מתודולוגיה Sputum אינדוקציה ועיבוד מעבדה
December 17th, 2017
כאן נתאר את הטכניקה של ברוק אינדוקציה. פרוטוקול זה גם מסביר את ברוק עיבוד כדי לבצע ספירה מבדלת תא וכדי לאסוף sputum supernatant תאים עבור ניתוח נוסף.
הטכניקה של ליחה מושרית פותחה בתחילת שנות ה -90. הטכניקה הוצעה כדי לחקור מידע חדש במחלות חסימתיות של דרכי הנשימה כמו אסתמה, COPD, ולאחרונה היה עניין גם להסתכל על מידע חדש בפיברוזיס ריאתי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יחסית לא פולשנית בניגוד לברונכוסקופיה.
העיבוד דורש עבודת מעבדה, וזה לוקח זמן, אז זה די תובעני, גוזל זמן, וצריך להיות לו מומחיות מסוימת במעבדה, כך שברור שזו טכניקה שקשה להשיג בכל מרכזים. הטכניקה של ליחה מושרה מורכבת משני חלקים, החלק הראשון הוא האינדוקציה, והחלק השני הוא העיבוד. לפני השראת ליחה, עלינו לבצע ספירומטריה, שהיא הערכה של הנפח וקצב הזרימה שהמטופל מסוגל לייצר.
ואנחנו צריכים לעשות את זה כי השראת הליחה כשלעצמה עלולה לגרום לברונכיוויזם, אז אנחנו בהחלט צריכים לדעת את הערך הבסיסי של הספירומטריה של המטופלים. אז אנחנו קודם כל מבצעים ספירומטריה, אחר כך אנחנו נותנים למטופלים מרחיבי סימפונות, אנחנו בדרך כלל נותנים 400 מיקרוגרם סלבוטמול, כדי לפתוח בצורה מקסימלית את דרכי הנשימה של המטופלים, וגם כדי למנוע עווית סימפונות שעלולה להתרחש בשלב האינדוקציה. ואחרי 15 דקות, אנחנו מודדים שוב את הספירומטריה, כדי לקבל את מה שאנחנו מכנים הערך הבסיסי של הספירומטריה, ובמיוחד אנחנו מסתכלים על ה-FEV1 שהוא הנפח שהמטופל מסוגל לנשוף תוך שנייה אחת.
שופכים מים מזוקקים לתא הנבולייזר עד לרמה המומלצת. הניחי נקייה בתא הנבולייזר. מכסים את המכסה המלא במכסה המתאים.
מלאו את הכוס בתמיסת מלח היפרטונית 50 מ"ל 5% אם FEV1 לאחר מרחיב הסימפונות גדול מ-65% חזוי, או 50 מ"ל תמיסת מלח איזוטונית 9% אם FEV1 לאחר מרחיב הסימפונות נמוך מ-65%. הוסף לכוס תמיסת סלבוטמול סולפט 1.75 בריכוז של חמישה מיליגרם למ"ל. חבר את הצינורות והשסתומים בהתאם להוראות היצרן.
הטכניקה צריכה להתבצע תחת פיקוח רפואי. הסבירו למטופל את עקרון הבדיקה. בקש מהמטופל להשתמש בקליפ לאף.
הפעל את הנבולייזר ובחר את הרמה הנמוכה ביותר של הגדרת התרסיס והמאוורר. בקש מהמטופל לשאוף את התרסיס דרך הפיה עם נשימת גאות ושפל. ניתן להגדיל את רמת התרסיס והגדרת המאוורר בהתאם לסובלנות המטופל.
במקרה של לחץ בחזה או אי נוחות נשימתית, הפסק את ההליך ובצע ספירומטריה למדידת ערך FEV1 של המטופל. לאחר חמש דקות של שאיפה, או במקרה של שיעול או בחילה, עצור את הנבולייזר. בקשו מהמטופל להסיר את אטב האף, לשטוף את הפה ולגרגר פעמיים במי ברז, ולהשליך את המים הללו לכיור.
לאחר מכן, כשהמטופל משתעל ליחה ויורק את מה שיוצא מהגרון במיכל פלסטיק. בצע את תמרון הנשימה הראשון למדידת FEV1. לאחר כל טנטטיבי של ייצור כיח, אנו מודדים את ערך ה-FEV1.
אם ערך ה-FEV1 יורד ביותר מ-20% אנו מפסיקים את ההליך ואנו נותנים למטופלים ערפול של איפרטרופיום ברומיד, שהוא חומר אנטי-כולינרגי שיפעל בשילוב עם בטא-שני אגוניסטים שכבר נתנו במהלך ההליך. אם ערך ה-FEV1 אינו יורד ביותר מ-20%, אנו ממשיכים בהליך למשך זמן כולל של 10 עד 20 דקות בהתאם לאיכות ונפח הליחה המיוצר על ידי המטופל. לאחר קבלת דגימת הליחה, שמור אותה במקרר עד לעיבוד.
אז החלק השני מורכב מעיבוד הליחה, ולשם כך עלינו להכין תחילה את שני הפתרונות בהם אנו הולכים להשתמש לעיבוד זה. אז אנחנו צריכים להכין את ה-Dithiothreitol הידוע גם בשם DTT. יש להכין את התמיסה על ידי דילול ה- DTT במים סטריליים על מנת לקבל תמיסה של 6.5 מילימולרים.
אז אתה צריך להימנע מחשיפת ה-DTT לאוויר הסביבה, ולשם כך אנו משתמשים במזרק ובמחט. שנית, עליכם להכין את התמיסה הכחולה של הטריפאן, ולשם כך עליכם לבצע דילול של DPBS עם טריפן כחול, כדי לקבל תמיסה של 0.08%אז לגבי הליחה, עליכם להעביר את כל הליחה בצינור פלסטיק תחתון חרוטי של 50 מ"ל, ולשקול את הדגימה. הוסף משקל פי שלושה של תמיסת DPBS.
מערבול לאט את הדגימה למשך 30 שניות, צנטריפוגה ב 800 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אוספים את הסופרנטנט בצינור פלסטיק תחתון חרוטי של 50 מ"ל, לאחר סינון דרך שתי שכבות בודדות של גזה סטרילית. הקצו את הסופרנטנט בצינורות פלסטיק של 2 מ"ל ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס.
שימו לב שדגימות הסופרנטנט שימושיות עבורנו כמרכיב תלת פאזי של ליחה. אם נפח משטח התאים נמוך מ-5 מ"ל, הוסף DPBS כדי להגיע לנפח של 5 מ"ל של מתלה תאים. מדללים את תרחיף התא בנפח אחד של DTT ב -6.5 מילימולר.
נדנד את מתלה התאים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בעזרת עובד ספסל. יש לדלל את תרחיף התאים לפחות שלוש פעמים באמצעות DPBS. צנטריפוגה את תרחיף התאים המדולל ב -550 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
השליכו את הסופרנטנט. השעו את לוח התאים בסביבות מ"ל DPBS אחד. הערך ורשום את הנפח המדויק של תרחיף התאים.
הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים ל -50 מיקרוליטר של תמיסת הטריפן הכחולה המדוללת והומוגני. שים את הדגימה מתחת לתלוש הכיסוי של ציטומטר המוציל, והנח אותה מתחת למיקרוסקופ אופטי. להעריך את ריכוז התאים של תרחיף התאים, את אחוז תאי הקשקש ואת אחוז הכדאיות של תאים שאינם קשקשיים.
לדלל הקצאה של המתלה עם DPBS כדי להשיג לפחות 350 מיקרוליטר של תרחיף תאים ב-500,000 תאים למ"ל. הרכיבו את רכז התאים בהתאם להוראות היצרן. הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף התא בכל אחד משלושת התאים של רכז התא.
סובב שתי דקות בחום של 150 גרם בטמפרטורת החדר בצנטריפוגה ציטו. השליכו את הסופרנטנט. הניחו למגלשה להתייבש באוויר.
מכתים את השקופית עם div מהיר או ערכת כתמי ערכיות ניקל בהתאם להוראות היצרן. הר עם מדיום הרכבה והחלקת כיסוי. הנח את השקופית מתחת למיקרוסקופ האופטי עם טבילות שמן.
ספרו לפחות 500 תאים שאינם קשקשיים, הנויטרופילים, האאוזינופילים, המקרופאגים, הלימפוציטים ותאי האפיתל, ורשמו את הערכים המוחלטים ואת האחוז וסוג התא. לגבי התוצאות, באמצעות ההמוציטומטר, עלינו לספור את התאים החיים שאינם קשקשיים שאינם צבעוניים. כמו כן, התאים המתים שאינם קשקשיים שצבועים בכחול.
ותאי הקשקש. תאים אלה הם תאי אפיתל המגיעים מהפה. הם גדולים, כך שקל לזהות אותם בהשוואה לתאים אנושיים קטנים.
אז אתה צריך להימנע גם מלספור חיידקים, שמרים או גרוטאות. אם תרחיף התאים מכיל יותר מ -80% מתאי הקשקש, דגימה זו נחשבת באיכות ירודה ואינה מתאימה לשקופית ציטוספינים. לכן דגימה זו נחשבת כלא מוצלחת.
הספירה על הציטוספין המוכתם מתבצעת על פי צבע התאים והמורפולוגיה שלהם. הנויטרופילים, המאפיינים העיקריים הם הגרעין הרב-אוני שהקל על זיהוי התאים. תאים אלה עגולים, קטנים וצבועים בוורוד ניטרלי.
האאוזינופילים, תאים אלה מורכבים מגרגירים אדומים, קלים לזיהוי. גודלם של תאים אלה קרוב לנויטרופילים. המקרופאגים, הם גדולים פי שניים עד חמישה מהנויטרופילים, וצבועים בכחול.
הציטופלזמה יכולה להכיל פסולת ואקואולים. הלימפוציטים, תאים אלה עגולים וקטנים, צבועים בכחול, ובעלי גרעין גדול וצפוף. לתאי האפיתל יש צורה עמודית, הם צבועים בוורוד, ולעתים קרובות מציגים ריסים בחלק העליון.
הנה כמה דוגמאות לדגימות ציטוספין בלתי קריאות עם יותר מ-80% מתאי הקשקש. אני חושב שזו טכניקה שימושית מאוד, אולם עלינו להיות זהירים מאוד מכיוון שהשראת הליחה חייבת להיעשות תחת פיקוח רפואי, אך הטכניקה של השראת כיח נותנת לך מידע רב על המצב הדלקתי של החולים בדרכי הנשימה. זה יכול לאפשר לך למדוד סמנים ביוכימיים שונים בסופרנטנט, ואתה יכול גם למדוד דברים שונים בחלקים התאיים, כך שליחה מושרה מאפשרת לך לבצע ציטומטריית זרימה, פרוטאומיקה, טרנסקריפטומיקה ואפילו גנומיקה.
סקירה
מאמר זה מתאר את הטכניקה של אינדוקציה של כיח, שיטה לא פולשנית המשמשת לאיסוף דגימות כיח לצורך ניתוח במחלות נשימה. הפרוטוקול כולל צעדים מפורטים לעיבוד כיח לביצוע ספירת תאים דיפרנציאלית ואיסוף סופרנטנט לצורך מחקר נוסף.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- רפואת נשימה
- טכניקות קליניות
- ניתוח תאים
רקע
- טכניקת כיח מושרה שפותחה בתחילת שנות ה-90.
- משמשת לחקירת מחלות דרכי הנשימה החסימתיות כמו אסטמה ו-COPD.
- עניין עדכני בפיברוזיס ריאתי.
- חלופה לא פולשנית לברונכוסקופיה.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול מפורט לאינדוקציה ועיבוד כיח.
- להקל על איסוף דגימות כיח לניתוח תאי.
- לשפר את ההבנה של מחלות נשימה באמצעות ניתוח כיח.
שיטות ששימשו
- ביצוע ספירומטריה להערכת תפקוד הריאות הבסיסי.
- מתן ברונכודילטורים למניעת ברוכוספזם במהלך האינדוקציה.
- אינדוקציה של כיח באמצעות סולם היפרטוני ונבוליזציה.
- עיבוד דגימות כיח לספירת תאים דיפרנציאלית ואיסוף סופרנטנט.
תוצאות עיקריות
- איסוף מוצלח של דגימות כיח לניתוח.
- מתודולוגיה מפורטת לעיבוד כיח מתוארת.
- הערכת תאים חיוניים והריכוז שהושג.
מסקנות
- הטכניקה של אינדוקציה של כיח יעילה לאיסוף דגימות לא פולשני.
- עיבוד נכון של הכיח הוא קריטי לניתוח מדויק.
- פרוטוקול זה יכול לסייע במחקר ובאבחון קליני של מחלות נשימה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Sputum induction and processing provide a non-invasive method for collecting airway cells and supernatant, enabling mechanistic studies of inflammatory pathways in respiratory diseases. This approach supports target validation by delivering quantitative cellular and biochemical data from the lung microenvironment, which is critical for de-risking hypotheses in asthma, COPD, and fibrosis research. The technique enhances predictive confidence in preclinical models by bridging clinical sample analysis with functional target interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying immune cell populations (neutrophils, eosinophils, macrophages, lymphocytes, epithelial cells) in airway lumen.
- Operational Value: Provides reproducible differential cell counts and viability assessments using standardized hemocytometer and trypan blue exclusion methods.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking through analysis of sputum supernatant for mediators and cellular components for flow cytometry, genomics, or proteomics.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Prepares validated biological systems (cell suspension and supernatant) for downstream assays with defined processing steps including DTT mucolysis and centrifugation.
- Scientific Value: Delivers quantitative outputs such as cell concentration (target: 500,000 cells/mL) and viability percentage, enabling assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Facilitates screening readiness through supernatant storage at -80°C for biomarker analysis and cell concentrator use for slide preparation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery to preclinical continuity by analyzing inflammatory cell profiles in disease-relevant systems (asthma, COPD, pulmonary fibrosis).
- Operational Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions via quality control thresholds (e.g., <80% squamous cells) to ensure sample suitability for cytospin and downstream analysis.
- Scientific Value: Highlights translational biomarker alignment by enabling measurement of biochemical markers in supernatant and cellular phenotypes linked to disease mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, supporting airway inflammation analysis and biomarker-enabled target prioritization in respiratory disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying cell types and mediators in induced sputum, reflecting airway inflammatory status.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized processing: DTT dilution (6.5 mM), trypan blue staining (0.08%), centrifugation (800 g and 550 g), and cell concentration adjustment to 500,000 cells/mL.
- Analytics: Enables comparative analysis via differential cell counting (neutrophils, eosinophils, etc.), viability assessment, and supernatant collection for biochemical marker measurement.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant cell profiling in asthma, COPD, and fibrosis, supporting biomarker alignment and mechanism validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for longitudinal inflammatory monitoring and target validation across respiratory indications via standardized sputum induction and processing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through quantitative inflammatory profiling and reduction of mechanistic ambiguity in airway disease models.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via defined reagent concentrations (DTT 6.5 mM, trypan blue 0.08%), centrifugation parameters, and cell concentration targets.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by providing early human-relevant inflammatory data from non-invasive sampling.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on reproducible cell differentials and supernatant biomarker levels indicating target engagement or pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in respiratory physiology, cell handling, and microscopic analysis for accurate spirometry, induction monitoring, and cell counting.
- Needs nebulization equipment, centrifuge (800 g and 550 g), hemocytometer, cytocentrifuge, and -80°C storage for supernatant preservation.
- Demands cross-team standardization of processing steps: DTT preparation avoiding air exposure, trypan blue dilution, saline selection based on post-bronchodilator FEV1, and timed mucolysis (20 min rocking).
- Involves adaptation considerations: saline tonicity (5% hypertonic or 9% isotonic) adjusted to patient FEV1, and processing modifications if cell pellet volume <5 mL (DPBS supplementation).
- Includes practical limitations: technical demand, time consumption, need for medical supervision, and sample exclusion if squamous cells >80% indicating oral contamination.
