מתודולוגיה Sputum אינדוקציה ועיבוד מעבדה
17 בדצמבר 2017
כאן נתאר את הטכניקה של ברוק אינדוקציה. פרוטוקול זה גם מסביר את ברוק עיבוד כדי לבצע ספירה מבדלת תא וכדי לאסוף sputum supernatant תאים עבור ניתוח נוסף.
הטכניקה של ליחה מושרית פותחה בתחילת שנות ה -90. הטכניקה הוצעה כדי לחקור מידע חדש במחלות חסימתיות של דרכי הנשימה כמו אסתמה, COPD, ולאחרונה היה עניין גם להסתכל על מידע חדש בפיברוזיס ריאתי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יחסית לא פולשנית בניגוד לברונכוסקופיה.
העיבוד דורש עבודת מעבדה, וזה לוקח זמן, אז זה די תובעני, גוזל זמן, וצריך להיות לו מומחיות מסוימת במעבדה, כך שברור שזו טכניקה שקשה להשיג בכל מרכזים. הטכניקה של ליחה מושרה מורכבת משני חלקים, החלק הראשון הוא האינדוקציה, והחלק השני הוא העיבוד. לפני השראת ליחה, עלינו לבצע ספירומטריה, שהיא הערכה של הנפח וקצב הזרימה שהמטופל מסוגל לייצר.
ואנחנו צריכים לעשות את זה כי השראת הליחה כשלעצמה עלולה לגרום לברונכיוויזם, אז אנחנו בהחלט צריכים לדעת את הערך הבסיסי של הספירומטריה של המטופלים. אז אנחנו קודם כל מבצעים ספירומטריה, אחר כך אנחנו נותנים למטופלים מרחיבי סימפונות, אנחנו בדרך כלל נותנים 400 מיקרוגרם סלבוטמול, כדי לפתוח בצורה מקסימלית את דרכי הנשימה של המטופלים, וגם כדי למנוע עווית סימפונות שעלולה להתרחש בשלב האינדוקציה. ואחרי 15 דקות, אנחנו מודדים שוב את הספירומטריה, כדי לקבל את מה שאנחנו מכנים הערך הבסיסי של הספירומטריה, ובמיוחד אנחנו מסתכלים על ה-FEV1 שהוא הנפח שהמטופל מסוגל לנשוף תוך שנייה אחת.
שופכים מים מזוקקים לתא הנבולייזר עד לרמה המומלצת. הניחי נקייה בתא הנבולייזר. מכסים את המכסה המלא במכסה המתאים.
מלאו את הכוס בתמיסת מלח היפרטונית 50 מ"ל 5% אם FEV1 לאחר מרחיב הסימפונות גדול מ-65% חזוי, או 50 מ"ל תמיסת מלח איזוטונית 9% אם FEV1 לאחר מרחיב הסימפונות נמוך מ-65%. הוסף לכוס תמיסת סלבוטמול סולפט 1.75 בריכוז של חמישה מיליגרם למ"ל. חבר את הצינורות והשסתומים בהתאם להוראות היצרן.
הטכניקה צריכה להתבצע תחת פיקוח רפואי. הסבירו למטופל את עקרון הבדיקה. בקש מהמטופל להשתמש בקליפ לאף.
הפעל את הנבולייזר ובחר את הרמה הנמוכה ביותר של הגדרת התרסיס והמאוורר. בקש מהמטופל לשאוף את התרסיס דרך הפיה עם נשימת גאות ושפל. ניתן להגדיל את רמת התרסיס והגדרת המאוורר בהתאם לסובלנות המטופל.
במקרה של לחץ בחזה או אי נוחות נשימתית, הפסק את ההליך ובצע ספירומטריה למדידת ערך FEV1 של המטופל. לאחר חמש דקות של שאיפה, או במקרה של שיעול או בחילה, עצור את הנבולייזר. בקשו מהמטופל להסיר את אטב האף, לשטוף את הפה ולגרגר פעמיים במי ברז, ולהשליך את המים הללו לכיור.
לאחר מכן, כשהמטופל משתעל ליחה ויורק את מה שיוצא מהגרון במיכל פלסטיק. בצע את תמרון הנשימה הראשון למדידת FEV1. לאחר כל טנטטיבי של ייצור כיח, אנו מודדים את ערך ה-FEV1.
אם ערך ה-FEV1 יורד ביותר מ-20% אנו מפסיקים את ההליך ואנו נותנים למטופלים ערפול של איפרטרופיום ברומיד, שהוא חומר אנטי-כולינרגי שיפעל בשילוב עם בטא-שני אגוניסטים שכבר נתנו במהלך ההליך. אם ערך ה-FEV1 אינו יורד ביותר מ-20%, אנו ממשיכים בהליך למשך זמן כולל של 10 עד 20 דקות בהתאם לאיכות ונפח הליחה המיוצר על ידי המטופל. לאחר קבלת דגימת הליחה, שמור אותה במקרר עד לעיבוד.
אז החלק השני מורכב מעיבוד הליחה, ולשם כך עלינו להכין תחילה את שני הפתרונות בהם אנו הולכים להשתמש לעיבוד זה. אז אנחנו צריכים להכין את ה-Dithiothreitol הידוע גם בשם DTT. יש להכין את התמיסה על ידי דילול ה- DTT במים סטריליים על מנת לקבל תמיסה של 6.5 מילימולרים.
אז אתה צריך להימנע מחשיפת ה-DTT לאוויר הסביבה, ולשם כך אנו משתמשים במזרק ובמחט. שנית, עליכם להכין את התמיסה הכחולה של הטריפאן, ולשם כך עליכם לבצע דילול של DPBS עם טריפן כחול, כדי לקבל תמיסה של 0.08%אז לגבי הליחה, עליכם להעביר את כל הליחה בצינור פלסטיק תחתון חרוטי של 50 מ"ל, ולשקול את הדגימה. הוסף משקל פי שלושה של תמיסת DPBS.
מערבול לאט את הדגימה למשך 30 שניות, צנטריפוגה ב 800 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אוספים את הסופרנטנט בצינור פלסטיק תחתון חרוטי של 50 מ"ל, לאחר סינון דרך שתי שכבות בודדות של גזה סטרילית. הקצו את הסופרנטנט בצינורות פלסטיק של 2 מ"ל ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס.
שימו לב שדגימות הסופרנטנט שימושיות עבורנו כמרכיב תלת פאזי של ליחה. אם נפח משטח התאים נמוך מ-5 מ"ל, הוסף DPBS כדי להגיע לנפח של 5 מ"ל של מתלה תאים. מדללים את תרחיף התא בנפח אחד של DTT ב -6.5 מילימולר.
נדנד את מתלה התאים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בעזרת עובד ספסל. יש לדלל את תרחיף התאים לפחות שלוש פעמים באמצעות DPBS. צנטריפוגה את תרחיף התאים המדולל ב -550 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
השליכו את הסופרנטנט. השעו את לוח התאים בסביבות מ"ל DPBS אחד. הערך ורשום את הנפח המדויק של תרחיף התאים.
הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים ל -50 מיקרוליטר של תמיסת הטריפן הכחולה המדוללת והומוגני. שים את הדגימה מתחת לתלוש הכיסוי של ציטומטר המוציל, והנח אותה מתחת למיקרוסקופ אופטי. להעריך את ריכוז התאים של תרחיף התאים, את אחוז תאי הקשקש ואת אחוז הכדאיות של תאים שאינם קשקשיים.
לדלל הקצאה של המתלה עם DPBS כדי להשיג לפחות 350 מיקרוליטר של תרחיף תאים ב-500,000 תאים למ"ל. הרכיבו את רכז התאים בהתאם להוראות היצרן. הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף התא בכל אחד משלושת התאים של רכז התא.
סובב שתי דקות בחום של 150 גרם בטמפרטורת החדר בצנטריפוגה ציטו. השליכו את הסופרנטנט. הניחו למגלשה להתייבש באוויר.
מכתים את השקופית עם div מהיר או ערכת כתמי ערכיות ניקל בהתאם להוראות היצרן. הר עם מדיום הרכבה והחלקת כיסוי. הנח את השקופית מתחת למיקרוסקופ האופטי עם טבילות שמן.
ספרו לפחות 500 תאים שאינם קשקשיים, הנויטרופילים, האאוזינופילים, המקרופאגים, הלימפוציטים ותאי האפיתל, ורשמו את הערכים המוחלטים ואת האחוז וסוג התא. לגבי התוצאות, באמצעות ההמוציטומטר, עלינו לספור את התאים החיים שאינם קשקשיים שאינם צבעוניים. כמו כן, התאים המתים שאינם קשקשיים שצבועים בכחול.
ותאי הקשקש. תאים אלה הם תאי אפיתל המגיעים מהפה. הם גדולים, כך שקל לזהות אותם בהשוואה לתאים אנושיים קטנים.
אז אתה צריך להימנע גם מלספור חיידקים, שמרים או גרוטאות. אם תרחיף התאים מכיל יותר מ -80% מתאי הקשקש, דגימה זו נחשבת באיכות ירודה ואינה מתאימה לשקופית ציטוספינים. לכן דגימה זו נחשבת כלא מוצלחת.
הספירה על הציטוספין המוכתם מתבצעת על פי צבע התאים והמורפולוגיה שלהם. הנויטרופילים, המאפיינים העיקריים הם הגרעין הרב-אוני שהקל על זיהוי התאים. תאים אלה עגולים, קטנים וצבועים בוורוד ניטרלי.
האאוזינופילים, תאים אלה מורכבים מגרגירים אדומים, קלים לזיהוי. גודלם של תאים אלה קרוב לנויטרופילים. המקרופאגים, הם גדולים פי שניים עד חמישה מהנויטרופילים, וצבועים בכחול.
הציטופלזמה יכולה להכיל פסולת ואקואולים. הלימפוציטים, תאים אלה עגולים וקטנים, צבועים בכחול, ובעלי גרעין גדול וצפוף. לתאי האפיתל יש צורה עמודית, הם צבועים בוורוד, ולעתים קרובות מציגים ריסים בחלק העליון.
הנה כמה דוגמאות לדגימות ציטוספין בלתי קריאות עם יותר מ-80% מתאי הקשקש. אני חושב שזו טכניקה שימושית מאוד, אולם עלינו להיות זהירים מאוד מכיוון שהשראת הליחה חייבת להיעשות תחת פיקוח רפואי, אך הטכניקה של השראת כיח נותנת לך מידע רב על המצב הדלקתי של החולים בדרכי הנשימה. זה יכול לאפשר לך למדוד סמנים ביוכימיים שונים בסופרנטנט, ואתה יכול גם למדוד דברים שונים בחלקים התאיים, כך שליחה מושרה מאפשרת לך לבצע ציטומטריית זרימה, פרוטאומיקה, טרנסקריפטומיקה ואפילו גנומיקה.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את הטכניקה של השראה של ליחה (sputum induction), שיטה לא פולשנית המשמשת לאיסוף דגימות ליחה לצורך ניתוח במחלות נשריות. הפרוטוקול כולל שלבים מפורטים לעיבוד הליחה לצורך ביצוע ספירת תאים דיפרנציאלית ואיסוף הנוזל העליון (supernatant) למחקרים נוספים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- רפואת נשימה
- טכניקות קליניות
- ניתוח תאים
רקע
- טכניקת ליחה מושרה שפותחה בתחילת שנות ה-90.
- משמשת לחקרת מחלות דרכי נשימה חסימתיות כגון asthma ו-COPD.
- עניין שנרשם לאחרונה בפיברוזיס ריאתי.
- חלופה לא פולשנית לברונכוסקופיה.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקול מפורט להשראת ליחה ולעיבודה.
- הקל על איסוף דגימות ליחה לצורך אנליזה תאית.
- שיפור ההבנה של מחלות דרכי הנשימה באמצעות אנליזה של ליחה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בצעו ספירומטריה להערכת תפקוד ריאות בקו הבסיס.
- מתנו מרחיבי סימפונות למניעת ברונכוספאזם במהלך ההשראה.
- השרו הפרשת ליחה באמצעות תמיסת מלח היפרטונית ונבוליזציה.
- עבדו את דגימות הליחה לצורך ספירה דיפרנציאלית של תאים ואיסוף של הנוזל העליון (supernatant).
תוצאות עיקריות
- איסוף מוצלח של דגימות ליחה לצורך ניתוח.
- פירוט של מתודולוגיה לעיבוד ליחה.
- השגת הערכה של חיוניות וריכוז התאים.
מסקנות
- טכניקת השראת הליחה יעילה לאיסוף דגימות לא פולשני.
- עיבוד נכון של הליחה חיוני לצורך ניתוח מדויק.
- פרוטוקול זה יכול לסייע במחקר ובאבחון קליני של מחלות נשימה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
השראה ועיבוד של ליחה מספקים שיטה לא פולשנית לאיסוף תאי דרכי הנשמה ונוזל על, המאפשרת מחקרים מכניסטיים של מסלולים דלקתיים במחלות נשימתיות. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות (target validation) על ידי אספקת נתונים תאיים וביוכימיים כמותיים מסביבת המיקרו של הריאה, דבר שהוא קריטי להפחתת סיכונים בהשערות מחקר באסמה, COPD ופיברוזיס. הטכניקה מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי גישור בין ניתוח דגימות קליניות לבין חקירה תפקודית של מטרות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות של אוכלוסיות תאי מערכת החיסון (נויטרופילים, אאוזינופילים, מקרופאגים, לימפוציטים, תאים אפיתליאליים) בחלל דרכי הנשימה.
- ערך תפעולי: מספק ספירות תאים דיפרנציאליות והערכות חיוניות בעלות שחזוריות, תוך שימוש בשיטות סטנדרטיות של המוציטומטר ובדיקת הדרת צבע trypan blue.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית באמצעות ניתוח של העלון של הליחה לזיהוי מתווכים ומרכיבים תאיים עבור ציטומטריית זרימה, גנומיקה או פרוטאומיקה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך תפעולי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות (סספנסיית תאים ונוזל על) לבדיקות המשך עם שלבי עיבוד מוגדרים, הכוללים מוקוליזה באמצעות DTT וצנטריפוגציה.
- ערך מדעי: מספק תוצרים כמותיים כגון ריכוז תאים (יעד: 500,000 cells/mL) ואחוז חיות, ובכך מאפשר סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מקל על המוכנות לסריקה באמצעות אחסון נוזל העל ב-80°C- לצורך ניתוח סמנים ביולוגיים ושימוש במרכז תאים להכנת סמפיסלים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין גילוי לרציפות פרה-קלינית על ידי ניתוח פרופילים של תאים דלקתיים במערכות הרלוונטיות למחלה (אסמה, COPD, פיברוזיס ריאתי).
- ערך תפעולי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאמות סיכון באמצעות ספי המבטח של בקרת איכות (למשל, פחות מ-80% תאים סקוואמוזיים) כדי להבטיח את התאמת הדגימה ל-cytospin ולניתוחים המשכיים.
- ערך מדעי: מדגיש התאמה של ביומרקרים תרגומיים על ידי מתן אפשרות למדידת סממנים ביוכימיים בנוזל העל (supernatant) ופנוטיפים תאיים הקשורים למנגנוני המחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות ועד לזיהוי מובילים (leads), תוך תמיכה בניתוח דלקת דרכי הנשימה ותעדוף מטרות מבוסס-ביומארקרים בתוכניות מחקר למחלות נשימה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים על ידי כימות סוגי תאים ומתווכים בליחה מושרה, המשקפים את מצב הדלקת בדרכי הנשימה.
- סריקה: מבטיח את מוכנות הבדיקה באמצעות עיבוד סטנדרטי: דילול DTT (6.5 mM), צביעה ב-trypan blue (0.08%), צנטריפוגציה (800 g ו-550 g), והתאמת ריכוז התאים ל-500,000 cells/mL.
- אנליטיקה: מאפשר ניתוח השוואתי באמצעות ספירה דיפרנציאלית של תאים (נויטרופילים, אאוזינופילים וכו'), הערכת חיוניות ואיסוף של על-משקע למדידת סמנים ביוכימיים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני באמצעות פרופילי תאים רלוונטיים למחלות באסתמה, COPD ופיברוזיס, ובכך תומך בהלימה של סמנים ביולוגיים ובתיקוף של מנגנונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת ניתנת לשימוש חוזר לניטור דלקתי לאורך זמן ולתיקוף מטרות במגוון התשבחות נשימתיות, באמצעות השראה ועיבוד סטנדרטיים של ליחה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות פרופיל דלקתי כמותי והפחתת עמימות מכניסטית במודלים של מחלות דרכי הנשימה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה באמצעות ריכוזי ריאגנטים מוגדרים (DTT 6.5 mM, trypan blue 0.08%), פרמטרי סנטריפוגציה ויעדי ריכוז תאים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשכיות הפרויקט (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים, על ידי אספקת נתונים דלקתיים מוקדמים הרלוונטיים לבני אדם המופקים מדגימה לא פולשנית.
- השפעה על פורטפוליו: תעדוף וקבלת החלטאות קידום מותאמות לסיכון, המבוססות על ספירות תאים דיפרנציאליות הדירות ורמות סמני ביולוגיים בנוזל העל (supernatant) המעידות על מעורבות של מטרה או על מודולציה של מסלול.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בפיזיולוגיה של מערכת הנשימה, טיפול בתאים ואנליזה מיקרוסקופית לצורך ביצוע מדויק של ספירומטריה, ניטור ההשראה וספירת תאים.
- נדרש ציוד לנבולציה, צנטריפוגה (800 g ו-550 g), המוציטומטר (hemocytometer), ציטוצנטריפוגה ואחסון ב-80°C- לשמירת הנוזל העליון (supernatant).
- נדרש סטנדרטיזציה חוצת-צוותים של שלבי העיבוד: הכנת DTT תוך מניעת חשיפה לאוויר, דילול trypan blue, בחירת תמיסת מלח המבוססת על FEV1 לאחר מרחיב סימפונות, ומואנליזה מתוזמנת (20 דקות של rocking).
- כולל שיקולי התאמה: טוניות של תמיסת המלח (5% היפרטונית או 9% איזוטונית) המותאמת ל-FEV1 של המטופל, ושינויים בתהליך העיבוד אם נפח משקע התאים הוא <5 mL (הוספת DPBS).
- כולל מגבלות מעשיות: דרישות טכניות, השקעת זמן, צורך בפיקוח רפואי, והדרת דגימות אם אחוז התאים הסקוואמוזיים הוא >80%, מה שמעיד על זיהום פהי.
