מתודולוגיה Sputum אינדוקציה ועיבוד מעבדה

הטכניקה של ליחה מושרית פותחה בתחילת שנות ה -90. הטכניקה הוצעה כדי לחקור מידע חדש במחלות חסימתיות של דרכי הנשימה כמו אסתמה, COPD, ולאחרונה היה עניין גם להסתכל על מידע חדש בפיברוזיס ריאתי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יחסית לא פולשנית בניגוד לברונכוסקופיה.

העיבוד דורש עבודת מעבדה, וזה לוקח זמן, אז זה די תובעני, גוזל זמן, וצריך להיות לו מומחיות מסוימת במעבדה, כך שברור שזו טכניקה שקשה להשיג בכל מרכזים. הטכניקה של ליחה מושרה מורכבת משני חלקים, החלק הראשון הוא האינדוקציה, והחלק השני הוא העיבוד. לפני השראת ליחה, עלינו לבצע ספירומטריה, שהיא הערכה של הנפח וקצב הזרימה שהמטופל מסוגל לייצר.

ואנחנו צריכים לעשות את זה כי השראת הליחה כשלעצמה עלולה לגרום לברונכיוויזם, אז אנחנו בהחלט צריכים לדעת את הערך הבסיסי של הספירומטריה של המטופלים. אז אנחנו קודם כל מבצעים ספירומטריה, אחר כך אנחנו נותנים למטופלים מרחיבי סימפונות, אנחנו בדרך כלל נותנים 400 מיקרוגרם סלבוטמול, כדי לפתוח בצורה מקסימלית את דרכי הנשימה של המטופלים, וגם כדי למנוע עווית סימפונות שעלולה להתרחש בשלב האינדוקציה. ואחרי 15 דקות, אנחנו מודדים שוב את הספירומטריה, כדי לקבל את מה שאנחנו מכנים הערך הבסיסי של הספירומטריה, ובמיוחד אנחנו מסתכלים על ה-FEV1 שהוא הנפח שהמטופל מסוגל לנשוף תוך שנייה אחת.

שופכים מים מזוקקים לתא הנבולייזר עד לרמה המומלצת. הניחי נקייה בתא הנבולייזר. מכסים את המכסה המלא במכסה המתאים.

מלאו את הכוס בתמיסת מלח היפרטונית 50 מ"ל 5% אם FEV1 לאחר מרחיב הסימפונות גדול מ-65% חזוי, או 50 מ"ל תמיסת מלח איזוטונית 9% אם FEV1 לאחר מרחיב הסימפונות נמוך מ-65%. הוסף לכוס תמיסת סלבוטמול סולפט 1.75 בריכוז של חמישה מיליגרם למ"ל. חבר את הצינורות והשסתומים בהתאם להוראות היצרן.

הטכניקה צריכה להתבצע תחת פיקוח רפואי. הסבירו למטופל את עקרון הבדיקה. בקש מהמטופל להשתמש בקליפ לאף.

הפעל את הנבולייזר ובחר את הרמה הנמוכה ביותר של הגדרת התרסיס והמאוורר. בקש מהמטופל לשאוף את התרסיס דרך הפיה עם נשימת גאות ושפל. ניתן להגדיל את רמת התרסיס והגדרת המאוורר בהתאם לסובלנות המטופל.

במקרה של לחץ בחזה או אי נוחות נשימתית, הפסק את ההליך ובצע ספירומטריה למדידת ערך FEV1 של המטופל. לאחר חמש דקות של שאיפה, או במקרה של שיעול או בחילה, עצור את הנבולייזר. בקשו מהמטופל להסיר את אטב האף, לשטוף את הפה ולגרגר פעמיים במי ברז, ולהשליך את המים הללו לכיור.

לאחר מכן, כשהמטופל משתעל ליחה ויורק את מה שיוצא מהגרון במיכל פלסטיק. בצע את תמרון הנשימה הראשון למדידת FEV1. לאחר כל טנטטיבי של ייצור כיח, אנו מודדים את ערך ה-FEV1.

אם ערך ה-FEV1 יורד ביותר מ-20% אנו מפסיקים את ההליך ואנו נותנים למטופלים ערפול של איפרטרופיום ברומיד, שהוא חומר אנטי-כולינרגי שיפעל בשילוב עם בטא-שני אגוניסטים שכבר נתנו במהלך ההליך. אם ערך ה-FEV1 אינו יורד ביותר מ-20%, אנו ממשיכים בהליך למשך זמן כולל של 10 עד 20 דקות בהתאם לאיכות ונפח הליחה המיוצר על ידי המטופל. לאחר קבלת דגימת הליחה, שמור אותה במקרר עד לעיבוד.

אז החלק השני מורכב מעיבוד הליחה, ולשם כך עלינו להכין תחילה את שני הפתרונות בהם אנו הולכים להשתמש לעיבוד זה. אז אנחנו צריכים להכין את ה-Dithiothreitol הידוע גם בשם DTT. יש להכין את התמיסה על ידי דילול ה- DTT במים סטריליים על מנת לקבל תמיסה של 6.5 מילימולרים.

אז אתה צריך להימנע מחשיפת ה-DTT לאוויר הסביבה, ולשם כך אנו משתמשים במזרק ובמחט. שנית, עליכם להכין את התמיסה הכחולה של הטריפאן, ולשם כך עליכם לבצע דילול של DPBS עם טריפן כחול, כדי לקבל תמיסה של 0.08%אז לגבי הליחה, עליכם להעביר את כל הליחה בצינור פלסטיק תחתון חרוטי של 50 מ"ל, ולשקול את הדגימה. הוסף משקל פי שלושה של תמיסת DPBS.

מערבול לאט את הדגימה למשך 30 שניות, צנטריפוגה ב 800 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אוספים את הסופרנטנט בצינור פלסטיק תחתון חרוטי של 50 מ"ל, לאחר סינון דרך שתי שכבות בודדות של גזה סטרילית. הקצו את הסופרנטנט בצינורות פלסטיק של 2 מ"ל ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס.

שימו לב שדגימות הסופרנטנט שימושיות עבורנו כמרכיב תלת פאזי של ליחה. אם נפח משטח התאים נמוך מ-5 מ"ל, הוסף DPBS כדי להגיע לנפח של 5 מ"ל של מתלה תאים. מדללים את תרחיף התא בנפח אחד של DTT ב -6.5 מילימולר.

נדנד את מתלה התאים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בעזרת עובד ספסל. יש לדלל את תרחיף התאים לפחות שלוש פעמים באמצעות DPBS. צנטריפוגה את תרחיף התאים המדולל ב -550 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

השליכו את הסופרנטנט. השעו את לוח התאים בסביבות מ"ל DPBS אחד. הערך ורשום את הנפח המדויק של תרחיף התאים.

הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים ל -50 מיקרוליטר של תמיסת הטריפן הכחולה המדוללת והומוגני. שים את הדגימה מתחת לתלוש הכיסוי של ציטומטר המוציל, והנח אותה מתחת למיקרוסקופ אופטי. להעריך את ריכוז התאים של תרחיף התאים, את אחוז תאי הקשקש ואת אחוז הכדאיות של תאים שאינם קשקשיים.

לדלל הקצאה של המתלה עם DPBS כדי להשיג לפחות 350 מיקרוליטר של תרחיף תאים ב-500,000 תאים למ"ל. הרכיבו את רכז התאים בהתאם להוראות היצרן. הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף התא בכל אחד משלושת התאים של רכז התא.

סובב שתי דקות בחום של 150 גרם בטמפרטורת החדר בצנטריפוגה ציטו. השליכו את הסופרנטנט. הניחו למגלשה להתייבש באוויר.

מכתים את השקופית עם div מהיר או ערכת כתמי ערכיות ניקל בהתאם להוראות היצרן. הר עם מדיום הרכבה והחלקת כיסוי. הנח את השקופית מתחת למיקרוסקופ האופטי עם טבילות שמן.

ספרו לפחות 500 תאים שאינם קשקשיים, הנויטרופילים, האאוזינופילים, המקרופאגים, הלימפוציטים ותאי האפיתל, ורשמו את הערכים המוחלטים ואת האחוז וסוג התא. לגבי התוצאות, באמצעות ההמוציטומטר, עלינו לספור את התאים החיים שאינם קשקשיים שאינם צבעוניים. כמו כן, התאים המתים שאינם קשקשיים שצבועים בכחול.

ותאי הקשקש. תאים אלה הם תאי אפיתל המגיעים מהפה. הם גדולים, כך שקל לזהות אותם בהשוואה לתאים אנושיים קטנים.

אז אתה צריך להימנע גם מלספור חיידקים, שמרים או גרוטאות. אם תרחיף התאים מכיל יותר מ -80% מתאי הקשקש, דגימה זו נחשבת באיכות ירודה ואינה מתאימה לשקופית ציטוספינים. לכן דגימה זו נחשבת כלא מוצלחת.

הספירה על הציטוספין המוכתם מתבצעת על פי צבע התאים והמורפולוגיה שלהם. הנויטרופילים, המאפיינים העיקריים הם הגרעין הרב-אוני שהקל על זיהוי התאים. תאים אלה עגולים, קטנים וצבועים בוורוד ניטרלי.

האאוזינופילים, תאים אלה מורכבים מגרגירים אדומים, קלים לזיהוי. גודלם של תאים אלה קרוב לנויטרופילים. המקרופאגים, הם גדולים פי שניים עד חמישה מהנויטרופילים, וצבועים בכחול.

הציטופלזמה יכולה להכיל פסולת ואקואולים. הלימפוציטים, תאים אלה עגולים וקטנים, צבועים בכחול, ובעלי גרעין גדול וצפוף. לתאי האפיתל יש צורה עמודית, הם צבועים בוורוד, ולעתים קרובות מציגים ריסים בחלק העליון.

הנה כמה דוגמאות לדגימות ציטוספין בלתי קריאות עם יותר מ-80% מתאי הקשקש. אני חושב שזו טכניקה שימושית מאוד, אולם עלינו להיות זהירים מאוד מכיוון שהשראת הליחה חייבת להיעשות תחת פיקוח רפואי, אך הטכניקה של השראת כיח נותנת לך מידע רב על המצב הדלקתי של החולים בדרכי הנשימה. זה יכול לאפשר לך למדוד סמנים ביוכימיים שונים בסופרנטנט, ואתה יכול גם למדוד דברים שונים בחלקים התאיים, כך שליחה מושרה מאפשרת לך לבצע ציטומטריית זרימה, פרוטאומיקה, טרנסקריפטומיקה ואפילו גנומיקה.