ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לנקות כימית את ליבו של עכבר, עם הפרעת קצב לב מושרית להדמיה של איבר שלם של חדירת הלב הלויקוציטית על ידי מיקרוסקופ גיליון אור פלואורסצנטי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר איברים שלמים על תותבות ומבנים ברמת הרזולוציה התאית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הן כימות והן לוקליזציה של דלקת באיברים שלמים.

מתן פרטים פנימיים מפורטים לתותבת נוירולוגית. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר היינו זקוקים בדחיפות לכלי הדמיה לזיהוי הסברים תאיים להפרעות קצב לב במודול הדלדול. לאחר חשיפת הלב מעכבר בן שמונה עד 10 שבועות, השתמש בצנתר בגודל 21 וחדור לחדר הימני.

חתכו את אבי העורקים כדי לאפשר ניקוז דם ולאחר מכן החדרו חמישה מיליליטר של PBS בתוספת EDTA, בלחץ קבוע איטי. עקוב אחר PBS EDTA עם חמישה מיליליטר של 4% פרפורמלדהיד. בסוף הזלוף, השתמש במלקחיים משוננים כדי לתפוס בעדינות את הלב הקבוע, ומשוך את האיבר מעט כלפי מעלה כדי לחתוך את כל חיבורי הרקמות.

כולל העורקים והוורידים הנכנסים והיוצאים. לאחר מכן, אחסן את הלב למשך ארבע שעות ב-4% PFA טרי לקיבוע נוסף. כדי לייבש את הרקמה, דגרו את הלב בסדרת אתנול עולה, בצינורות תגובת פוליפרופילן שחורים של חמישה מיליליטר בחושך, עם סיבוב איטי קבוע על מסובב צינור, כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.

לאחר מכן, נקה את הרקמה עם דגירה של אתר דיבנזיל של 98% עם סיבוב קבוע למשך הלילה. כדי לבצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור, הנח תחילה גושי אגרוז מיובשים לתוך מחזיק הדגימה הסטנדרטי, כדי להחזיק את הדגימה במקומה. לאחר מכן, העבירו את הדגימה למחזיק המדגם.

לאחר מכן, העבירו את מחזיק המדגם לקובטה מלאה באתר דיבנזיל בגודל מתאים. השתמש בהגדרות מסנן העירור והפליטה המתאימות, כדי לזהות את אותות הקרינה המעניינים. אז מיקום וקיבוע נכון של הדגימה הוא בסיסי כדי למזער את השפעות ההצללה במהלך ההדמיה.

יתר על כן, דגימה רופפת עלולה לגרום לחפצים נעים, שקשה להאיר במהלך העיבוד שלאחר העיבוד. לאחר דרישת כל התמונות, פתחו את התוכנה המתאימה לניתוח עיבוד תמונה בתלת-ממד ובתלת-ממד ובחרו באפשרות 'עודף'. בחרו 'קובץ' ו'פתח', ובחרו בתיקייה הכוללת את הנתונים מהערוץ הראשון שנרכש כדי לפתוח את אוספי התמונות.

בחר ערוך והוסף ערוצים, כדי להוסיף את נתוני הערוץ הפלואורסצנטי המתאימים. לאחר מכן, לחץ על ערוך ובחר מאפייני תמונה, כדי לתקן את מידות הווקסל x, y ו-z. התאמת הפרמטרים בחלון החדש שנפתח.

כדי לכוונן את אותות הפלורסנט, פתח תחילה את תפריט העריכה ובחר, הצג התאמת תצוגה. חלון חדש מציג מאוד את כל הערוצים הפתוחים. לשינוי ערוץ האוטו-פלואורסצנטי לגווני אפור, בחרו בערוץ האוטו-פלואורסצנטי, בחרו בסגנון התצוגה הלבן ולחצו על הלחצן 'אשר'.

לאחר מכן, התאם את התצוגה על-ידי הסרת הרשת. לאחר מכן, הגדל את התצוגה ובטל את הבחירה בערוץ אחד. לאחר מכן, התאם את ערך רמת השחור כדי לא לכלול אותות רקע לא רצויים שאינם מייצגים את מבני המדגם, עוצמת האות והניגודיות.

כוונן את ערוץ הנוגדן העומד ביחס לאות ערוץ האוטופלואורסצנטי המתוקן. הגדרת מצב הערוץ, אש כדי להגדיר את ההדמיה של אות הנוגדן לטבלת חיפוש צבע של מפת חום. לאחר מכן, בחרו במצב המיזוג, כדי להמחיש את מבני הרקמה בפירוט.

לחיתוך וירטואלי של העוגב, לפני ייצוא הסצנה התלת-ממדית, בחרו בסמל מישור החיתוך ברשימת העצמים. מסגרת צהובה ומניפולטור ציר לבן יופיעו בתצוגת התמונה. השתמשו בעכבר כדי לסובב את הציר בקצה הדק יותר, כדי לשנות את כיוון מישור החיתוך, והזיזו את החלק האמצעי העבה יותר של הציר כדי לבחור את עומק החיתוך הרצוי.

לאחר מכן, בטל את הסימון בתיבות הסימון המתאימות כדי להסתיר את המסגרת והמניפולטור וליצור את התמונות הרצויות. רכישת ערימת תמונות שלמה, המורכבת משני אותות תעלות פלואורסצנטיות, מעוררת עיבוד תלת מימד מלאכותי, שבו התפלגות הלויקוציטים מוצגת בתצוגת מפת חום. ניתן להבחין באזורי הלב המודלקים מאוד מבעל חיים שטופל ברעלן דיפתריה על ידי המראה האדמדם והלבנבן שלהם.

במיוחד באזורים של מערכת ההולכה הלבבית, כמו צרור חדר הפרוזדורים וסיבי פורקינג'ה. לעומת זאת, לבם של בעלי חיים שטופלו ב-PBS מבוקר, אינו מדגים דפוס דלקת זה. לאחר שליטה, טכניקה זו מאפשרת ניתוח דיגיטלי מוכן של איבר מטרה, מהקציר שלו ועד לעיבוד בעזרת מחשב תוך ארבעה עד חמישה ימים.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האמנולוגיה, לחקור דפוסי התפלגות תאים באיברי עכבר שלמים. זה עשוי להזדקן בניתוח ובטיפול במגוון תותבות של מחלות פתופיזיולוגיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין איברי עכבר שלמים למיקרוסקופ גיליון אור פלואורסצנטי וכיצד ליצור ולעבד ערימות נתונים תלת מימדיות.