמונות, פתחו את התוכנה המתאימה לניתוח עיבוד תמונה בתלת-ממד ובתלת-ממד ובחרו באפשרות 'עודף'. בחרו 'קובץ' ו'פתח', ובחרו בתיקייה הכוללת את הנתונים מהערוץ הראשון שנרכש כדי לפתוח את אוספי התמונות.
בחר ערוך והוסף ערוצים, כדי להוסיף את נתוני הערוץ הפלואורסצנטי המתאימים. לאחר מכן, לחץ על ערוך ובחר מאפייני תמונה, כדי לתקן את מידות הווקסל x, y ו-z. התאמת הפרמטרים בחלון החדש שנפתח.
כדי לכוונן את אותות הפלורסנט, פתח תחילה את תפריט העריכה ובחר, הצג התאמת תצוגה. חלון חדש מציג מאוד את כל הערוצים הפתוחים. לשינוי ערוץ האוטו-פלואורסצנטי לגווני אפור, בחרו בערוץ האוטו-פלואורסצנטי, בחרו בסגנון התצוגה הלבן ולחצו על הלחצן 'אשר'.
לאחר מכן, התאם את התצוגה על-ידי הסרת הרשת. לאחר מכן, הגדל את התצוגה ובטל את הבחירה בערוץ אחד. לאחר מכן, התאם את ערך רמת השחור כדי לא לכלול אותות רקע לא רצויים שאינם מייצגים את מבני המדגם, עוצמת האות והניגודיות.
כוונן את ערוץ הנוגדן העומד ביחס לאות ערוץ האוטופלואורסצנטי המתוקן. הגדרת מצב הערוץ, אש כדי להגדיר את ההדמיה של אות הנוגדן לטבלת חיפוש צבע של מפת חום. לאחר מכן, בחרו במצב המיזוג, כדי להמחיש את מבני הרקמה בפירוט.
לחיתוך וירטואלי של העוגב, לפני ייצוא הסצנה התלת-ממדית, בחרו בסמל מישור החיתוך ברשימת העצמים. מסגרת צהובה ומניפולטור ציר לבן יופיעו בתצוגת התמונה. השתמשו בעכבר כדי לסובב את הציר בקצה הדק יותר, כדי לשנות את כיוון מישור החיתוך, והזיזו את החלק האמצעי העבה יותר של הציר כדי לבחור את עומק החיתוך הרצוי.
לאחר מכן, בטל את הסימון בתיבות הסימון המתאימות כדי להסתיר את המסגרת והמניפולטור וליצור את התמונות הרצויות. רכישת ערימת תמונות שלמה, המורכבת משני אותות תעלות פלואורסצנטיות, מעוררת עיבוד תלת מימד מלאכותי, שבו התפלגות הלויקוציטים מוצגת בתצוגת מפת חום. ניתן להבחין באזורי הלב המודלקים מאוד מבעל חיים שטופל ברעלן דיפתריה על ידי המראה האדמדם והלבנבן שלהם.
במיוחד באזורים של מערכת ההולכה הלבבית, כמו צרור חדר הפרוזדורים וסיבי פורקינג'ה. לעומת זאת, לבם של בעלי חיים שטופלו ב-PBS מבוקר, אינו מדגים דפוס דלקת זה. לאחר שליטה, טכניקה זו מאפשרת ניתוח דיגיטלי מוכן של איבר מטרה, מהקציר שלו ועד לעיבוד בעזרת מחשב תוך ארבעה עד חמישה ימים.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האמנולוגיה, לחקור דפוסי התפלגות תאים באיברי עכבר שלמים. זה עשוי להזדקן בניתוח ובטיפול במגוון תותבות של מחלות פתופיזיולוגיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין איברי עכבר שלמים למיקרוסקופ גיליון אור פלואורסצנטי וכיצד ליצור ולעבד ערימות נתונים תלת מימדיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר גישה של מיקרוסקופיית גיליאור (light-sheet microscopy) להדמיה של חדירה של לוקוציטים CD45+ אל השריר הלבבי במודל עכברי של מיוקרדיטיס פולמיננטית אספטית. השיטה מאפשרת הדמיה של האיבר השלם וכימות של הדלקת ברזולוציה תאית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- קרדיולוגיה
- אימונולוגיה
רקע
- מיוקרדיטיס פולמיננטית אספטית מאופיינת בחדירה משמעותית של לוקוציטים.
- הבנת המנגנונים התאיים העומדים בבסיס הפרעות קצב לבבית היא קריטית.
- מיקרוסקופיית Light-sheet מספקת טכניקה חדשנית להדמיה של איברים שלמים.
- מחקר זה משתמש במודל עכברי כדי לבחון מנגנונים אלו.
מטרת המחקר
- ביצוע שקיפות כימית של הלב לצורך ויזואליזציה של חדירה לוקוציטית.
- בחינת הקשר בין דלקת לבין הפרעות קצב לבביות.
- מתן תובנות לגבי גישות טיפוליות פוטנציאליות למצבים לבביים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השראת הפרעת קצב לב בעכברי CD11c.DTR באמצעות רעלים של דיפתריה (diphtheria toxin).
- שימוש בקטטר בכילוי (gauge) 21 לחדירה לחדר הימני.
- יישום מיקרוסקופיית שכבה של אור פלואורסצנטי (Fluorescence Light Sheet Microscopy) לצורך הדמיה.
- טכניקות להדמיית איבר שלם לצורך ניתוח מפורט.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של חדירה של לוקוציטים CD45+ בלב.
- זיהוי מיקום הדלקת ברקמות הלב.
- תובנות לגבי הבסיס התאי של הפרעות קצב לבביות.
- הדגמת יעילותה של מיקרוסקופיית light-sheet במחקרי איברים שלמים.
מסקנות
- גישת מיקרוסקופיית לוח האור (light-sheet microscopy) יעילה לחקר דלקות לבביות.
- שיטה זו משפרת את ההבנה של דינמיקת הלויקוציטים במיוקרדיטיס.
- הממצאים עשויים לתרום למחקרים עתידיים על טיפולים לבביים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה וכימות של חדירת לוקוציטים באיבר שלם במודל של מיוקרדיטיס בעכברים, ובכך מספק גישה ניתנת להרחבה להורדת סיכונים בבחינת מנגנוים דלקתיים בתהליכי גילוי תרופות למחלות לב. באמצעות שילוב של מיקרוסקופיית light-sheet עם הבהרה כימית, השיטה תומכת בתיקוף מטרות (target validation) באמצעות מיפוי מרחבי של תאי מערכת החיסון במערכות רלוונטיות למחלה. השיטה מגבירה את רמת הביטחון החזויית בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור דפוסי דלקת היסטולוגיים לפנוטיפים פונקציונליים של הפרעות בקצב הלב (arrhythmia).
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של לוקליזציית לוקוציטים CD45+ ברקמת לב דלקתית.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מיפוי כמותי של תאי מערכת החיסון במודל מתוקף של myocarditis פולמיננטי.
- ערך חיזוי: מסייע במיון פורטפוליו על ידי מתאם בין צפיפות חדירת הלוקוציטים לתוצאות של אריתמיה בבעלי חיים שטופלו ב-Diphtheria toxin.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת לבבות של עכברים שלמים שעברו הבהרה (clearing) עבור תהליכי דימות סטנדרטיים וניתנים לשחזור, התואמים לניתוח תמונות אוטומטי.
- פלט כמותי: יצירת מערכי נתונים של פלואורסצנציה בתלת-ממד המאפשרים מדידה של צפיפות ופיזור לוקוציטים כמדד פרמקודנמי.
- יכולת הרחבה: תהליך ההבהרה והדימום מאפשר עיבוד של קבוצות איברים למטרת סריקת תרכובות להשוואה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: משתמש במודל טרנסגני המשחזר מיוקרדיטיס קטלנית המונעת על ידי אריתמיה, ובכך תואם למכניזמים פתופיזיולוגיים אנושיים.
- המשכיות תרגומית: מאפשר מעקב אורך של חדירה חיסונית משלב הגילוי ועד למחקרי יעילות פרה-קליניים.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מקשר בין דפוסי דלקת מרחביים למעורבות של מערכת ההולכה הלבבית, ובכך מסייע בבחירת מטרות לטיפולים אנטי-דלקתיים.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, ומספקת גשר בין סריקה פנוטיפית למעקב מכניסטי בתחום האימונוקרדיולוגיה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות באמצעות הדמיה של חדירת תאי חיסון באיברים שלמים ללא ארטיפקטים של חיתוך.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות פרמטרים עקביים של שקיפות רקמה, צביעה והדמיה בין קבוצות הניסוי.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות כמותיות בתלת-ממד של התפלגות לוקוציטים, המקליטות השוואה בין תנאים שונים ותיקוף של תוצאות (hit validation).
- מחקר תרגומי: מקשרת בין פנוטיפים חיסוניים מוקדמים לתוצאות פרה-קליניות על ידי שימור ההקשר האנטומי של הדלקת במערכת ההולכה של הלב.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה מודולרית הניתנת להתאמה למטרות פלואורסצנטיות ואיברים אחרים מעבר לאימונולוגיה של הלב.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי של תיקוף המטרה (target validation) על ידי הפחתת העמימות בייחוס מנגנונים דלקתיים.
- ערך תפעולי: מספק דימוי סטנדרטי וניתן לשחזור של איבר שלם, עם מינימום שונות התלויה במשתמש לאחר תהליך הפינוי (clearing).
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go באמצעות אספקת נתוני דלקת ברזולוציה מרחבית המקושרים לנקודות קצה תפקודיות של הלב.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של מועמדים בהתבסס על פרופילים של חדירת לוקוציטים ברקמות הרלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביצוע שקיפות רקמות (tissue clearing), צביעה אימונופלואורסצנטית ותפעול של מיקרוסקופ light-sheet.
- תלוי בגישה למערכות LSFM, לחומרי שקיפות כימיים (למשל, dibenzyl ether) ולתוכנה לניתוח תמונות בתלת-ממד.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי פרפוזיה, קיבוע וצביעה בין מעבדות כדי להבטיח שחזוריות בין צוותים שונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום פרוטוקול השקיפות על איברים שאינם לב או על סמנים פלואורסצנטיים שונים.
- מוגבל בשל הצורך במודלים טרנסגניים ובהכנת רקמות מבוססת פרפוזיה, אשר עשויים שלא להתאים לסריקה ראשונית בקיבולת גבוהה (high-throughput).
