מודלים ניסיוניים לחקר הנוירו-פרוטקציה של התסמינים החומציים נגד איסכמיה מוחית

המטרה הכוללת של טיפול בחמצת במודל פרוסה סטריאטלית של קורטיקו במודל חסימת עורק המוח האמצעי היא לחקור את ההשפעה הנוירו-פרוטקטיבית של התניה לאחר התניה חומצית כנגד איסכמיה מוחית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח כיצד התניה לאחר חמצת עשויה להגן על פגיעה מוחית איסכמית, ולפתח אסטרטגיה חדשה לטיפול בשבץ מוחי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת להשתמש במודלים ניסויים זמינים כדי לחקור את ההגנה העצבית של התניה לאחר חמצת.

מי שידגים את ההליך יהיה יארונג ג'נג, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. התחילו בהוצאת המוח מהגולגולת של עכבר ערוף ראש בעזרת מרית דקה והפלתו בזהירות לתוך המכילה ACSF רגיל קר כקרח, מאוזן עם חמישה אחוזי פחמן דו חמצני ו-95% חמצן. מרחו דבק קריופרספיטאט על צלחת הוויברטון בשתי רצועות.

הניחו חתיכה של שלושה אחוזי אגרוז על רצועת הדבק הרחוקה ביותר מהלהב כדי לתמוך במוח. לאחר מכן השתמשו במלקחיים כדי להעביר את המוח לנייר סינון. חותכים את המוט הקדמי ואת המוח הקטן בעזרת להב.

הניחו את רקמת המוח בצורה אנכית על רצועת הדבק החופשית כשהמוח נשען על האגרוז. הוסף ACSF קר כקרח למאגר החיתוך כדי להטביע את המוח ולהוסיף קרח לאזור מחזיק הקרח. שמור את ה-ACSF במאגר מבעבע עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני ו-95% חמצן.

לאחר הגדרת הוויברטון לחיתוך מקטעים של 400 מיקרון, ומיקום נכון של המוח ביחס ללהב החיתוך, לחץ על כפתור ההתחלה-עצירה כדי להתחיל בחיתוך אוטומטי. השתמש בפיפטה של פסטר עם קצה חתוך כדי להעביר חמש פרוסות מוח אחת אחת ולהניח אותן לתוך מחזיק הרקמה ב-ACSF רגיל קר כקרח מבעבע עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני ו-95% חמצן. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, הניחו את פרוסות המוח באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך עשר דקות כדי לשחזר את התפקוד הסינפטי.

הכניסו ACSF נטול גלוקוז ו-ACSF חומצי לאמבט המים של 37 מעלות צלזיוס ובעבעו את התמיסות עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני ו-95% חנקן ו-20 אחוז פחמן דו חמצני ו-80% חמצן בהתאמה למשך 30 דקות. העבירו בזהירות ארבע מתוך חמש פרוסות המוח ל-ACSF שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס, ללא גלוקוז ודגרו למשך 15 דקות. כדי לחקור את חלון הזמן להתניה מוקדמת חומצית, העבירו פרוסה אחת ישירות מ-ACSF נטול גלוקוז ל-ACSF חומצי והעבירו את שלוש הפרוסות האחרות ל-ACSF רגיל לזלוף מחדש.

לאחר שלוש דקות העבירו את הפרוסה ב-ACSF חומצי ל-ACSF רגיל. לאחר מכן, לאחר חמש דקות ב-ACSF רגיל, העבירו את אחת הפרוסות מ-ACSF רגיל למחזיק הרקמה ב-ACSF חומצי למשך שלוש דקות. מעבירים פרוסה נוספת באותו אופן 15 דקות לאחר הזילוף.

הפרוסה הנותרת שהוצבה ב-ACSF נטול גלוקוז אך לא ACSF חומצי מוגדרת כקבוצת מחסור בגלוקוז חמצן. מעבירים את הפרוסות מה- ACSF לבארות של צלחת 24 באר המכילה תמיסת TTC. מתחו את הפרוסה בתמיסה.

ואז לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים רדודים למשך 30 דקות. לאחר מכן העבירו את הפרוסות לצינורות צנטריפוגה נקיים ושקולים של 1.5 מיליליטר מכוסים בנייר כסף ומדדו את המשקל היבש של הפרוסות. לאחר השקילה, חלץ את פורמזן על ידי הוספת תמיסה אחד לאחד של אתנול ודימתיל סולפוקסיד לצינורות ביחס נפח למשקל של 10 לאחד.

דגירה הרחק מהאור למשך 24 שעות. למחרת העבירו את תמיסת האתנול דימתיל סולפוקסיד מהצינורות לצלחת של 96 בארות ומדדו את הספיגה ב-490 ננומטר באמצעות קורא צלחות. ראשית יש לאשר הרדמה נכונה על ידי היעדר רפלקס צביטה בבוהן.

לאחר מכן הנח את העכבר המורדם עם בדיקת LDF המחוברת לגולגולתו במצב שכיבה ותקן באמצעות חוטי כותנה סטריליים. יש לחטא את העור המגולח של הצוואר באלכוהול אתילי 75%. לאחר מכן, לאחר ביצוע חתך עור פרי חציוני בצוואר, נתח את הרקמות הרכות בעזרת מלקחיים כדי לחשוף את כלי הדם.

הוסיפו טיפה אחת של מי מלח לרקמות החשופות כדי לשמור על לחותן. לאחר מכן, השתמש במלקחיים עיניים כדי לנתח את עורק הצוואר המשותף מהרקמה שמסביב ועצב הנרתיק. היזהר לא לפגוע בעצב הנרתיק.

הנח מהדק כלי מיקרו בקצה הדיסטלי של עורק הצוואר המשותף. וקשר קשר מת עם תפרי משי 6-0 בקצה הפרוקסימלי. ואז קושרים קשר רופף פרוקסימלי למהדק כתפר זמני.

לאחר מכן, השתמש במספריים מיקרו עיניים כדי לבצע חתך אורכי קטן בין שני הקשרים קרוב ככל האפשר לקשר המת. כעת הכנס מונופילמנט קהה של 12 מילימטר דרך החתך ללומן העורק וקדם אותו כמה מילימטרים. הדק את הקשר הרופף סביב קצה המונופילמנט ואז הסר את המהדק.

לאחר מכן השתמש במלקחיים עיניים כדי לקדם את החוט לעורק הצוואר הפנימי עד שתוכנת ה-LDF מראה ירידה חדה בזרימת הדם. רשום את שעת ההתחלה של החסימה. לאחר מכן חתכו את בדיקת ה-LDF, והכניסו את העכבר לאינקובטור של 30 מעלות צלזיוס למשך שעה של חסימה.

55 דקות לאחר תחילת החסימה יש להרדים את החיה באיזופלורן ולמקם את החיה כמו קודם. לאחר מכן פתח את חתך הצוואר וחשוף מחדש את עורק הצוואר המשותף. לאחר תקופת החסימה, השתמש במלקחיים עיניים כדי לשלוף בעדינות את החוט כדי להשיג רפרפוזיה.

ואז הפוך את התפר הזמני לקבוע, על ידי הידוק הקשר. לטיפול בחמצת, שנה את הגז הנשאף על ידי חרוט האף ל-20% פחמן דו חמצני, 20% חמצן ו-60% חנקן למשך חמש דקות. לאחר סגירת החתך בתפר כירורגי קטוע, הנח את העכבר בכלוב מחומם של 30 מעלות צלזיוס עד שהעכבר יחזור להכרה.

היסטוגרמה זו מציגה את התוצאות מבדיקת TTC שבוצעה על פרוסות קליפת המוח לאחר מחסור בחמצן גלוקוז ופוסט-התניה חומצית כפי שמודגם בסרטון זה. שלוש דקות של טיפול בחמצת היו מגן על תאי העצב אם הטיפול החל מיד או חמש דקות לאחר מחסור בחמצן, אך לא אם הפרוסות הוחדרו מחדש במשך 15 דקות. עכברים נחשפו ל-60 דקות של חסימת עורק המוח האמצעי וטופלו על ידי שאיפת 20% פחמן דו חמצני למשך חמש דקות לאחר חמש, 50 או 100 דקות לאחר הרפרפוזיה.

נפח האוטם כומת על ידי שניים, שלושה, חמישה צביעת טריפנילטרזוליום הידרוכלוריד 24 שעות לאחר הרפרפוזיה כפי שמצוין על ידי הקווים המקווקוים השחורים. היסטוגרמה זו מציגה את אחוז נפח האוטם עבור כל מצב. ההגנה העצבית מפני התניה לאחר התניה חומצית הייתה חזקה גם כאשר זמן ההתחלה התעכב ל-50 דקות לאחר הרפרפוזיה.

עם זאת, טיפול בחמצת שהחל לאחר 100 דקות לא חסם את הפגיעה האיסכמית. לאחר צפייה בסרטון אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור את ההגנה העצבית של חמצת לאחר התניה במודל OGD של פרוסות מוח, ובמודל MSO של עכברים. בזמן ניסיון ההליכים חשוב לזכור שהארכת ומשך החמצת חשובים מאוד כדי לשחזר את ההשפעות המגנות.