Name: נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של Monocytes/מקרופאגים כדי Microenvironment הגידול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: למדו נוקאאוט מותנה של גנים בשורות תאי סרטן באמצעות מערכת Tet-ON לחקירת גיוס מונוציטים ומקרופאגים למיקרואנvironment הגידול. שיטה זו מאפשרת הבנה מעמיקה של האינטראקציה בין תאי סרטן למערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להכיר ז'קלין רוזנברג להגהת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי לנו מחלקת הבריאות ושירותי האנוש של/לאומי מכוני הבריאות בעזרת מענק לך DeClerck (להעניק 5R01 CA 129377) ושל קרן מרטל. טי-ג'יי. MH Kubala היא זוכת פרס מחקר לאגודה לפיתוח הקריירה של מכון המחקר סבן-החולים בלוס אנג'לס לילדים.

<ol><li>Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+transgenic+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Conditional transgenic technologies.</a> J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).</li>
<li>Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-associated+macrophages+as+treatment+targets+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology.</a> Nat Rev Clin Oncol. , (2017).</li>
<li>Franklin, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+origin+of+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages.</a> Science. 344 (6186), 921-925 (2014).</li>
<li>Ruffell, B., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+therapeutic+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophages and therapeutic resistance in cancer.</a> Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).</li>
<li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+immune+checkpoint+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li>
<li>Mizuguchi, H., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+adenovirus-mediated+tetracycline-controllable+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system.</a> Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).</li>
<li>Meyer-Ficca, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+inducible+expression+systems+in+transient+transfection+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies.</a> Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).</li>
<li>Wiederschain, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-vector+inducible+lentiviral+RNAi+system+for+oncology+target+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation.</a> Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).</li>
<li>Wee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN-deficient+cancers+depend+on+PIK3CB%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).</li>
<li>Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+CXCR4+by+inducible+small+interfering+RNA+inhibits+breast+cancer+cell+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro.</a> Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).</li>
<li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+suppression+of+cellular+genes%3A+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).</li>
<li>Solari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYCN-dependent+expression+of+sulfatase-2+regulates+neuroblastoma+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival.</a> Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).</li>
<li>Liao, Y., Tang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+RNAi+system+and+its+application+in+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics.</a> Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).</li>
<li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576901">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li>
<li>Jungi, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+chemotaxis+by+a+reversible+Boyden+chamber+eliminating+cell+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).</li>
<li>Jung, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+autocrine+motility+factor+suppress+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer.</a> Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Sorbus+commixta+on+the+invasion+and+migration+of+human+hepatocellular+carcinoma+Hep3B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells.</a> Int J Mol Med. , (2017).</li>
<li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes%2C+peripheral+blood+mononuclear+cells%2C+and+THP-1+cells+exhibit+different+cytokine+expression+patterns+following+stimulation+with+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide.</a> Mediators Inflamm. 2013, 697972(2013).</li>
<li>Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+peripheral+blood+monocytes+versus+THP-1+monocytes+for+in+vitro+biocompatibility+testing+of+dental+material+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components.</a> J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).</li>
<li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+human+peripheral+blood+monocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">A simple method for human peripheral blood monocyte isolation.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).</li>
<li>Flo, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+selection+of+human+monocytes+using+magnetic+particles+covered+by+anti-lymphocyte+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies.</a> J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).</li>
<li>Grondahl-Hansen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor+type+1+in+cytosolic+tumor+extracts+predicts+prognosis+in+low-risk+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients.</a> Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).</li>
<li>Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiation+of+serous+ovarian+cancer+from+cystic+to+solid+tumors+is+associated+with+increased+expression+of+mRNA+for+urokinase+plasminogen+activator+%28uPA%29%2C+its+receptor+%28uPAR%29+and+its+inhibitor+%28PAI-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1).</a> Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).</li>
<li>Devy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-+or+antiangiogenic+effect+of+plasminogen+activator+inhibitor+1+is+dose+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent.</a> FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).</li>
<li>Bajou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor-1+protects+endothelial+cells+from+FasL-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis.</a> Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).</li>
<li>Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor-1+promotes+inflammatory+process+induced+by+cigarette+smoke+extraction+or+lipopolysaccharides+in+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells.</a> Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).</li>
<li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Targeting+of+Plasminogen+Activator+Inhibitor-1+Decreases+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Migration+and+Neointima+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).</li>
<li>Carmeliet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+role+of+plasminogen+activator+inhibitor-1+in+arterial+wound+healing+and+neointima+formation%3A+a+gene+targeting+and+gene+transfer+study+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice.</a> Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).</li>
<li>Cao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+receptor+LRP+together+with+tPA+and+PAI-1+coordinates+Mac-1-dependent+macrophage+migration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration.</a> EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).</li>
<li>Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25342286">Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5).</a> Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).</li>
<li>Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor-1+is+a+critical+downstream+target+of+p53+in+the+induction+of+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence.</a> Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).</li>
<li>Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protumorigenic+activity+of+plasminogen+activator+inhibitor-1+through+an+antiapoptotic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function.</a> J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).</li>
<li>Bennett, S., Breit, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+in+the+isolation+and+culture+of+human+monocytes+that+are+of+particular+relevance+to+studies+of+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV.</a> J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).</li>
<li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+monocytes%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells.</a> Science. 327 (5966), 656-661 (2010).</li>
<li>Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monocytes+undergo+excessive+apoptosis+following+temozolomide+activating+the+ATM%2FATR+pathway+while+dendritic+cells+and+macrophages+are+resistant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant.</a> PLoS One. 7 (6), e39956(2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מורכבת של מגוון רחב של סוגי תאים, טיים חיוני להתפתחות של סרטן. לבירור תנאי הגידול האופטימלית, תאים סרטניים מושכים ומונוציטים באמצעות הפרשת גורמים chemotactic. כאן אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את המנגנון של גיוס מונוציט מאת גידול תאים במבחנה. למטרה זו, נעשה שימוש בשילוב של ג'ין inducible ביטוי במערכת, טיהור של ראשי ומונוציטים אנושי, כדוגמה וזמינותו הגירה, וזמינותו קאמרית בוידן.
השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול הציג הוא לאשר נכונות השיבוט של הרצף shRNA לתוך הווקטור ט-על, אשר תמיד צריך להיות מו...

הגידול הקשורים מקרופאגים (תאמי) תורמים להתפתחות הגידול באמצעות קידום הגידול, גרורות, ויסות התגובה החיסונית2. סרטן תאי ומונוציטים דלקתיות מגויסת, אשר לחדור הגידול, להבדיל לתוך תאמי pro-tumorigenic3. חדירה של הגידול עם תאמי בקורלציה עם התוצאה הקלינית המסכן, נקשר את התפקיד לדיכוי המערכת החיסונית של מקרופאגים4,5. עם זאת, המנגנון של הגיוס של מקרופאגים לגידול לא נידונות טוב, הבנה טובה יותר של המסלולים המעורבים חיוני לקידום בהמשך השדה, טיפולים המבטיחים. אחד האתגרים ללמוד אינטראקציות בין תאים סרטניים ותאים רגילים ב microenvironment הגידול (טיים) הוא המורכבות של מנגנונים, מעורב, הדורשים גישות במבחנה המאפשרים ניתוח crosstalk תאים. כאן אנו מציגים מתודולוגיה צדדי שניתן להחיל כדי לחקור את ההשפעה paracrine של סרטן התא, נגזר, חלבון המופרש על הגירה של סוגי תאים אחרים כמו מקרופאגים, במבחנה. באמצעות מערכת איפה הביטוי של shRNA נגד סרטן התא-derived חלבון מעורב בגיוס ומונוציטים תחת השליטה של האמרגן inducible טטרציקלין, הוא quantitated את ההשפעה paracrine של החלבון המופרש על ומונוציטים. ב פרוטוקול זה, שכפול הרצפים shRNA לתוך טטרציקלין וקטור מוסדר מוצג ואחריו לדור של שורות תאים סרטן יציב. עוד, הטיהור ומונוציטים אנושי ראשוני ואת וזמינותו הקאמרית של בוידן משמשים כדי לנתח את ההשפעה paracrine של חלבון תאי סרטן נגזר על העברה של ומונוציטים.
Downregulation של חלבון קידוד גנים מוחל בדרך כלל עם siRNA וטכניקות shRNA, אבל לא בלי מגבלות בשימוש בו. לטווח ארוך הדפיקה למטה (KD) של גנים עשויים להפיק תגובות מסתגלת משני תאים להפריע תוצאות ניסויית. חוסר שליטה טמפורלית על ביטוי גנים מקל מאתגר ללמוד את התפקיד דינמי של חלבון לאורך זמן או את התפקיד של חלבון חשובה לקיום התא. בעיה זו חשובה במיוחד ויוו הגדרות, איפה התפקיד של חלבון התפתחות גידולים והתקדמות עשויים לדרוש את downregulation של הביטוי של החלבון עניין רק לאחר הגידול הוא הוקם. KD מותנה יש את היתרון של מניעת מוקדם מדי קטלני תופעת KD על תאים, וכדי לאפשר ניתוח של תפקידו של החלבון בתוך בשלבים שונים של הגידול, בעוד KD ללא תנאים עלולה לגרום חוסר התפתחות גידולים.
מספר מערכות KD מותנה פותחו כדי לטפל המגבלות של KD יציב. מערכות ביטוי של גנים מותנה כוללים Ecdysone-inducible ביטוי מערכות, ציטוכרום P-450 אינדוקציה מערכת1, ו טטרציקלין מוסדר מערכות ביטוי גנים. מערכות ביטוי של גנים מוסדר טטרציקלין מאפשרים שליטה על הבעת shRNA על תוספת של אנטיביוטיקה טטרציקלין (או שלה אנלוגי יותר יציב - דוקסיציקלין). ב ט-על מערכות, הביטוי של shRNA מושרה בנוכחות טטרציקלין/דוקסיציקלין והתוצאה היא ביטוי גנים KD, ואילו במערכות ט-OFF, הביטוי של shRNA מדוכא בנוכחות טטרציקלין והתוצאה היא ביטוי גנים. החיסרון של מערכת inducible-טטרציקלין הוא שדווחה בעבר רמות נמוכות של ביטוי shRNA בהיעדרו של דוקסיציקלין - כביכול leakiness6,7. ט-מופעל המערכת המתוארות כאן, על הממשל של טטרציקלין, הכריכה של טטרציקלין צורונים ביטוי (טטריס למצוא) בחלבון רצף רכיב (TRE) ט מגיב בתוך H1 הוא אזור יזם shRNA עניין לדכא. התוצאה היא ביטוי של shRNA וניגוד של תרגום של החלבון עניין ב-8,באופן תלוי-טטרציקלין9.
מערכות אחרות-טט-על זמינות לכלול בו זמנית טוק-של TetO רצף בין תיבת טטה רצף proximal רכיב (פסי) ובין תיבת טטה שעתוק להתחיל פותח ע י צ'אן ואח. 10 מערכת זו דורשת פחות רעיל במינונים של טטרציקלין להסדיר ביטוי shRNA, עם זאת, תחת מצב שאינו-induced, רמות נמוכות של shRNA באים לידי ביטוי. Krüppel-הקשורים box (קראב) המבוסס על ט'-על מערכת11 כולל קראב, חלבון אצבע אבץ, אשר נושאים גנים הממוקמים בתוך טווח 3 kb של אתר האיגוד קראב כדי דיכוי גנים ברמת השעתוק. TTRKRAB chimeric חלבון יכול להיקשר TetO, עקב מגוון רחב של יכולת לשליטה דנ א, TetO לא צריך להיות מוגבל בין שעתוק באתר, יזם את ומתחילים יש השפעה נמוכה על הפעילות של האמרגן. תחת המדינה הלא-induced, מערכת לשליטה זו התערבות RNA דווח כדי להציג רמה נמוכה יותר של ביטוי דלף shRNA11,12; עם זאת, זה דורש גישה שיבוט רציפים, שני-וקטור. בהשוואה בעבר מפותחות מערכות KD מותנה כגון Ecdysone-inducible ביטוי המערכת או P-450 ציטוכרום אינדוקציה המערכת, המערכת מוסדר טטרציקלין יש את היתרון של הפיכות בחוסנו, ולכן ביותר בשימוש שגרתי מערכת13. המערכת בשימוש פרוטוקול זה יש יתרון כפול TetO טוק-אין מערכת ומערכת קראב ט-על כמו זה דורש וקטור ישר קדימה, יחיד שיבוט, ומאפשר דור מהירה של שיבוטים מרובים, זה מוצגים רמות נמוכות מאוד של leakiness, היעדרות של דוקסיציקלין.
טיים היא קריטית להתפתחות של סרטן. כדי להקל על הגידול, תאים סרטניים לגייס ומונוציטים דלקתיות על ידי הפרשת חלבונים chemotactic. ומונוציטים מגויס לחדור את הגידול, להבדיל לתוך תאמי pro-tumorigenic שתורמים הגידול של גרורות. מחקרים במבחנה של גיוס תא החיסון לנצל את מבחני ההעברה, עם בוידן assay קאמרית להיות נרחב בשימוש14,15,16,17. ב הזה assay, מקור חלבון chemoattractant, לדוגמה, תאים סרטניים, או חלבון מטוהרים, ממוקם בתחתית המצודה. תאים חיסוניים ממוקמים בחדר העליון מופרדות על-ידי נקבובי ממברנה מ והתא התחתון. תאים נודדות לכיוון מעבר הצבע הגוברת של chemoattractant, ואלה שנמצאו בצד התחתון של הקרום צבעונית, ספרתי מתחת למיקרוסקופ. כאן אנחנו לבדוק את תפקוד chemoattractant Plasminogen Activator מעכב 1 (פאי-1) על ומונוציטים על ידי יצירת שורות תאים סרטן יציב, inducible שבו הביטוי של פאי-1 מוסדר על ידי תוספת דוקסיציקלין. אנו משתמשים ומונוציטים ראשי האדם בוידן קאמרית ההעברה וזמינותו כדי להעריך את התפקיד של פאי-1 בהעברה מונוציט. ההבדלים בין האנושי ומונוציטים ראשי שורות תאים monocytic בשימוש נרחב כמו THP1 דווחו וכוללים דפוסי ביטוי ציטוקינים שונים18; לדוגמה, לעומת 5-10 קיפול עלייה TNF-α רמות הביטוי על ידי תאים THP1 ומונוציטים האנושי19. תאים THP1 נגזרים מתוך תאי סרטן אנושיים monocytic, כדי לשמור על, להתרבות עם ממוצע מכפיל את עצמו בתקופה של 19-50 גובה20. להפך, ומונוציטים האנושי מאופיינים על ידי אורך חיים קצר, בהעדר גורמי גדילה. מאז ומונוציטים וגופם מטוהר מהדם של תורמים, כמות נכבדה של השתנות מתרחשת בין האנשים, בהתאם לשיטת טיהור, זיהום, עם סוגי תאים אחרים עלולה להתרחש. למרות זאת, ומונוציטים ראשיות הרלוונטיות, זה מומלץ להשתמש או לאשר את התוצאות שהושגו עם הקווים תא monocytic באמצעות ומונוציטים הראשית in המחקר הביולוגי19. כאן נתאר פרוטוקול לטיהור של האדם העיקרי ומונוציטים מדם היקפי. שיטות אלטרנטיביות מונוציט טיהור כוללות צפיפות הדרגתי והצמדות פרוטוקולים צעד שני ההליך עם מעברי צבע יחיד של Ficoll-Hypaque ואחריו הדרגתיות Percoll21. הטוהר של האוכלוסייה מונוציט מתקבל על ידי טווחים אלה שיטות בין 70-90%. השיטה המתוארת כאן משתמש הדרגתי צפיפות ואחריו בחירת מערכת החיסון שלילית22 , ומאפשרת הטיהור של monocytes האנושית ללא קשר ישיר עם נוגדנים, ובכך הימנעות שלהם הפעלה בשוגג, וכתוצאה מכך > 95% טהור אוכלוסיית ומונוציטים.
פרוטוקול המובאת כאן משמש להגדרת מערכת ט-אן פונקציונלי של ביטוי גנים KD בשורות תאים סרטניים אנושיים כדי לחקור את האפקט chemoattractant של סרטן, נגזר על ידי החלבון פאי-1 על ומונוציטים. פאי-1 הוא overexpressed על ידי מגוון רחב של גידולים, הביטוי שלה באופן פרדוקסאלי בקורלציה עם התוצאה הקלינית המסכן23,24. תפקיד פרו-tumorigenic פאי-1 הוא תוצאה של pro-אנגיוגנזה שלה ופונקציות אנטי-מוות25,26. פאי-1 הוכח לתרום דלקת על ידי קידום הגיוס של מקרופאגים לאתר של דלקת27. פאי-1 הוצגה כדי לקדם את שריר חלק cellmigration28,29 ו להשתתף ההעברה מקרופאג התלויים30מק-1. פאי-1 ביטוי הוכח גם לשפר במידה ניכרת את הגיוס של Raw 264.7 מקרופאגים לתוך גידולים מלנומה B16F1031. עם זאת, תפקידו של פאי-1 ב- TAM ההעברה לא נחקר בפירוט. אנו משתמשים בפרוטוקול המתואר כדי לענות על השאלה של פאי-1 מושך ומונוציטים תאים סרטניים. מתודולוגיה זו מאפשרת ניתוח crosstalk בין הגידול טיים על ידי החלבון המופרש של תאים סרטניים ואף ניתוח המרכיבים של טיים.

<table><tbody><tr><td>Tet-pLKO-puro וקטור לנטי-ויראלי</td><td>Addgene</td><td>21915</td><td></td></tr><tr><td>FBS (ללא טטרציקלין)</td> <td>Omega Scientific</td><td>FB-15</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10771-500ML</td><td></td></tr><tr><td>EasySep ערכת העשרת מונוציטים אנושיים</td><td>StemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep מגנט</td><td>StemCell</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>AgeI HF</td><td>NEB</td><td>R3552S</td><td></td></tr><tr><td>לחתוך מאגר חכם</td><td>NEB</td><td>B7200S</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree פלסמיד מקסי ערכת</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>PROMEGA Wizard SV ג'ל ומערכת ניקוי PCR</td><td>PROMEGA</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>psPAX וקטור</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G וקטור</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 מוכשר כימית&nbsp;E. coli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>סט כתמים Hema 3 לפרוטוקול כתמים של רייט-גימסה</td><td></td><td>123-869</td><td></td></tr><tr><td>תאי HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>אנזים הגבלה XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Ligase buffer</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M תמיסה</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>The Big Easy" EasySep מגנט</td><td>תאי גזע</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>0.1% תמיסת פולי-L-ליזין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>נתרן בוטיראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; מסנני מזרק M</td><td>VWR International</td><td>28145-479</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500g</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>דיתיאוריתריטול (DTE)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B8255-5 גרם</td><td></td></tr><tr><td>אתנול (EtOH)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>792780</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>אמרסקו</td><td>J859-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>פלוקה</td><td>70161-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>בקטו אגר</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9393-5 גרם</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו s Modified Eagle' s בינוני (DMEM)</td> <td>קורנינג</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>קורנינג</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזין-חומצה סולפונית (HEPES)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>פורומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P9620</td><td></td></tr><tr><td>דוקסיציקלין היקלאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9891-25g</td><td></td></tr><tr><td>רוזוול מכון הזיכרון של פארק (RPMI)</td><td>קורנינג</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ' EDTA pH 8.0</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>פלקון תמיכה חדירה לצלחת 24 בארות עם 8.0&mu; m ממברנה PET שקופה</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>מוליך כותנה&nbsp;</td><td>חבילת Medline</td><td>MDS202000</td><td></td></tr><tr><td>פרוטוקול Hema 3 STAT&nbsp;</td>חברת <td>פישר סיינטיפיק</td><td>123-869</td><td></td></tr><tr><td>לפתור שמן טבילה, צמיגות גבוהה</td><td>ריצ'רד אלן סיינטיפיק</td><td>M4004</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>ג'יבקו</td><td>15140122</td><td></td></tr></tbody></table>

נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של monocytes/מקרופאגים כדי microenvironment הגידול

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

siRNA בתיווך shRNA דפיקה למטה (KD) שיטות של ויסות גנים כלי יקר ערך להבנת תפקוד גנים וחלבונים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. עם זאת, במקרה כי KD של החלבון עניין השפעה קטלנית על תאים או ההשפעה הצפויה של KD שיטות KD תלויי-זמן, אהבה ללא תנאים אינם מתאימים. מערכות מותנה יותר המתאימים במקרים אלה, היה הנושא של עניין רב. אלה כוללים מערכות ביטוי Ecdysone-inducible, ציטוכרום P-450 אינדוקציה מערכת1, ומוסדרת טטרציקלין מערכות ביטוי גנים.
טטרציקלין מוסדר ג'ין ביטוי המערכת מאפשרת שליטה הפיך על ביטוי חלבון באמצעות אינדוקציה של הביטוי shRNA בנוכחות טטרציקלין. פרוטוקול זה, אנו מציגים עיצוב ניסיוני באמצעות מערכת ט'-על תפקודי בשורות תאים סרטניים אנושיים עבור בקרת מותנה גנים. ואז נדגים את השימוש במערכת זו במחקר של גידול התא-מונוציט אינטראקציה.

שלושה רצפים shRNA נבדקו עבור היעילה KD של פאי-1. בשביל זה, shRNA רצפים נגד פאי-1 ומקושקשת (טבלה 1) היו משובטים לתוך ט-pLKO-פורו ביטוי וקטור בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל. הקו תא fibrosarcoma HT-1080 היה stably transfected עם בונה שנוצר, התאים שטופלו דוקסילין למשך 3 ימים. הביטוי של פאי-1 אומתה על ידי המערבי סופג (איור 2A) ואת האינטנסיביות של הלהקות המתאים פאי-1 וטובולין נותחה על ידי densitometry. באמצעות הרצף KD היעיל ביותר (sh...

פרוטוקול זה משמש ערכה עבור הגדרת מערכת תפקודית ט-על שורות תאים סרטן והשימוש עוקבות, בפרט ללמוד את התפקיד של גידול נגזר התא חלבונים בגיוס ומונוציטים/מקרופאגים כדי microenvironment הגידול.

נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של Monocytes/מקרופאגים כדי Microenvironment הגידול

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לנצל את ההפלגה המותנית של ביטוי גנים בתאי סרטן כדי לחקור את הגיוס של מונוציטים ומקרופאגים למיקרו-סביבת הגידול במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרו-סביבה של הגידול לגבי אופי הצלב בין תאי הסרטן לתאי מערכת החיסון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהמערכת המשמשת כאן דורשת שיבוט וקטורי יחיד, מאפשרת יצירה מהירה של שיבוטים מרובים ומציגה רמות עובי נמוכות מאוד.כמו כן הודגמה שיטה לטיהור מונוציטים אנושיים ללא מגע ישיר עם נוגדנים המונעת הפעלה מקרית וכתוצאה מכך יותר מ-95% אוכלוסייה טהורה של מונוציטים אנושיים. כדי לייצר חלקיקים נגיפיים, העבירו 70% צלחות 150 מילימטר של תאי HEK-293 עם 25 מיקרוגרם של pLKO-tet-on shRNA, 25 מיקרוגרם של פלסמיד אריזת psPAX וחמישה מיקרוגרם של פלסמיד pMD2 המבטא מעטפת. G באמצעות מגיב טרנספקציה לפי פרוטוקולים סטנדרטיים.מוסיפים את התערובת לתבשילים של 150 מילימטר. למחרת, לגרום לייצור Lentiviral בתאים על ידי שינוי המדיום ל-DMEM בתוספת 10 מילי-מולרי נתרן בוטיראט ו-20 מילי-מולרי HEPES. תרבית במשך שמונה שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.לאחר שמונה שעות יש לשטוף את התאים עם PBS ולהוסיף 25 מיליליטר של מדיום DMEM טרי עם HEPES של 20 מילימולר וללא נתרן בוטיראט. לאחר הדגירה למשך 48 שעות, אסוף בזהירות את המדיום המכיל את הנגיף בעזרת פיפטה. כדי ליצור קווי תאים יציבים, התחל בזריעת תאי סרטן המעי הגס HCT-116 ותאי סרטן השד MDA-MB-231 לצלחת של 12 בארות ו-50,000 תאים לבאר.דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. כאשר התאים הם 60-70% מתלכדים, שטפו את התאים עם PBS והוסיפו מיליליטר אחד של מדיום המכיל וירוס לכל באר. למחרת, הסר בזהירות את המדיום המכיל את הנגיף על ידי שאיפה.לאחר מכן לאחר שטיפת התאים עם PBS, הוסף מדיום המכיל FBS נטול טטרציקלין. לאחר 72 שעות, שטפו את התאים כמו קודם והוסיפו מדיום בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר פורומיצין לבחירת תאים שעברו טרנספטציה של הנגיף. בחר תאים שהועברו על ידי וירוס על ידי תרבית תאים בנוכחות פורומיצין במשך שלושה עד 14 ימים.שימו לב להרג חלקי של הבארות על ידי פורומיצין בתאים עם תאים שהועברו על ידי נגיף. תאים שאינם מתמרים לא יגדלו בנוכחות פורומיצין. כאשר תאי בקרה אלה מתו, המשך בתרבית של שורות התאים המווסתים באופן מותנה במשך שבועיים בנוכחות אנטיביוטיקה כדי ליצור את שורות התאים המווסתים על תנאי.ודא את יעילות הפילה המותנית בסרטן המעי הגס HCT-116 העמיד לפורומיצין ובתאי סרטן השד MDA-MB-231 על ידי הוספת מדיום עם ריכוזים שונים של דוקסיציקלין ותרבית התאים למשך 72 שעות. לאחר הכנת ליזאט תאים, ודא את רמת הנוקדאון על ידי ניתוח כתמים מערביים. רמות PAI-1 מוצגות כאן.כדי לבודד מונוציטים בדם היקפי, הכינו תחילה שלושה צינורות של 50 מיליליטר המכילים 15 מיליליטר של תמיסת שיפוע צפיפות. לאחר מכן השתמש בבקר פיפטה המוגדר על זרימת כבידה כדי להניח לאט לאט 30 מיליליטר של דם מדולל על תמיסת שיפוע הצפיפות. צנטריפוגה ברוטור נדנדה בטמפרטורה של 400 גרם בטמפרטורת החדר ללא הפסקות למשך 25 דקות.לאחר הצנטריפוגה, השליכו את השכבה העליונה והעבירו את השכבה האמצעית המכילה תאים חד-גרעיניים בדם היקפי לצינור טרי של 50 מיליליטר והוסיפו PBS בתוספת FBS עד 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב -120 גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר הסיבוב, הסר את הסופרנטנט המכיל טסיות דם.לאחר הצנטריפוגה והאיסוף הסופיים, השעו מחדש את הגלולה ב-50 מיליליטר של PBS בתוספת FBS וספרו את התאים החד-גרעיניים בדם ההיקפיים באמצעות המוציטומטר. לאחר צנטריפוגה של התאים ב-120 גרם, יש להשעות מחדש את הגלולה ב-FBS בתוספת PBS המכילה EDTA מילימולרית אחת לריכוז סופי של 50 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן התחל להעשיר למונוציטים על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים לבחירה שלילית לכל מיליליטר של תרחיף תאים ותערובת.דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה מוסיפים 50 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים למיליליטר, מערבבים ודוגרים עוד 10 דקות. לאחר מכן הוסיפו PBS עם FBS ו-EDTA עד 25 מיליליטר והניחו את תערובת הדם החד-גרעינית ההיקפית במגנט שיכול להכיל צינור של 50 מיליליטר.לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, החרוזים המגנטיים יידבקו לדפנות הצינור ויבודדו את התאים הלא מונוציטים מהתמיסה. השתמש בפיפטה של 25 מיליליטר כדי להסיר תמיסה המכילה מונוציטים מהצינור תוך הקפדה לא לגעת בצידי הצינור עם הפיפטה. לאחר צנטריפוגה והוצאת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה המכילה מונוציטים במדיום RPMI המכיל 10% FBS נטול TET ו-1% עט-סטרפטוקוקוק.התחל את הבדיקה על ידי זריעת 40,000 תאי HCT-116 או MDA-MB-231 בנפח של 0.5 מיליליטר בבארות של צלחת של 24 בארות בשלוש עותקים. למחרת, הוסף פילטר לבאר. לאחר מכן לוחים 8,000 מונוציטים בנפח של 0.3 מיליליטר על תוספת ממברנה נקבובית שטופלה ב-BSA המונחת על גבי תאי הסרטן ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.אוספים את התוספות לאחר 48 שעות. יש לנער את המדיום העודף ולהחליק במדויק את המשטח הפנימי בעזרת אפליקטור עם קצה כותנה כדי להסיר תאים שלא נדדו. מכתים את הצד החיצוני של התוסף בשיטת רייט-גימסה.לאחר הרכבת המסננים עם המקרופאגים המועברים כלפי מעלה, דמיין את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ אור עם יעד הספק של 20. צלם תמונות של תשעה שדות לכל מסנן וספור מקרופאגים שהועברו בכל השדות. מבחן תא בוידן שימש לכימות נדידת מונוציטים לעבר תאים סרטניים.בנוכחות תאי סרטן השד MDA-MB-231, נדידת המונוציטים עוכבה ב-33% לאחר הוספת דוקסיציקלין לתרבית המשותפת כדי לווסת את PAI-1. עיכוב זה של נדידת מונוציטים היה בולט יותר בנוכחות תאי סרטן המעי הגס HCT-116 כאשר הפלת PAI-1 על ידי מתן דוקסיציקלין הפחיתה את נדידת המונוציטים ב-74%תוצאות דומות נצפו כאשר מדיום תנאים לתאי סרטן שטופלו בדוקסיציקלין הוצב בתחתית הבארות כמקור לכימותרפיה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במערכת טט-און פונקציונלית להפלת ביטוי גנים בשורות תאי סרטן אנושיים כדי לחקור את ההשפעה הכימו-אטרקטיבית של חלבון המופרש מסרטן PAI-1 על המונוציטים האנושיים.

conditional-knockdown-gene-expression-cancer-cell-lines-to-study

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

נתאר כאן פרוטוקול לחקור cytotoxicity של טרום הופעל CD8+ T תאים נגד תאים סרטניים על ידי גילוי אפופטוטיים להיפגע סרטן תאים באמצעות בזמן אמת מיקרוסקופ. פרוטוקול זה יכול לחקור מנגנונים מאחורי מיאלואידית הנוצרות על-ידי תאי T cell דיכוי והערכת תרכובות שמטרתה חידוש תאי T באמצעות המצור של תאים חיסוניים מיאלואידית מדכאים.

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לכמת את פעילות כימוטקטיק של דם מונוציטים בדגמי העכבר, כדי להעריך את ההשפעות של התערבויות תזונתיות, תרופתי וגנטי על מונוציט דם ולאפיין את מונוציטים בדם נגזר מקרופאגים ב מודלים לעכבר באמצעות חלבון מונוציט-כימוסטנט-1 (MCP-1)-העמיסו במרתף ממברנה ממברנות ג'ל הנגזר.

הכמת של פעילות כימוכתית מונוציט בVivo ואפיון מקרופאגים הנגזרים מונוציט

מאמר זה מייצג שימושי בתוך מבחנה כדי להעריך את היכולת של המדיום הממוזג מתאי הגידול כדי למשוך מקרופאגים.

בתוך שיטת חוץ גופית כדי ללמוד גידול-מקרופאג אינטראקציה

כדי לבדוק את ההשפעה של כימוקין על גיוס מקרופאג ב vivo, את כל הר היברידיזציה באתרו שימש כדי לזהות את הביטוי החוץ רחמי של כימוקין, וכתמים חיסוני שימש תוויות מקרופאגים. הדמיה חיה שימש התבוננות בזמן אמת של הגירה מקרופאג.

כימוקין חוץ רחמי ביטוי מודל לבדיקת גיוס מקרופאג ב Vivo

כאן, אנו מציגים שיטה באמצעות ממברנה חדיר תומך כדי להקל על המחקר של אי-מגע הפרדרין איתות בשימוש על ידי תאים סרטניים כדי לדכא את התגובה החיסונית. המערכת היא קלה ללמוד את התפקיד של גורמים מופרש הגידול בהפעלת לחות מקרופאג.

לומד את ההשפעות של הקרנף המופרש ליגרין המקרופאג הפעלה באמצעות תרבות שיתוף עם ממברנה חדיר תומך

סרטן היא מחלה קטלנית בשל יכולתה לעבור גרורות לאיברים שונים. קביעת היכולת של תאים סרטניים להגר ולפלוש תחת תנאי טיפול שונים חיונית להערכת אסטרטגיות טיפוליות. פרוטוקול זה מציג שיטה להעריך את היכולות גרורתית בזמן אמת של קו הסרטן הגלינובלסטומה.

עכבה מבוססי מדידה בזמן אמת של סרטן הגירה תאים ופלישה

פרוטוקול זה משתמש בכתבים פלואורסצנטיים ובמיון תאים כדי לפשט ניסויי נוק-אין בקווי תא מקרופאג' ו- T. שני פלסמידים משמשים לניסויים פשוטים אלה, כלומר CRISPR/Cas9- ו- DsRed2-מבטא פלסמיד ותורם רקומבינציה הומולוגי המבטא את EBFP2, המשולב לצמיתות בלוקוס Rosa26 בתאי מערכת החיסון.

נוק-אין של ג'ין על-ידי CRISPR/Cas9 ומיון תאים בקווי תא מקרופאג' ו-T

מאמר זה מתאר זרימת עבודה של טכניקות המשמשות לבדיקת מתווכים מועמדים חדשים של גרורות מלנומה ומנגנוני הפעולה שלהם.

פלטפורמת גילוי חזקה לזיהוי מתווכים חדשים של גרורות מלנומה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקירת האינטראקציה של מקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים אנושיים עם ספרואיד גידול במטריצת קולגן I תלת מימדית (תלת מימדית), עם אפשרות להשוות את ההשפעה של תכונות מסיסות ופיזיקליות של המיקרו-סביבה על פלישת התאים.

בדיקת פלישה משותפת של מקרופאגים-גידול ספרואידים

בהתחשב במודלים המוגבלים של קסנוגרפט הזמינים לחקר אינטראקציות בין CART אנושי לתאים מיאלואידים, הקמנו מודלים במבחנה וב-vivo כדי להבין את ההשפעות של מקרופאגים אנושיים על תאי CART. ניתן להכליל את הממצאים כדי להעריך את תפקידי המקרופאגים במיקרו-סביבת הגידול ולבדוק אימונותרפיות ממוקדות מקרופאגים.

חקר אינטראקציות בין תאים מיאלואידים ותאי CAR T במבחנה וב-In Vivo

למדו נוקאאוט מותנה של גנים בשורות תאי סרטן באמצעות מערכת Tet-ON לחקירת גיוס מונוציטים ומקרופאגים למיקרואנvironment הגידול. שיטה זו מאפשרת הבנה מעמיקה של האינטראקציה בין תאי סרטן למערכת החיסון.

נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של Monocytes/מקרופאגים כדי Microenvironment הגידול

גלה סרטונים נוספים