נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של Monocytes/מקרופאגים כדי Microenvironment הגידול

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לנצל את ההפלגה המותנית של ביטוי גנים בתאי סרטן כדי לחקור את הגיוס של מונוציטים ומקרופאגים למיקרו-סביבת הגידול במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרו-סביבה של הגידול לגבי אופי הצלב בין תאי הסרטן לתאי מערכת החיסון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהמערכת המשמשת כאן דורשת שיבוט וקטורי יחיד, מאפשרת יצירה מהירה של שיבוטים מרובים ומציגה רמות עובי נמוכות מאוד.

כמו כן הודגמה שיטה לטיהור מונוציטים אנושיים ללא מגע ישיר עם נוגדנים המונעת הפעלה מקרית וכתוצאה מכך יותר מ-95% אוכלוסייה טהורה של מונוציטים אנושיים. כדי לייצר חלקיקים נגיפיים, העבירו 70% צלחות 150 מילימטר של תאי HEK-293 עם 25 מיקרוגרם של pLKO-tet-on shRNA, 25 מיקרוגרם של פלסמיד אריזת psPAX וחמישה מיקרוגרם של פלסמיד pMD2 המבטא מעטפת. G באמצעות מגיב טרנספקציה לפי פרוטוקולים סטנדרטיים.

מוסיפים את התערובת לתבשילים של 150 מילימטר. למחרת, לגרום לייצור Lentiviral בתאים על ידי שינוי המדיום ל-DMEM בתוספת 10 מילי-מולרי נתרן בוטיראט ו-20 מילי-מולרי HEPES. תרבית במשך שמונה שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לאחר שמונה שעות יש לשטוף את התאים עם PBS ולהוסיף 25 מיליליטר של מדיום DMEM טרי עם HEPES של 20 מילימולר וללא נתרן בוטיראט. לאחר הדגירה למשך 48 שעות, אסוף בזהירות את המדיום המכיל את הנגיף בעזרת פיפטה. כדי ליצור קווי תאים יציבים, התחל בזריעת תאי סרטן המעי הגס HCT-116 ותאי סרטן השד MDA-MB-231 לצלחת של 12 בארות ו-50,000 תאים לבאר.

דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. כאשר התאים הם 60-70% מתלכדים, שטפו את התאים עם PBS והוסיפו מיליליטר אחד של מדיום המכיל וירוס לכל באר. למחרת, הסר בזהירות את המדיום המכיל את הנגיף על ידי שאיפה.

לאחר מכן לאחר שטיפת התאים עם PBS, הוסף מדיום המכיל FBS נטול טטרציקלין. לאחר 72 שעות, שטפו את התאים כמו קודם והוסיפו מדיום בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר פורומיצין לבחירת תאים שעברו טרנספטציה של הנגיף. בחר תאים שהועברו על ידי וירוס על ידי תרבית תאים בנוכחות פורומיצין במשך שלושה עד 14 ימים.

שימו לב להרג חלקי של הבארות על ידי פורומיצין בתאים עם תאים שהועברו על ידי נגיף. תאים שאינם מתמרים לא יגדלו בנוכחות פורומיצין. כאשר תאי בקרה אלה מתו, המשך בתרבית של שורות התאים המווסתים באופן מותנה במשך שבועיים בנוכחות אנטיביוטיקה כדי ליצור את שורות התאים המווסתים על תנאי.

ודא את יעילות הפילה המותנית בסרטן המעי הגס HCT-116 העמיד לפורומיצין ובתאי סרטן השד MDA-MB-231 על ידי הוספת מדיום עם ריכוזים שונים של דוקסיציקלין ותרבית התאים למשך 72 שעות. לאחר הכנת ליזאט תאים, ודא את רמת הנוקדאון על ידי ניתוח כתמים מערביים. רמות PAI-1 מוצגות כאן.

כדי לבודד מונוציטים בדם היקפי, הכינו תחילה שלושה צינורות של 50 מיליליטר המכילים 15 מיליליטר של תמיסת שיפוע צפיפות. לאחר מכן השתמש בבקר פיפטה המוגדר על זרימת כבידה כדי להניח לאט לאט 30 מיליליטר של דם מדולל על תמיסת שיפוע הצפיפות. צנטריפוגה ברוטור נדנדה בטמפרטורה של 400 גרם בטמפרטורת החדר ללא הפסקות למשך 25 דקות.

לאחר הצנטריפוגה, השליכו את השכבה העליונה והעבירו את השכבה האמצעית המכילה תאים חד-גרעיניים בדם היקפי לצינור טרי של 50 מיליליטר והוסיפו PBS בתוספת FBS עד 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב -120 גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר הסיבוב, הסר את הסופרנטנט המכיל טסיות דם.

לאחר הצנטריפוגה והאיסוף הסופיים, השעו מחדש את הגלולה ב-50 מיליליטר של PBS בתוספת FBS וספרו את התאים החד-גרעיניים בדם ההיקפיים באמצעות המוציטומטר. לאחר צנטריפוגה של התאים ב-120 גרם, יש להשעות מחדש את הגלולה ב-FBS בתוספת PBS המכילה EDTA מילימולרית אחת לריכוז סופי של 50 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן התחל להעשיר למונוציטים על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים לבחירה שלילית לכל מיליליטר של תרחיף תאים ותערובת.

דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה מוסיפים 50 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים למיליליטר, מערבבים ודוגרים עוד 10 דקות. לאחר מכן הוסיפו PBS עם FBS ו-EDTA עד 25 מיליליטר והניחו את תערובת הדם החד-גרעינית ההיקפית במגנט שיכול להכיל צינור של 50 מיליליטר.

לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, החרוזים המגנטיים יידבקו לדפנות הצינור ויבודדו את התאים הלא מונוציטים מהתמיסה. השתמש בפיפטה של 25 מיליליטר כדי להסיר תמיסה המכילה מונוציטים מהצינור תוך הקפדה לא לגעת בצידי הצינור עם הפיפטה. לאחר צנטריפוגה והוצאת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה המכילה מונוציטים במדיום RPMI המכיל 10% FBS נטול TET ו-1% עט-סטרפטוקוקוק.

התחל את הבדיקה על ידי זריעת 40,000 תאי HCT-116 או MDA-MB-231 בנפח של 0.5 מיליליטר בבארות של צלחת של 24 בארות בשלוש עותקים. למחרת, הוסף פילטר לבאר. לאחר מכן לוחים 8,000 מונוציטים בנפח של 0.3 מיליליטר על תוספת ממברנה נקבובית שטופלה ב-BSA המונחת על גבי תאי הסרטן ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

אוספים את התוספות לאחר 48 שעות. יש לנער את המדיום העודף ולהחליק במדויק את המשטח הפנימי בעזרת אפליקטור עם קצה כותנה כדי להסיר תאים שלא נדדו. מכתים את הצד החיצוני של התוסף בשיטת רייט-גימסה.

לאחר הרכבת המסננים עם המקרופאגים המועברים כלפי מעלה, דמיין את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ אור עם יעד הספק של 20. צלם תמונות של תשעה שדות לכל מסנן וספור מקרופאגים שהועברו בכל השדות. מבחן תא בוידן שימש לכימות נדידת מונוציטים לעבר תאים סרטניים.

בנוכחות תאי סרטן השד MDA-MB-231, נדידת המונוציטים עוכבה ב-33% לאחר הוספת דוקסיציקלין לתרבית המשותפת כדי לווסת את PAI-1. עיכוב זה של נדידת מונוציטים היה בולט יותר בנוכחות תאי סרטן המעי הגס HCT-116 כאשר הפלת PAI-1 על ידי מתן דוקסיציקלין הפחיתה את נדידת המונוציטים ב-74%תוצאות דומות נצפו כאשר מדיום תנאים לתאי סרטן שטופלו בדוקסיציקלין הוצב בתחתית הבארות כמקור לכימותרפיה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במערכת טט-און פונקציונלית להפלת ביטוי גנים בשורות תאי סרטן אנושיים כדי לחקור את ההשפעה הכימו-אטרקטיבית של חלבון המופרש מסרטן PAI-1 על המונוציטים האנושיים.