Name: כימוקין חוץ רחמי ביטוי מודל לבדיקת גיוס מקרופאג ב Vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: חקור גיוס מקרופאגים באמצעות כימוקין בדגי זברה חיים. שיטת הדמיה בזמן אמת חושפת דפוסי נדידה תאית דינמיים ומסייעת להבנת תפקידי חלבונים במערכת החיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד ר ג'ינגרן פנג על שיתוף הקו הטרנסגניים של Tg (fabp10a: DsRed) ; ד ר זילונג וון על שיתוף הקווים הטרנסגניים של Tg (mpeg1: GFP) ; ד ר קואיצ'י קווקאמי על אספקת וקטור pTol2. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31771594), גואנג-דונג מדעי וטכנולוגיה תוכנית פרויקטים (2019A030317001) ואת קרנות המחקר הבסיסי של האוניברסיטאות המרכזיות (D2191450).

הערה: כל הדגימות טופלו על ידי פנילטימאוראה (PTU) מי ביצים כדי לעכב פיגמנט.
1. יצירת מבנים Tg (fabp10a: il34) והזרקת דגים
<ol><li>לשכפל את 2.8 kb fabp10a יזם8 ו-IL-34 באזורי הקידוד (ensdart 00000126460.3) של דג דג זברה לתוך וקטור pTol2 כדי ליצור את fabp10a il34 בניית. הכנס את המבנה לשלב האחד של התאים Tg (mpeg1: gfp) ו WT של העוברים והדגים יחד עם הטרנספזדאז mrna. העלה את fabp10a-il34 הזריק העוברים WT למבוגר9 ולזהות את המייסד הטרנסגניים על ידי היברידיזציה באתרו. הערה: ההזרקה של Tol2 לבנות ישירות לתוך טרנסגניים אחרת יכול להיות בעייתי אם הקו השני הטרנסגניים נעשה עם אותו מערכת טרנספסון. תרגול כללי יהיה ליצור קו טרנסגניים בלתי תלוי ולאחר מכן לחצות את הקו החדש עם קו אחר של כתב. דבר זה מבטיח שלא יהיו השפעות של הטרנסגנזה החדשה על-ידי העברה שנוספה בעבר.</li>
</ol>2. הר פלורסנט שלם באתרו היברידיזציה (מאחל) לשלב עם כתמים חיסוני
<ol><li>קיבוע דגימה
	<ol>
<li>לאסוף עוברים של הזרקה ארעית או יציבה IL-34 העברת קו שחצה עם Tg (mpeg1: GFP) בשלבים הרצויים. הערה: עבור מקרה זה, העוברים נאספו ב 4 הפריה פוסט מימדית (dpf). (אם יש צורך) להסיר את chorion על ידי מזרק.</li>
		<li>לתקן את העוברים עם 4% פאראפורמלדהיד (בכיתה) ב -4 ° צ' או 2 h בטמפרטורת החדר (RT) (כ-25 ° c).</li>
		<li>לשטוף את העוברים עם מלוחים באגירה פוספט בתוספת רצף 20 (PBST) 3x 5 דקות.</li>
		<li>הדהים את העוברים בנפרד עם 50% מתנול ב-PBST (50% מתנול/PBST) ו 100% מתנול, 1x 5 דקות כל אחד. לאחר מכן, לשנות את 100 טרי% המתנול ו לאחסן ב-20 ° צ' (לפחות 2 h). הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.</li>
	</ol></li>
	<li>הכלאה בדיקה (יום I)
	<ol>
<li>העברה מחדש של העוברים בשלבים הקודמים עם 50% מתנול ב PBST (50% מתנול/PBST), ולאחר מכן לשטוף עם PBST 3x 5 דקות.</li>
		<li>לעכל את העוברים עם פרוטאינאז K ב PBST at RT (ריכוז סופי: 10 μg/mL; 1:2000 ב PBST). הערה: זמן העיכול תלוי בשלב העוברים: פחות מ 36 h לאחר הפריה (hpf), אין צורך; 36 hpf-2 dpf העובר, 3-5 דקות; 2-3 dpf העובר, 10 דקות; 3-4 dpf העובר, 15 דקות; 4-5 dpf העובר, 15-20 דקות; 5-6 dpf העובר, 20-27 דקות; > 6 dpf העובר, 25-30 דקות at RT (כ 25 ° c).</li>
		<li>התעלם מפתרון העיכול ובצע את הקיבעון שוב עם 4% לפחות, עבור 20 דקות ב-RT.</li>
		<li>לשטוף את העוברים עם PBST 2x 10 דקות.</li>
		<li>להיפטר PBST, לבצע טרום היברידיזציה עם מאגר היברידיזציה מחומם (HB מאגר) ב 65 ° c עבור 5 דקות, למחזר את מאגר HB לתוך השפופרת המקורית.</li>
		<li>בצע טרום היברידיזציה עם מאגר HB מחומם חדש ב 65 ° c לפחות 1 h.</li>
		<li>לפני החום החללית9 (עבור המקרה הזה היה il34 בדיקה, 1 ng/ML) ב 65 ° c לפחות 10 דקות. לאחר מכן מחזר את מאגר ה-HB לתוך השפופרת המקורית. לבצע הכלאה עם המקדח מחומם מראש ב 65 ° c בלילה.</li>
	</ol></li>
	<li>נוגדן טיפול (יום II)
	<ol>
<li>מחממים את 50% בתוספת העירוי/2x מלוחים נתרן ציטראט ועוד רצף 20 (SSCT), 2x SSCT, 0.2 x SSCT ב 65 ° c.</li>
		<li>למחזר את המקדח לתוך הצינור המקורי ולאחסן את הגשוש ב-20 ° c.</li>
		<li>שטוף את העוברים בנפרד עם 50% טופסSSCT; 2x SSCT; 0.2 x SSCT, 3x 20 דקות או 2 x 30 דקות כל אחד ב 65 ° c.</li>
		<li>לשטוף את העוברים עם PBST 3x 5 דקות.</li>
		<li>לחסום את הדגימות עם 600 μL של חסימת מאגר (5% סרום העובר מסוננים (FBS) ב PBST) עבור 1 h ב RT.</li>
		<li>להוסיף 400 μL של אנטי digoxigenin-HRP הפתרון הנוגדן (1:1000-1:2000 במאגר חסימת) ו הדגירה של העוברים ב 4 ° c לילה. אם אותות חלשים, להשתמש 1:500 דילול של נוגדן.</li>
	</ol></li>
	<li>צביעה ונוגדן ראשי הדגירה (יום III)
	<ol>
<li>להסיר את הנוגדן; לשטוף את העוברים עם PBST, 6x 20 דקות ב RT.</li>
		<li>לשטוף את המדגם עם 30 μL של 1x פלוס הגברה דילול עבור 5 דקות ב RT.</li>
		<li>להיפטר הדילול על ידי ליטוף; לדלל את Fluorophore מניות הפתרון המלאי (Cyanine 3 פלוס מגיב הגברה (Cy3) או Cyanine 5 פלוס הגברה מגיב (Cy5), עבור מקרה זה Cy3 שימש) 1:50 ב 1x פלוס הגברה מדלל לעשות את Fluorophore הפתרון העבודה. הכינו 50-100 μL של פתרון עבודה עבור כל דוגמה.</li>
		<li>מודטה את המדגם של הפתרון העובד Fluorophore טירמידה עבור 5-15 דקות בחושך ב-RT. אם האותות חלשים, הארך את זמן הדגירה ל-30 דקות.</li>
		<li>עצור את התגובה על ידי שינוי פתרון העבודה עם PBST ובדוק את האותות.</li>
		<li>לשטוף את העוברים עם PBST 3x 10 דקות ב RT.</li>
		<li>מודאת המדגם עם הנוגדן העיקרי ב 4 ° c לילה. במקרה זה, השתמש נוגדן אנטי GFP כמו הנוגדן העיקרי.</li>
	</ol></li>
	<li>מכתים נוגדן משני (יום IV)
	<ol>
<li>לשטוף את העוברים עם PBST עבור 4x 30 דקות.</li>
		<li>מודיית את העוברים עם נוגדן משני ב 4 ° c לילה. במקרה זה, להשתמש באלקסה 488-נוגדן נגד עז כמו הנוגדן המשני.</li>
	</ol></li>
	<li>צלם תמונות (יום חמישי)
	<ol>
<li>לשטוף את העוברים עם PBST 3x 10 דקות ב RT.</li>
		<li>לאחסן את העוברים ב 70% גליצרול בחשיכה ב -4 ° c ללילה או-20 ° צ' למשך זמן רב יותר.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הדמיה חיה
<ol><li>
בחירת דוגמה הערה: השתמש בתמונה חיה כדי להתבונן ישירות אם מקרופאגים של Tg (fabp10a: Il34; fabp10a: dsred; mpeg1: gfp) דג היה להגר לתוך הכבד תחת IL-34 אינדוקציה במהלך 3-3.5 dpf. כאן קו הטרנסגניים Tg (Fabp10a-dsred) משמש כדי לתייג את אזור הכבד ולהפוך אותו לגלוי, כדי להקל על לוקליזציה של הכבד כדי לקבוע אם מקרופאגים להגר לתוך הכבד. לפני הדמיה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לבחור את ה-DsRed ו-GFP כפול עוברים חיוביים.</li>
	<li>
הרכבה על דגים
	<ol>
<li>השתמש באמבט מתכת כדי לחמם 1 מ ל של 1% ההיתוך נמוך התכה עד מעל 90 ° צ' כדי להמיס לחלוטין את זה.</li>
		<li>לאחר המסת ההיתוך נמוכה הוא מקורר טמפרטורת הגוף, להוסיף 50 μL של 0.2% tricaine, ו לערבב אחיד tricaine עם agarose.</li>
		<li>הזיזו את העוברים הכהקטנים לצלוחית קטנה שנטענה עם שקופית כיסוי בתחתית, הסירו את המים שמסביב, הורידו לאט את האגקם הנמוך הנמס על העוברים, הציבו בזהירות את מיקום הדג לפני שהאגקם מתחזק, שמרו על אזור הכבד קרוב ל שקופית הכיסוי בתחתית המנה.</li>
		<li>לאחר המסת ההיתוך נמוך הוא מתחזק, בזהירות לכסות את זה עם שכבה נוספת של agarose כדי לחזק אותו.</li>
		<li>מניחים את המנה על השולחן המוביל במיקרוסקופ, כיסו את הדג בפתרון E210 עם tricaine והתחלת הדמיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הפעלת תוכנה של המיקרוסקופ הקונקלית
	<ol>
<li>פתח את התוכנה זן שחור 2.3 , להתקין את העבודה התא חי על הטבלה נושאת המיקרוסקופ.</li>
		<li>לחץ על אתר | דגירה | טמפרטורה לקביעת טמפרטורה 29 ° c.</li>
		<li>מניחים את המנה במרכז העבודה של התא החי, כיסו את הדג בפתרון E210 עם טריקיין.</li>
		<li>לחצו על תפריט הרכישה , בחרו במצב הסריקה הנדרש ולייזרים בתפריט ' הגדרה חכמה ', ולאחר מכן בחרו Z-מחסנית ומיקום.</li>
		<li>לחץ על תפריט מעצב הניסוי , בחר באפשרות הפעל ניסוי בלוק מרובה, בבלוק הראשון, כדי למצוא את המדגם תחת ההגדלה הנמוכה, ולאחר מכן עבור להגדלה הגבוהה, הנח לאזור הנצפה במרכז השדה החזותי.</li>
		<li>הגדר את מידע המיקום וערימת ה-Z, בחר את עוצמת הלייזר המתאימה, סריקת שכבות ומהירות הדמיה.</li>
		<li>צור בלוק חדש וחזור על השלבים שלעיל. לאחר הגדרת כל הבלוקים, להגדיר את המספר המתאים של לולאות ולהתחיל הקלטה (איור 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-34+is+a+tissue-restricted+ligand+of+CSF1R+required+for+the+development+of+Langerhans+cells+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia.</a> Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).</li>
<li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+cytokine+and+its+receptor+by+functional+screening+of+the+extracellular+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome.</a> Science. 320 (5877), 807-811 (2008).</li>
<li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+overlap+but+differential+expression+of+CSF-1+and+IL-34+in+their+CSF-1+receptor-mediated+regulation+of+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells.</a> Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).</li>
<li>Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-34+Induces+the+Differentiation+of+Human+Monocytes+into+Immunosuppressive+Macrophages.+Antagonistic+Effects+of+GM-CSF+and+IFNc%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc.</a> PLoS One. 8 (2), e56045(2013).</li>
<li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-1+regulates+the+biological+activities+of+interleukin-34%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).</li>
<li>Zhou, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-28-5p-IL-34-macrophage+feedback+loop+modulates+hepatocellular+carcinoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis.</a> Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).</li>
<li>Gordon, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+expression+and+developmental+regulation+of+two+genes+coding+for+rat+fatty+acid+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon. Eugene, OR. (2000).</li>
<li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%BCsslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%3A+a+practical+approach%22">Zebrafish: a practical approach</a>. , Oxford University Press. New York. (2002).</li>
<li>Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopically+Expressed+IL-34+Can+Efficiently+Induce+Macrophage+Migration+to+the+Liver+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לנו לחקור את הפונקציה של כימוקין על ההתנהגות של macrophagein vivo וההליך דורש מומחיות טכנית מסוימת. לסיכום, ישנם מספר שלבים קריטיים כדי למנוע סיבוכים בפרוטוקול: 1) לבחור קו טרנסגניים מתאים אשר מציג אות הטרנסגניים ספציפיים וחזקים כדי לתייג את תא הריבית; 2) לבחור את הרקמה המתאימה אשר נגיש עבור הדמיה של גן ההדמיה הטרנסגניים; 3) להפוך לווין רגיש וספציפי RNA; 4) בחר חלון זמן התבוננות מתאים כדי ללכוד במדויק את התנהגות התא.
בהליך של הר הקרינה הפלואורסצנטית באתרו היברידיזציה...

Zebrafish הוא קטן טרופי קשה עצמות מתוקים דגים מקורו בהודו. בנוגע לשימור הגנים, יש דמיון של 87% לאדם1. זה יכול לספק לנו תובנות על נושאים קשורים של בני אדם על ידי לימוד רגולציה גנים, חלבון תפקוד והתנהגות התא כגון הגירה, הפצת et.al ב zebrafish. העובר מדגים ניתן להשתמש כדי להתבונן התפתחות של עוברים מוקדם בשלבים שונים לאחר פיגמנט מעכב. בינתיים, זה לוקח רק שלושה חודשים כדי להתפתח בגרות מינית, אז דג הדגים יכול לייצר מאות ביצים כל 4 ימים. מיני גודל, רבייה פשוטה, קיבולת הרבייה חזקה, יתרונות אלה להפוך תרבות דג זברה מאוד חיסכון בחלל, תורם לתרבות בקנה מידה גדול. העכבר מודל היונקים המסורתי יש עלויות תחזוקה גבוהה יותר מאשר zebrafish, ולכן הגבלת היקף העלאת העכבר. בהיבט של התפתחות העובר המוקדם, העובר העכבר קשה להתבונן במצב חי בשל מאפייני התפתחות העובר העכבר ברחם האם. להיפך, עוברי דג מפתחים מבחוץ ושקופים, לכן קל להתבונן מתחת למיקרוסקופ. יתר על כן, דג זברה הוא קל מאוד לבנות מגוון של קווים טרנסגניים למחקר הקשורים לפונקציות גן. כיום, קווים טרנסגניים שונים הניתנים להוספת תוויות לסוגים שונים של תאים. זה מאוד נוח עכשיו לבנות קווים טרנסגניים כדי overexpress נוגדנים במיקומים ספציפיים וללמוד את הפונקציה נוגדנים על התנהגות התא ב-zebrafish.
כאן, סיפקנו זרימת עבודה כדי להשתמש בשורה הטרנסגניים של הדגים כדי לחקור את הפונקציה של IL-34 על התנהגות מקרופאג ב vivo2,3,4,5,6,7. ראשית, אנו בנינו ביטוי מופרז של הכבד היתר פלבאמצע של הגן il34 והזריק את הפלבאמצע לשלב של תא אחד Tg (MPEG1: gfp) עוברי דגים אשר במפורש מתויג מקרופאגים על ידי חלבון פלורסנט gfp. אז, השתמשנו פלורסנט כל הר באתרו היברידיזציה החיסונית כדי לזהות את התבנית של הביטוי il34 ואת מספר או מיקום של מקרופאגים. עוברי WT מוזרק הועלו כדי ליצור קו טרנסגניים יציב. בשלבים אלה, הקמנו ובנו אימות של קו הייצור cytokine ויזואלית העריכו את ההשפעות שניתן לראות על התפלגות מקרופאג. לבסוף, כדי לחקור התנהגות מקרופאג בתגובה cytokine, השתמשנו הדמיה חיה קונפוקלית וקד להתבונן ישירות מקרופאג הגירה כדי לאשר את הפונקציה של il34 על הגירה מקרופאג בvivo.

<table><tbody><tr><td><נוגדן חזק></חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-נוגדן נגד עזים</td><td>Invitrogen</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-דיגוקסיגנין-HRP&nbsp;</td><td>perkinelmer</td><td>NEF832001EA</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן עז-אנטי-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab6658</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנט</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>21097</td><td></td></tr><tr><td>ציאנין 3 פלוס מגיב הגברה</td><td>perkinelmer</td><td>NEL745001KT</td><td></td></tr><tr><td>E2 פתרון</td><td></td><td></td><td>15 מ"מ&nbsp; NaCl +0.5 מ"מ KCl +1.0 מ"מ MgSO<תת>4+150 ומיקרו; M&nbsp; KH2PO4 + 50 & micro; M&nbsp; Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Life</td><td>10099-133</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>יהלום</td><td>A100314</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>V900860</td><td></td></tr><tr><td>Heparin נתרן</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>חוצץ היברידיזציה (HB)</td><td></td><td></td><td>50% פורממיד+ 5 פעמים; SSC+9 מ"מ נתרן ציטראט+50 &mu; גרם/מ"ל הפרין נתרן+ 500 &mu; גרם/מ"ל tRNA+ 0.1% Tween20</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז נמס נמוך</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>GHTECH</td><td>1.17112.023</td><td></td></tr><tr><td>מתילן כחול&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>להשעות 16 גרם PFA ב-400 מ"ל של 1x PBS, לחמם ב-60 מעלות; C&nbsp; להתמוסס כ -30 דקות. ניתן להכין תמיסה זו מראש ולאחסן בטמפרטורה של -4 מעלות צלזיוס. זהירות. מניפולציה עם מסכה.</td></tr><tr><td>10 פעמים; PBS</td><td></td><td></td><td>14.2 גרם Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 גרם KH2PO4 in 1L ddH2</td></tr><tr><td>O Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>1& בתוספת הגברה מדלל</td><td>פרקינלמר</td><td>NEL745001KT</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>E00492</td><td></td></tr><tr><td>20&; נתרן ציטראט מלוח (SSC)</td><td></td><td></td><td>175.3 גרם NaCl+ 88.2 גרם נתרן ציטראט ב-1 ליטר ddH2O, PH 7.0</td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>סיגמא</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>טריקאין</td><td>סיגמא</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>tRNA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pBLK-fabp10a-il34-sv40</td><td></td><td></td><td>עבור Tg (fab10a:il34) דור קו טרנסגני</td></tr><tr><td>pBSK-il34</td><td></td><td></td><td>עבור il34 הכנת בדיקה</td></tr><tr><td><חזק>דגים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg (mpeg1: GFP)</td><td></td><td></td><td>סמן מקרופאגים עם GFP</td></tr><<tr><td>em>Tg (fabp10a: DsRed)</td><td></td><td></td><td>סמן תאי כבד עם DsRed</td></tr><tr><td>Tg (fab10a:il34)</td><td></td><td></td><td>ביטוי יתר של IL-34 בתאי כבד</td></tr></tbody></table>

כימוקין חוץ רחמי ביטוי מודל לבדיקת גיוס מקרופאג ב vivo

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

זברפיש משמשים רבות במחקר בסיסי וביורפואי. קווים הטרנסגניים רבים הזמינים כעת כדי לתייג סוגים שונים של תאים. בשל הגוף עובריים שקוף של דג zebrafish, זה נוח לנו ללמוד את ההשפעה של כימוקין אחד על ההתנהגות של סוג מסוים של תאים בvivo. כאן סיפקנו זרימת עבודה כדי לחקור את הפונקציה של כימוקין על הגירה מקרופאג ב vivo. בנינו ביטוי מופרז רקמות מוגזם כדי overexpression IL-34 והזריק את הפלבאמצע לתוך השלב תא אחד העוברים דגים מקרופאגים שסומנו במפורש על ידי חלבון פלורסנט. לאחר מכן השתמשנו פלואורסצנט הר שלם ב היברידיזציה באתרו ו חיסוני כדי לזהות את התבנית של הביטוי כימוקין ואת מספר או מיקום של מקרופאגים. עוברי WT מוזרק הועלו כדי ליצור קו טרנסגניים יציב. בסופו של דבר, השתמשנו קונפוקלית וקד חי הדמיה כדי להתבונן ישירות התנהגות מקרופאג בדגים טרנסגניים יציבה כדי ללמוד את הפונקציה של IL-34 על מקרופאגים ב vivo.

השלבים המעורבים בפרוטוקול הדגים מאוירים באיור 2. ראשית, יצרנו את pBLK-fabp10a-il34-sv40 המבנה שבו il34 היה מונע על ידי היזם fabp10a (איור 2). המבנה היה microinjected לתוך תא אחד בשלב Tg (mpeg1: gfp) דג זברה עוברים אשר יכול לתייג מקרופאגים עם עוברי gfp ו WT אשר הועלו למבוגרים כדי ליצור קו יציב טרנסגניים (איור 2). הביטוי של il34 נותחו על ידי הזריחה כל הר היב...

כדי לבדוק את ההשפעה של כימוקין על גיוס מקרופאג ב vivo, את כל הר היברידיזציה באתרו שימש כדי לזהות את הביטוי החוץ רחמי של כימוקין, וכתמים חיסוני שימש תוויות מקרופאגים. הדמיה חיה שימש התבוננות בזמן אמת של הגירה מקרופאג.

כימוקין חוץ רחמי ביטוי מודל לבדיקת גיוס מקרופאג ב Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לנו לחקור את הפונקציה של כימוקין ואת ההתנהגות של מקרופאג ' ב vivo. רוב המודלים הניסיוניים הקיימים של chemotaxis התא מבוססים על ניסויים בתאי במבחנה. אבל ניסויים במבחנה לפעמים הם פשוטים מדי כדי מודל הסביבה המורכבת ב vivo.כמו כן, הם לא יכולים לייצג את יכולת הכימותרפיה ב vivo. שיטות אלה מנצלות את היתרון הספציפי של דגי זברה לתצפית ישירה על התנהגות התא, דבר שקשה לעכברים. התחל על ידי יצירת TGFABP-10A אינטרלוקין-34 מבנים מהופנטים.להזריק את FABP-10A interleukin-34 מבנים לתוך תא אחד שלב Tg(mpeg1:GFP)מהופנט עוברי דגים מסוג בר יחד עם MRNA טרנספוסאז. להעלות ולאסוף את העוברים על פי הוראות כתב היד. לאחר מכן, לתקן אותם עם 4% paraformaldehyde לילה ב 4 מעלות צלזיוס או במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.לאחר הקיבעון, לשטוף את העוברים עם PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לייבש את העוברים בנפרד עם 50% מתנול ב PBST, ואחריו 100% מתנול, ואז לשנות טרי 100% מתנול, ולאחסן אותם שלילי 20 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות. כאשר מוכן להכלאה בדיקה, rehydrate העוברים בנפרד ב 50% מתנול ב PBST.לאחר מכן, לשטוף אותם עם PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לעכל את העוברים עם proteinase K ב PBST בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השלך את פתרון העיכול, וחזור על קיבעון עם 4%paraformaldehyde במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הקיבעון, לשטוף את העוברים פעמיים עם PBST במשך 10 דקות לכל לשטוף. בצע prehybridization עם חיץ הכלאה מחומם ב 65 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת. לאחר מכן, מחממים את הבדיקה אינטרלוקין-34 ל 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.למחזר את חיץ ההכלאה לתוך הצינור המקורי ולבצע הכלאה עם בדיקה שחומם מראש ב 65 מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחר, לשטוף את העוברים עם 50% formamide ו 2X SSCT ואחריו 2X SSCT ולאחר מכן 0.2X SSCT ב 65 מעלות צלזיוס. חוזרים על כל שטיפה שלוש פעמים עם 20 דקות לכביסה.לאחר מכן, לשטוף את העוברים שלוש פעמים עם PBST במשך חמש דקות לכל לשטוף. חסום את הדגימות עם 600 מיליליטר של חיץ חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 400 microliters של פתרון נוגדנים נגד digoxigenin HRP ולהדגיר את העוברים בארבע מעלות צלזיוס לילה.למחרת, להסיר את הנוגדן ולשטוף את העוברים שש פעמים עם PBST במשך 20 דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לשטוף כל מדגם עם 30 microliters של 1X בתוספת דילואנט הגברה במשך חמש דקות. הדגירה את הדגימות בפתרון טיראמין פלואורופור במשך חמש עד 15 דקות בחושך.הארכת זמן הדגירה ל-30 דקות אם האותות חלשים. לאחר מכן, לשטוף את העוברים עם PBST שלוש פעמים במשך 10 דקות לכל לשטוף. ותדיגר אותם עם הנוגדן העיקרי ב-4 מעלות צלזיוס בן לילה.ביום שלמחר, לשטוף את העוברים חמש פעמים עם PBST במשך 30 דקות לכל לשטוף, ולהדקר אותם עם הנוגדנים המשניים בארבע מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחר, לשטוף את העוברים שלוש פעמים PBST במשך 10 דקות לכל לשטוף, ולאחסן אותם 70% גליצרול בחושך בארבע מעלות צלזיוס או שלילי 20 מעלות צלזיוס במשך זמן רב יותר. לפני ההדמיה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבחור את העוברים החיוביים האדומים וה-GFP של DS.כדי להרים את הדגים, השתמש באמבט מתכת כדי לחמם מיליליטר אחד של 1% התכה נמוכה התעוררה מעל 90 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לקרר אותו לטמפרטורת הגוף ומערבבים 50 microliters של 0.2% tricaine. מעבירים את העוברים הרדמה לצלחת קטנה המותקנת עם מגלשת כיסוי בתחתית.מוציאים את המים שמסביב ומפילים באיטיות את ההמסה הנמוכה שעל העוברים. בזהירות להגדיר את המיקום של הדג לפני agarose התגבש, שמירה על אזור הכבד קרוב למגלשת הכיסוי. לאחר שהתעוררות התגבשה, בזהירות לכסות אותו עם שכבה אחרת של התעוררות כדי לחזק אותו.מניחים את המנה על שולחן נושאת המיקרוסקופ הקונפוקל, מכסים את הדגים בתתווית E2 בטרקאין ומתחילים בהדמיה. כדי להפעיל את מיקרוסקופ הקונפוקל, פתח את תוכנת Zen Black 2.3 ולחץ על אתר, לאחר מכן הדגירה, ולאחר מכן הגדר את הטמפרטורה ל -29 מעלות צלזיוס. לחץ על תפריט הרכישה ובחר את מצב הסריקה הנדרש ואת הלייזרים בתפריט ההתקנה החכמה.לאחר מכן בחר מחסנית Z ומיקום. לחץ על תפריט מעצב ניסיוני ובחר לאפשר ניסוי בלוק רב בבלוק הראשון כדי למצוא את המדגם תחת הגדלה נמוכה. לאחר מכן, עבור להגדלה הגבוהה ותן לאזור שנצפה במרכז שדה הראייה.הגדר את המיקום ואת מידע מחסנית Z. לאחר מכן, בחרו בעוצמת הלייזר המתאימה, בשכבות הסריקה ומהירות ההדמיה. לאחר הגדרת כל הבלוקים, הגדר את המספר המתאים של לולאות והתחל להקליט.פרוטוקול זה שימש להזרקת interleukin-34 ספציפי לכבד מעל ביטוי פלסמיד לעוברים דגים מהופנטים, אשר מקרופאגים תויגו עם GFP. פלואורסצנטיות מלאה של הר בהכלאה ו immunostaining situ שימשו כדי לנתח את הביטוי של אינטרלוקין-34 ואת מקרופאגים שכותרתו GFP. מספרי תאי המקרופאג' נותחו כמותית באזור העוברים והזנב הלא מנוגנים והוזרקו.הדמיה חיה שימשה להתבוננות ישירה מקרופאגים, שכותרתו ירוק, עובר על ידי הכבד של דג שליטה נודד לתוך הכבד של interleukin-34 מעל ביטוי דגים. השלבים החשובים של פרוטוקול זה כוללים את הבחירה של קו מהומר מתאים כדי לתייג את התא של עניין. ורקמות מתאימות להדמיה הביטוי שלך של גן מהומר, כמו גם חלון זמן תצפית מתאים.טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד את הפונקציה של כימוקינים אחרים על ההתנהגות של תאים אחרים, כגון תאי T ונויטרופילים ב vivo.

an-ectopic-chemokine-expression-model-for-testing-macrophage

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בסרטון זה, אנו חוקרים אינטראקציה בין גידולים למקרופאגים באמצעות בדיקת אינטראקציה מבוססת פלואורסצנטיות של מקרופאגים טרנסוולים. הבדיקה כוללת ניתוח של נדידת מקרופאגים באמצעות כימוטקסיס המושרה על ידי כימיקלים.

בדיקת משיכה למקרופאגים מבוססי פלואורסצנטיות: שיטה במבחנה לחקר אינטראקציה בין גידולים למקרופאגים באמצעות כימוטקסיס המושרה על ידי כימיקלים

פרוטוקולים עבור הערכה כמותית של לימפוציטים כימוטקסיס והעברה הן כלי חשוב עבור מחקר באימונולוגיה. . הנה, פרוטוקול במבחנה מתואר כי היתרים בזמן אמת, מרובב הערכה של נדידת תאים, כמו גם משלימים ויוו טכניקה המאפשרת מעקב של תאים מקורית על הטחול.

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

פרוטוקול זה משמש ערכה עבור הגדרת מערכת תפקודית ט-על שורות תאים סרטן והשימוש עוקבות, בפרט ללמוד את התפקיד של גידול נגזר התא חלבונים בגיוס ומונוציטים/מקרופאגים כדי microenvironment הגידול.

נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של Monocytes/מקרופאגים כדי Microenvironment הגידול

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לכמת את פעילות כימוטקטיק של דם מונוציטים בדגמי העכבר, כדי להעריך את ההשפעות של התערבויות תזונתיות, תרופתי וגנטי על מונוציט דם ולאפיין את מונוציטים בדם נגזר מקרופאגים ב מודלים לעכבר באמצעות חלבון מונוציט-כימוסטנט-1 (MCP-1)-העמיסו במרתף ממברנה ממברנות ג'ל הנגזר.

הכמת של פעילות כימוכתית מונוציט בVivo ואפיון מקרופאגים הנגזרים מונוציט

מאמר זה מייצג שימושי בתוך מבחנה כדי להעריך את היכולת של המדיום הממוזג מתאי הגידול כדי למשוך מקרופאגים.

בתוך שיטת חוץ גופית כדי ללמוד גידול-מקרופאג אינטראקציה

הציג כאן הוא פרוטוקול כדי לזהות מלכודת מקרופאג מסחטות (MET) ייצור בתרבות התא החי באמצעות מיקרוסקופ וכתמים פלואורסצנטית. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב עוד יותר כדי לבחון סמנים מסוימים של החלבון נפגשו על-ידי כתמים immunofluorescence.

בגירוי חוץ-גופית והדמיה של שחרור מלכודת השמנה ב הבדיל מונוקרוציט האדם הנגזר

כאן אנו מתארים שיטות באמצעות שעות הזמן, מיקרוסקופ משלב ניגודיות לעכבר התמונה מקרופאגים הצפק בתוך כימוטקטקטיקה המשלים C5a הדרגתי. ניתן להרחיב את הפרוטוקולים לתאים חיסוניים אחרים.

פקיעה זמן הדמיה של העכבר מקרופאג כימוטקסיס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקירת האינטראקציה של מקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים אנושיים עם ספרואיד גידול במטריצת קולגן I תלת מימדית (תלת מימדית), עם אפשרות להשוות את ההשפעה של תכונות מסיסות ופיזיקליות של המיקרו-סביבה על פלישת התאים.

בדיקת פלישה משותפת של מקרופאגים-גידול ספרואידים

מונוציטים ומקרופאגים הם תאים חיסוניים פלסטיים מאוד וניתנים לתכנות מחדש החיוניים לבריאות ולמחלות. הם חשים ומגיבים למגוון רחב של גירויים על ידי אימוץ תוכניות בידול ופנוטיפים ספציפיים. תקננו מודל מבחנה לחקר קיטוב ותכנות מחדש של מקרופאגים, ומספק כלי רב ערך למחקר.

מודל תכנות מחדש של מקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים לבדיקות חוץ גופיות

בהתחשב במודלים המוגבלים של קסנוגרפט הזמינים לחקר אינטראקציות בין CART אנושי לתאים מיאלואידים, הקמנו מודלים במבחנה וב-vivo כדי להבין את ההשפעות של מקרופאגים אנושיים על תאי CART. ניתן להכליל את הממצאים כדי להעריך את תפקידי המקרופאגים במיקרו-סביבת הגידול ולבדוק אימונותרפיות ממוקדות מקרופאגים.

חקר אינטראקציות בין תאים מיאלואידים ותאי CAR T במבחנה וב-In Vivo

חקור גיוס מקרופאגים באמצעות כימוקין בדגי זברה חיים. שיטת הדמיה בזמן אמת חושפת דפוסי נדידה תאית דינמיים ומסייעת להבנת תפקידי חלבונים במערכת החיסון.

כימוקין חוץ רחמי ביטוי מודל לבדיקת גיוס מקרופאג ב Vivo

גלה סרטונים נוספים