כימוקין חוץ רחמי ביטוי מודל לבדיקת גיוס מקרופאג ב Vivo
25 בספטמבר 2019
כדי לבדוק את ההשפעה של כימוקין על גיוס מקרופאג ב vivo, את כל הר היברידיזציה באתרו שימש כדי לזהות את הביטוי החוץ רחמי של כימוקין, וכתמים חיסוני שימש תוויות מקרופאגים. הדמיה חיה שימש התבוננות בזמן אמת של הגירה מקרופאג.
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לנו לחקור את הפונקציה של כימוקין ואת ההתנהגות של מקרופאג ' ב vivo. רוב המודלים הניסיוניים הקיימים של chemotaxis התא מבוססים על ניסויים בתאי במבחנה. אבל ניסויים במבחנה לפעמים הם פשוטים מדי כדי מודל הסביבה המורכבת ב vivo.
כמו כן, הם לא יכולים לייצג את יכולת הכימותרפיה ב vivo. שיטות אלה מנצלות את היתרון הספציפי של דגי זברה לתצפית ישירה על התנהגות התא, דבר שקשה לעכברים. התחל על ידי יצירת TGFABP-10A אינטרלוקין-34 מבנים מהופנטים.
להזריק את FABP-10A interleukin-34 מבנים לתוך תא אחד שלב Tg(mpeg1:GFP)מהופנט עוברי דגים מסוג בר יחד עם MRNA טרנספוסאז. להעלות ולאסוף את העוברים על פי הוראות כתב היד. לאחר מכן, לתקן אותם עם 4% paraformaldehyde לילה ב 4 מעלות צלזיוס או במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
לאחר הקיבעון, לשטוף את העוברים עם PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לייבש את העוברים בנפרד עם 50% מתנול ב PBST, ואחריו 100% מתנול, ואז לשנות טרי 100% מתנול, ולאחסן אותם שלילי 20 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות. כאשר מוכן להכלאה בדיקה, rehydrate העוברים בנפרד ב 50% מתנול ב PBST.
לאחר מכן, לשטוף אותם עם PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לעכל את העוברים עם proteinase K ב PBST בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השלך את פתרון העיכול, וחזור על קיבעון עם 4%paraformaldehyde במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הקיבעון, לשטוף את העוברים פעמיים עם PBST במשך 10 דקות לכל לשטוף. בצע prehybridization עם חיץ הכלאה מחומם ב 65 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת. לאחר מכן, מחממים את הבדיקה אינטרלוקין-34 ל 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
למחזר את חיץ ההכלאה לתוך הצינור המקורי ולבצע הכלאה עם בדיקה שחומם מראש ב 65 מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחר, לשטוף את העוברים עם 50% formamide ו 2X SSCT ואחריו 2X SSCT ולאחר מכן 0.2X SSCT ב 65 מעלות צלזיוס. חוזרים על כל שטיפה שלוש פעמים עם 20 דקות לכביסה.
לאחר מכן, לשטוף את העוברים שלוש פעמים עם PBST במשך חמש דקות לכל לשטוף. חסום את הדגימות עם 600 מיליליטר של חיץ חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 400 microliters של פתרון נוגדנים נגד digoxigenin HRP ולהדגיר את העוברים בארבע מעלות צלזיוס לילה.
למחרת, להסיר את הנוגדן ולשטוף את העוברים שש פעמים עם PBST במשך 20 דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לשטוף כל מדגם עם 30 microliters של 1X בתוספת דילואנט הגברה במשך חמש דקות. הדגירה את הדגימות בפתרון טיראמין פלואורופור במשך חמש עד 15 דקות בחושך.
הארכת זמן הדגירה ל-30 דקות אם האותות חלשים. לאחר מכן, לשטוף את העוברים עם PBST שלוש פעמים במשך 10 דקות לכל לשטוף. ותדיגר אותם עם הנוגדן העיקרי ב-4 מעלות צלזיוס בן לילה.
ביום שלמחר, לשטוף את העוברים חמש פעמים עם PBST במשך 30 דקות לכל לשטוף, ולהדקר אותם עם הנוגדנים המשניים בארבע מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחר, לשטוף את העוברים שלוש פעמים PBST במשך 10 דקות לכל לשטוף, ולאחסן אותם 70% גליצרול בחושך בארבע מעלות צלזיוס או שלילי 20 מעלות צלזיוס במשך זמן רב יותר. לפני ההדמיה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבחור את העוברים החיוביים האדומים וה-GFP של DS.
כדי להרים את הדגים, השתמש באמבט מתכת כדי לחמם מיליליטר אחד של 1% התכה נמוכה התעוררה מעל 90 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לקרר אותו לטמפרטורת הגוף ומערבבים 50 microliters של 0.2% tricaine. מעבירים את העוברים הרדמה לצלחת קטנה המותקנת עם מגלשת כיסוי בתחתית.
מוציאים את המים שמסביב ומפילים באיטיות את ההמסה הנמוכה שעל העוברים. בזהירות להגדיר את המיקום של הדג לפני agarose התגבש, שמירה על אזור הכבד קרוב למגלשת הכיסוי. לאחר שהתעוררות התגבשה, בזהירות לכסות אותו עם שכבה אחרת של התעוררות כדי לחזק אותו.
מניחים את המנה על שולחן נושאת המיקרוסקופ הקונפוקל, מכסים את הדגים בתתווית E2 בטרקאין ומתחילים בהדמיה. כדי להפעיל את מיקרוסקופ הקונפוקל, פתח את תוכנת Zen Black 2.3 ולחץ על אתר, לאחר מכן הדגירה, ולאחר מכן הגדר את הטמפרטורה ל -29 מעלות צלזיוס. לחץ על תפריט הרכישה ובחר את מצב הסריקה הנדרש ואת הלייזרים בתפריט ההתקנה החכמה.
לאחר מכן בחר מחסנית Z ומיקום. לחץ על תפריט מעצב ניסיוני ובחר לאפשר ניסוי בלוק רב בבלוק הראשון כדי למצוא את המדגם תחת הגדלה נמוכה. לאחר מכן, עבור להגדלה הגבוהה ותן לאזור שנצפה במרכז שדה הראייה.
הגדר את המיקום ואת מידע מחסנית Z. לאחר מכן, בחרו בעוצמת הלייזר המתאימה, בשכבות הסריקה ומהירות ההדמיה. לאחר הגדרת כל הבלוקים, הגדר את המספר המתאים של לולאות והתחל להקליט.
פרוטוקול זה שימש להזרקת interleukin-34 ספציפי לכבד מעל ביטוי פלסמיד לעוברים דגים מהופנטים, אשר מקרופאגים תויגו עם GFP. פלואורסצנטיות מלאה של הר בהכלאה ו immunostaining situ שימשו כדי לנתח את הביטוי של אינטרלוקין-34 ואת מקרופאגים שכותרתו GFP. מספרי תאי המקרופאג' נותחו כמותית באזור העוברים והזנב הלא מנוגנים והוזרקו.
הדמיה חיה שימשה להתבוננות ישירה מקרופאגים, שכותרתו ירוק, עובר על ידי הכבד של דג שליטה נודד לתוך הכבד של interleukin-34 מעל ביטוי דגים. השלבים החשובים של פרוטוקול זה כוללים את הבחירה של קו מהומר מתאים כדי לתייג את התא של עניין. ורקמות מתאימות להדמיה הביטוי שלך של גן מהומר, כמו גם חלון זמן תצפית מתאים.
טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד את הפונקציה של כימוקינים אחרים על ההתנהגות של תאים אחרים, כגון תאי T ונויטרופילים ב vivo.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את תפקידו של כימוקין בגיוס מקרופגים באמצעות מודלים in vivo. השיטות שנעשה בהן שימוש כוללות היברידיזציה במקום (in situ hybridization) של דגימות שלמות והדמיה חיה כדי לצפות בהתנהגות המקרופגים בזמן אמת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- מודלים קיימים של כימוטקסיס של תאים מסתמכים לרוב על ניסויי in vitro.
- מודלים of in vitro עשויים לפשט יתר על המידה את הסביבה המורכבת של ה-in vivo.
- תצפית ישירה על התנהגות תאים היא מאתגרת במודלים מסורתיים של יונקים.
- דגי זהב מעניקים יתרון ייחודי לחקר נדידת תאים in vivo.
מטרת המחקר
- לחקור את התפקוד של כימוקין ספציפי.
- לנתח את התנהגות המקרופאגים באורגניזם חי.
- לשפר את ההבנה של כימוטקסיס בסביבה מייצגת יותר.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- היברידיזציה במקום (in situ hybridization) של דגימה שלמה לזיהוי חלבון כימואקין.
- צביעה אימונוהיסטוכימית לסימון מקפאגים.
- דימוי חי לצפייה בזמן אמת בנדידת מקפאגים.
- שימוש בדג זברה כאורגניזם מודל.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של ביטוי כימוקין in vivo.
- דימיון בזמן אמת חשף דפוסי נדידה דינמיים של מקרופאגים.
- הממצאים מצביעים על כך שהכימוקין ממלא תפקיד משמעותי בגיוס מקרופאגים.
- הוכח את היתרונות של שימוש בדגי זהב למחקרים מסוג זה.
מסקנות
- המחקר מדגיש את חשיבותם של מודלים in vivo להבנת כימוטקסיס.
- התוצאות עשויות להנחות מחקרים עתידיים על תגובות חיסוניות.
- שימוש בדגי zebrafish יכול לשפר את חקר התנהגות התאים בסביבה מורכבת.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מידול in vivo ישיר של גיוס מקפגים המונע על ידי כימוקינים נותן מענה לפער קריטי באימונולוגיה תרגומית, בכך שהוא מאפשר ניתוח כמותי ובזמן אמת של נדידת תאים בתוך הקשר פיזיולוגי רלוונטי. סבב עבודה זה, המבוסס על דגי מי✚זבrafish, תומך בביטחון חיזוי בתיקוף מטרות ומפחית סיכונים בהחלטות גילוי מוקדמות על ידי אספקת תוצרים כמותיים ואסובים על התנהגות תאי חיסון. גישה זו משפרת את תהליך המיון של תיקי פיתוח (portfolio triage) על ידי הבהרת ההשפעה הפונקציונלית של מודולציית כימוקינים במערכת חיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה תפקודית של מטרות כימוקינים במערכת חולית חיה.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי חשיפת דינמיקת הגירה של תאים in vivo.
- מספק ראיות כמותיות למעורבות המטרה ולרלוונטיות המסלול.
- מעניק ביטחון ניבוי בקידום נכסים מווסתים של כימוקינים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס מודלים של מקרופאגים מתוקתקים ומתויקדים פלואורסצנטית עבור סריקות המשך.
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור של גיוס תאים ומיקום.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה להערכת תרכובות המכוונות למסלולי כימוטקסס.
- מאפשר תהליכי דימיג ניתנים להרחבה לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם נתוני נדידת תאים in vivo עם מנגנונים חיסוניים רלוונטיים למחלה.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של תפקוד כימוקינים.
- תומך בהתקדמות מותאמת סיכונים על ידי קישור ממצאים מנגנוניים לנקודות קצה תרגומיות.
- מסייע בזיהוי ביומארקרים לגיוס תאי מערכת החיסון במודלים של מחלות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מודל ביטוי זה של כימקינים אקטופיים משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקה מונחית-השערות של גיוס תאי מערכת החיסון in vivo, ובכך הוא תומך הן בשלבי תיקוף המטרה והן בשלבי זיהוי המולקולות המובילות (lead identification).
- ביולוגיה של גילוי: מכמת את נדידת המקרופאגים בתגובה לביטוי-יתר של כימוקינים, ובכך מבהיר את תפקוד המסלול.
- סריקה: מספקת פלטים סטנדרטיים וניתנים לשחזור של דימות וספירת תאים לצורך פיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של מספר התאים והמיקום שלהם בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תובנות מכניסטיות לתגובות חיסוניות הרלוונטיות למחלה במודלים של חולייתנים.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לכימוקינים ולסוגי תאי מערכת חיסון אחרים עבור יישומים רחבים יותר בפורטפוליו.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף יעדי כימוקינים ומפחית עמימות מנגיסטית.
- ערך תפעולי: מספק זרימות עבודה לדימות in vivo סטנדרטיות, ניתנות להרחבה וניתנות לשחזור.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי הבהרה מוקדמת של הסיכון הביולוגי.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מועמדים למודולציה חיסונית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטרנסגנזיס של דגי זברא ובטכניקות של דימוי חי (live imaging).
- מחייב גישה למיקרוסקופיה קונפוקלית ולתשתית של ניתוח תמונות כמותי.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי סימון, דימוי וכמותיות.
- ניתן להתאמה לסוגי תאי חיסון וכימוקינים אחרים באמצעות קווים טרנסגניים מתאימים.
- תלוי בתזמון מדויק ובבחירת רקמות עבור חלונות תצפית אופטימליים.
