Name: מתודולוגיה Sputum אינדוקציה ועיבוד מעבדה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: למד את שיטת אינדוקציית הליחה לאיסוף דגימות לא פולשניות לניתוח מחלות נשימה כמו אסתמה ו-COPD. הפרוטוקול כולל ספירומטריה, נבוליזציה ועיבוד מעבדה לניתוח תאים דיפרנציאלי ואיסוף סופרנטנט.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת בית החולים של והשליט (Liege צ'ו). אנו להכיר "הרגעים הפקות" עבור הפקת הסרטון. אנו גם להכיר סדריק פרנסואה, המטופל שהופיע בסרט.

כל השיטות המתוארות בסעיף זה אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים והשליט של אוניברסיטת ונתן בכל המקצועות בריא בכתב הסכמה מדעת להשתתפות.
1. ברוק אינדוקציה
<ol>
	<li>ספירומטריה מראש, שלאחר למצוקת
	<ol>
		<li>לבצע ספירומטריה (הכריחו נפח expiratory בשנייה 1 [FEV1] ולתמרן חיוניים בכפייה קיבולת [FVC]) על פי החברה הגבילו אמריקאי (ATS) / הקריטריונים הסטנדרטיים החברה בדרכי הנשימה האירופי (ERS)12.</li>
		<li>לנהל µg 400 של סאלבוטאמול בשאיפה מ משאף במינון מוניות (MDI) דרך התקן מרווח. הערה: אצל מבוגרים, תיעודו של סאלבוטאמול בשאיפה כוללות רעד וקצב13.</li>
		<li>חזור ספירומטריה (FEV1 ולתמרן FVC) 15 דקות מאוחר יותר, על פי הקריטריונים הסטנדרטיים ATS/ERS12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הכנת מפוחים אולטראסוניות הערה: מפוחים צריך ביסודיות לנקות ולשמור נקיים לפני כל שימוש, בהתאם להוראות היצרן.<ol>
		<li>למלא את התא מפוחים עם מים מזוקקים עד לרמה המומלצת.</li>
		<li>מניחים כוס נקי בבית הבליעה מפוחים.</li>
		<li>מכסים את הספל עם המכסה המתאים.</li>
		<li>למלא את הכוס גם 50 מ של לקילו (5%) לחולה עם למצוקת שלאחר FEV1 &#62; 65% חזה או 50 מ ל תמיסת מול (0.9%) לחולה עם למצוקת שלאחר FEV1≤65% חזה.</li>
		<li>להוסיף 1.75 מ של פתרון סולפט סאלבוטאמול (5 מ"ג/מ"ל) בגביע.</li>
		<li>לחבר את צינורות ושסתומים בהתאם להוראות היצרן.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>אוסף nebulization וברוק הערה: בצע את הטכניקה תחת השגחה רפואית.<ol>
		<li>להסביר את ההליך למטופל.</li>
		<li>בקש מהמטופל להשתמש סרטון האף.</li>
		<li>הפעלת מפוחים ובחר ברמה הנמוכה ביותר של הגדרות תרסיס ומאוורר.</li>
		<li>בקש מהמטופל לשאוף בתרסיס דרך היצירה הפה עם הנשימה גאות במשך 5 דקות. הערה: תרסיס והגדרות מאוורר ניתן להגדיל בהתאם הסובלנות של המטופל.<ol>
			<li>במקרה של שיעול בלתי נסבל או בחילה, להפסיק את ההליך, עבור לשלב 1.3.5.</li>
			<li>במקרה של לחץ בחזה או אי נוחות בדרכי הנשימה, עבור לשלב 1.3.8.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>. כבה את מפוחים.</li>
		<li>בקש מהמטופל כדי להסיר את הסרטון האף, לשטוף את הפה עם מים, לגרגר פעמיים לפני השלכת אותו בכיור. הערה: רוק התאים עשויים לזהם את הדגימה ברוק, להוביל דוגמה לא שמיש.</li>
		<li>בקש מהמטופל להשתעל sputum לתוך מיכל פלסטיק.</li>
		<li>לבצע ספירומטריה (תמרון expiratory בכפייה) כדי למדוד FEV1.</li>
		<li>להעריך את האשמה1 FEV כדלקמן: (נמדד FEV1 צעד 3.8 [mL]) - (למצוקת שלאחר FEV1 נמדד בשלב 1.3 [mL]) / (למצוקת שלאחר FEV1 נמדד בשלב 1.3 [mL]) * 100.<ol>
			<li>אם ה FEV1 נופל על-ידי 20% או יותר מהערך למצוקת שלאחר, להפסיק את ההליך. למדוד FEV1 שוב 10 דקות מאוחר יותר. אם ה FEV1 נופל 20% או יותר, שאל את הרופא לנהל nebulized ipratropium ברומיד (0.25 מ"ג/2 מ"ל) ולשמור את החולה תחת השגחה רפואית. עבור לשלב 1.3.10.</li>
			<li>אם ה FEV1 לא נופל על-ידי 20% או יותר מהערך למצוקת שלאחר, חזור על שלבים 3.2 ל 3.9 אחת עד שלוש פעמים כדי להגיע בזמן nebulization סך של 10 עד 20 דקות. הערה: הזמן הכולל nebulization תלויות באיכות (נוכחות של פקקים או חלקים צמיגה) והן את כמות הדגימה ברוק. אם לדוגמה איכות ו/או כמות של עניים אחרי 10 דקות של nebulization, ההליך צריך ניתן להרחיב כדי להגיע בזמן nebulization סך של 15 עד 20 דקות.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>שמור את הדגימה sputum בקירור עד עיבוד.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. ברוק עיבוד
הערה: תהליך ברוק בתוך 3 שעות של דגימה עבור תא אופטימום הכדאיות.
התראה: ללבוש חלוק מעבדה, כפפות מגן ומשקפי מגן.
<ol>
	<li>הכנות ראשוניות
	<ol>
		<li>לגרום לדילול 10-fold הפתרון dithiothreitol מרוכז (סוכן mucolytic) עם מים מזוקקים סטריליים כדי לקבל 10 מ של פתרון 6.5 מ מ, בהתאם להוראות היצרן. הערה: על מנת למנוע פתרון dithiothreitol מרוכז ערבוב עם אויר, למשוך את הפתרון המבחנה עם מזרק סטרילי ואת המחט. ברגע שנפתח, המבחנה תמיסה מרוכזת חייב להיות לשמור בטמפרטורת החדר ולא להשתמש בו בתוך 5 ימים. הפתרון מדולל מוכן מדי יום. התראה: בגלל הסכנה לגירוי העין ועור, ללבוש ציוד מגן (ביגוד, כפפות, משקפי מגן).</li>
		<li>לגרום לדילול 5-fold הפתרון trypan blue (0.4%) עם Dulbecco Phosphate-Buffered מלוחים (DPBS) כדי לקבל פתרון 0.08%. לשמור על הפתרון מדולל בטמפרטורת החדר ולהשתמש בתוך 2 שבועות. שים לב: בשל סיכונים מסרטנים, ללבוש ציוד מגן (ביגוד, כפפות, משקפי מגן).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>אוסף של ברוק תגובת שיקוע
	<ol>
		<li>העברת ברוק כולו בתוך צינור פלסטיק 50 מל-התחתון חרוט ולשקול את הדגימה.</li>
		<li>להוסיף משקל 3-fold של DPBS פתרון.</li>
		<li>אט-אט מערבולת המדגם ב-30 s.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 800 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
		<li>לסנן את הדגימה דרך 2 שכבות יחידה של גזה סטרילית ולאסוף את תגובת שיקוע של צינור פלסטיק 50 מל-חרוט התחתון.</li>
		<li>Aliquot תגובת שיקוע בפלסטיק 2 mL צינורות ואחסן אותם ב- 80 ° c הערה: דוגמאות Supernatant שימושיים assay sputum שלב נוזל רכיבים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mucolysis ברוק
	<ol>
		<li>אם יש צורך, להוסיף DPBS בגדר תא להגיע הנפח הכולל של התא השעיה של 5 מ.</li>
		<li>לדלל התליה תא עם נפח 1 של 6.5 מ מ dithiothreitol. השתמש רוקר ספסל יפציץ התליה תא עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.<ol>
			<li>חזור על פחות 3 פעמים עם DPBS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Centrifuge התליה תא מדולל ב 550 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li></ol></li></ol>למחוק את תגובת שיקוע.
		<li>Resuspend בגדר תא בבסביבות 1 מ"ל של DPBS.</li>
	
	
	<li>הערכה של מאפייני המדגם ברוק (ריכוז תאי קשקש זיהום, הכדאיות בשיטה הדרה Trypan Blue) על-ידי ספירת hemocytometer איכותי
	<ol>
		<li>להעריך ולהקליט את עוצמת הקול המדויק של התליה תא.</li>
		<li>להוסיף 50 µL של השעיה תא µL 50 של הפתרון trypan blue 0.08%, homogenize.</li>
		<li>שים המדגם תחת coverslip של hemocytometer (Thoma קאמרית) ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ אופטי (400 X).</li>
		<li>לספור תאים קשקשיים תאים קשקשיים-שאינו חי (תאי צבע), תאים מתים שאינם קשקשיים (תאים בצבע כחול). הערה: במקרה של צפיפות התאים נמוך מדי או גבוה מדי, להתרכז או לדלל התליה תא וחזור על שלבים 2.4.1-2.4.3.</li>
		<li>להעריך את התא ריכוז ההשעיה, האחוז של תאים קשקשיים ו האחוז של הכדאיות של תאי קשקש. הערה: לחשב את סך הלא-קשקש הספירה/g של ברוק: התא ריכוז של המתלה (שלב 5.4) * נפח של התליה תא (שלב 4.8) * אחוז תאי קשקש / משקל של המדגם ברוק (שלב 2.2.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הכנת cytospin ויטראז'ים שקופיות עם תא ההשעיה, אחסון של תאים שיורית, במידת הצורך הערה: אם התליה תא מכיל יותר מ 80% קשקשיים תאים, המדגם נחשב עני איכות מתאים cytospin שקופית14. במקרה זה, הפסק העיבוד ולשקול את הדוגמית הזו לא מוצלח.<ol>
		<li>לדלל עם aliquot של התליה תא עם DPBS כדי לקבל לפחות 350 µL של השעיה תאים-תאים למ"ל 500,000.</li>
		<li>להרכיב את רכז תא בהתאם להוראות היצרן.</li>
		<li>למלא כל אחד תאי 3 במסוע תא µL 100 של השעיה התא הזה.</li>
		<li>ב cytocentrifuge, ספין למשך 2 דקות ב 150 x g ובטמפרטורת החדר. למחוק את supernatants.</li>
		<li>לפרק את רכז תא בהתאם להוראות היצרן.</li>
		<li>לאפשר השקופית כדי אוויר יבש. הערה: בשלב זה, תאים שיורית ניתן לאחסן מאגר הולם במידת הצורך לניסויים נוספים.</li>
		<li>כתם השקופית עם צביעת מסחרי קיט (ראה את הטבלה של חומרים), בהתאם להוראות היצרן.</li>
		<li>טעינת השקופית עם מדיום הרכבה מתאים ועם מכסה.</li>
		<li>מקם את השקופית תחת המיקרוסקופ האופטי (600 X) עם שמן טבילה.</li>
		<li>לספור תאים שאינם קשקשיים לפחות 500: נויטרופילים, אאוזינופילים, מקרופאגים, לימפוציטים ותאי אפיתל. הערה: ספירת התאים דיפרנציאלית מתבצע בדרך כלל על ידי היחידה או שניים ייעודי מאומן משקיפים להגבלת סתירות interobserver.</li>
		<li>הערכים המוחלטים הרשומה והאחוזים של כל סוג התא.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+sputum+cell+counts%3A+their+usefulness+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice.</a> European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).</li>
<li>Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+induced+sputum+to+investigate+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">The use of induced sputum to investigate airway inflammation.</a> Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).</li>
<li>Leigh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sputum+induction+for+diagnosis+of+Pneumocystis+carinii+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Sputum induction for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia.</a> The Lancet. 334 (8656), 205-206 (1989).</li>
<li>Pin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+induced+sputum+cell+counts+to+investigate+airway+inflammation+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma.</a> Thorax. 47 (1), 25-29 (1992).</li>
<li>Pizzichini, M. M. M., Leigh, R., Djukanović, R., Sterk, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+sputum+induction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Safety of sputum induction.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 9s-18s (2002).</li>
<li>Delvaux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nebulised+salbutamol+administered+during+sputum+induction+improves+bronchoprotection+in+patients+with+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Nebulised salbutamol administered during sputum induction improves bronchoprotection in patients with asthma.</a> Thorax. 59 (2), 111-115 (2004).</li>
<li>Efthimiadis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+sputum+processing+for+cell+counts%2C+immunocytochemistry+and+in+situ+hybridisation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 19s-23s (2002).</li>
<li>Kelly, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12361360">Analysis of fluid-phase mediators.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 24s-39s (2002).</li>
<li>Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+sputum%3A+assessing+inflammation+and+immune+response+elements+in+the+bronchial+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Inhalation+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways.</a> Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).</li>
<li>Vignola, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Future directions.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 51s-55s (2002).</li>
<li>Brightling, C. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16685028">Clinical applications of induced sputum.</a> Chest. 129 (5), 1344-1348 (2006).</li>
<li>Miller, M. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16055882">Standardisation of spirometry.</a> European Respiratory Journal. 26 (2), 319-338 (2005).</li>
<li>Global Initiative for Asthma (GINA) Global Strategy for Asthma Management and Prevention. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ginasthma.org/">http://www.ginasthma.org/</a> (2017).</li>
<li>Szefler, S. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3390196/">Asthma outcomes: biomarkers.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3 Suppl), S9-S23 (2012).</li>
<li>Douwes, J., Gibson, P., Pekkanen, J., Pearce, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-eosinophilic+asthma%3A+importance+and+possible+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms.</a> Thorax. 57 (7), 643-648 (2002).</li>
<li>Schleich, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+concomitant+local+and+systemic+eosinophilia+in+uncontrolled+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Importance of concomitant local and systemic eosinophilia in uncontrolled asthma.</a> The European Respiratory Journal. 44 (1), 97-108 (2014).</li>
<li>Demarche, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+sputum+and+systemic+inflammation+in+asthma+phenotypes%3A+are+paucigranulocytic+asthmatics+really+non-inflammatory%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+pulmonary+medicine%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of sputum and systemic inflammation in asthma phenotypes: are paucigranulocytic asthmatics really non-inflammatory?</a> BMC pulmonary medicine. 16, 46(2016).</li>
<li>Pavord, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+assessment+of+airway+inflammation+using+induced+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal.+Supplement%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum.</a> The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 40s(2002).</li>
<li>Guiot, J., Henket, M., Corhay, J. L., Moermans, C., Louis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sputum+biomarkers+in+IPF%3A+Evidence+for+raised+gene+expression+and+protein+level+of+IGFBP-2%2C+IL-8+and+MMP-7%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Sputum biomarkers in IPF: Evidence for raised gene expression and protein level of IGFBP-2, IL-8 and MMP-7.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0171344(2017).</li>
<li>Green, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asthma+exacerbations+and+sputum+eosinophil+counts%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial.</a> Lancet. 360 (9347), 1715-1721 (2002).</li>
<li>Siva, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophilic+airway+inflammation+and+exacerbations+of+COPD%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Eosinophilic airway inflammation and exacerbations of COPD: a randomised controlled trial.</a> European Respiratory Journal. 29 (5), 906-913 (2007).</li>
<li>Louis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+infiltration%2C+ICAM-1+expression%2C+and+eosinophil+chemotactic+activity+in+asthmatic+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell infiltration, ICAM-1 expression, and eosinophil chemotactic activity in asthmatic sputum.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 466-472 (1997).</li>
<li>Maes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asthma+inflammatory+phenotypes+show+differential+microRNA+expression+in+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Asthma inflammatory phenotypes show differential microRNA expression in sputum.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1433-1446 (2016).</li>
<li>Moermans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+systemic+cellular+inflammation+and+cytokine+release+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Cytokine. 56 (2), 298-304 (2011).</li>
<li>Gibson, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://erj.ersjournals.com/content/20/37_suppl/44s">Sputum induction in children.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 44s-46s (2002).</li>
<li>Reddel, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Official+American+Thoracic+Society%2FEuropean+Respiratory+Society+Statement%3A+Asthma+Control+and+Exacerbations%3A+Standardizing+Endpoints+for+Clinical+Asthma+Trials+and+Clinical+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Official American Thoracic Society/European Respiratory Society Statement: Asthma Control and Exacerbations: Standardizing Endpoints for Clinical Asthma Trials and Clinical Practice.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 180 (1), 59-99 (2009).</li>
<li>Duncan, C. J. A., Lawrie, A., Blaylock, M. G., Douglas, J. G., Walsh, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+eosinophil+apoptosis+in+induced+sputum+correlates+with+asthma+severity%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Reduced eosinophil apoptosis in induced sputum correlates with asthma severity.</a> The European Respiratory Journal. 22 (3), 484-490 (2003).</li>
<li>Demarche, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asthma+Control+and+Sputum+Eosinophils%3A+A+Longitudinal+Study+in+Daily+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%3A+In+Practice%22%5BJournal%5D)">Asthma Control and Sputum Eosinophils: A Longitudinal Study in Daily Practice.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 5 (5), 1335-1343 (2017).</li>
<li>Belda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+sputum+cell+counts+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induced sputum cell counts in healthy adults.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2 Pt 1), 475-478 (2000).</li>
<li>Brooks, C. R., Gibson, P. G., Douwes, J., Dalen, C. J. V., Simpson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+airway+neutrophilia+and+ageing+in+asthmatics+and+non-asthmatics%3A+Airway+neutrophilia+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Relationship between airway neutrophilia and ageing in asthmatics and non-asthmatics: Airway neutrophilia and ageing.</a> Respirology. 18 (5), 857-865 (2013).</li>
<li>Thomas, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+age+on+induced+sputum+differential+cell+counts+in+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects.</a> Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).</li>
<li>Chalmers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoking+and+airway+inflammation+in+patients+with+mild+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Smoking and airway inflammation in patients with mild asthma.</a> Chest. 120 (6), 1917-1922 (2001).</li>
<li>Hansel, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Evaluation+of+Nasal+and+Bronchial+Cytokines+and+Chemokines+Following+Experimental+Rhinovirus+Infection+in+Allergic+Asthma%3A+Increased+Interferons+%28IFN-%CE%B3+and+IFN-%CE%BB%29+and+Type+2+Inflammation+%28IL-5+and+IL-13%29%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-γ and IFN-λ) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13).</a> EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).</li>
<li>Popov, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+technical+factors+influencing+the+induction+of+sputum+for+cell+analysis%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis).</a> European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).</li>
<li>Holz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+sputum+composition+between+two+inductions+performed+on+consecutive+days%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days.</a> Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).</li>
<li>Louis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+processing+on+inflammatory+markers+in+induced+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum.</a> European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).</li>
<li>Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+Biochemical+Analysis+of+Induced+Sputum+from+Asthmatic+and+from+Healthy+Subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects.</a> American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).</li>
<li>Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+inflammatory+indices+in+induced+sputum%3A+effects+of+selection+of+sputum+to+minimize+salivary+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination.</a> The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה sputum המושרה היא כלי שימושי ללמוד תא דרכי הנשימה. ישנם מספר יישומים אפשריים של טכניקה זו. קודם כל, זה עשוי לשפר את הידע על תאים חיסוניים ומנגנונים מעורב מחלות נשימה שונות. לדוגמה, טכניקה זו אפשרה את החקירה של דלקת דרכי הנשימה ב קוהורטות גדולות של חולים, ולא הוכח כי כמחצית מהמטופלים אסתמה מאופיינים של הנשימה נורמלית דלקת אאוזינופילית15, 16 , 17, ואילו מטופלי COPD מוצג בדרך כלל של נויטרופילים sputum מוגבה סופר18. טכניקה זו תרמה גם אפיון טוב יותר של דלקת דרכי הנשימה בחולים עם idiopathic פיברוזיס ריאתי, מגשרים ראיות שעשויים לתרום זו מחלה19. שנית, בטכניקה של ברוק המזורזת עשויה להיות שימושית לחזות את התגובה לטיפול. לדוגמה, נוכחות אחוז חריג של אאוזינופילים sputum הוכח להיות סמן ניבוי של הסטרואידים תגובתיות11,18. אסטמה, COPD, התאמת המינון של קורטיקוסטרואידים לנרמל את האחוז של אאוזינופילים sputum הוצגה להיות יותר יעיל בהפחתת מספר exacerbations מאשר התאמת הטיפול על פי הנחיות קליניות הנוכחי11 20, ,21. שלישית, ניתוח sputum עשוי לעזור לפתח טיפולים ממוקדים. לדוגמה, הנוכחות של מספר חריג של ברוק נויטרופילים ב כמה חולי אסתמה ו- COPD הוביל לפיתוח טיפולים antineutrophilic11. רביעית, הטכניקה עשויים לשחק תפקיד באבחון. לדוגמה, הנוכחות של אאוזינופיליה sputum יש צורך לערוך אבחנה של אי-אסטמה ברונכיט אאוזינופילית11.
מלבד קבלת ספירה מבדלת תא, בטכניקה של גרימת sputum מאפשר גם את הביצועים של ניתוחים נוספים רבים, על ידי לימוד sputum supernatant או תאים ברוק. דוגמאות עם sputum supernatant כוללים הניתוח של מגשרים8,19,22 , את ההערכה של הפעילות chemotactic של המדגם אאוזינופילים22. מתאי ברוק, RNA יכול חילוצם ואופן המשמש microRNA או ביטוי גנים מנתח19,23 . ניתן גם לנתח את התאים sputum מאת לזרום cytometry9,23 המאפשר, בין היתר, תאים immunophenotyping ומיון. יתר על כן, ברוק תאים יכול להיות בתרבית10, ייצורם מתווך יכול להיות נמדד במבחנה24. ראוי לציין כי במקרה זה, תוכן המתווך הוא שונה מכל מה ניתן למצוא ברוק supernatant. אכן, מגשרים בברוק supernatant עשוי להיות מושפע על ידי הפרשות דרכי הנשימה תאים תושב ועל ידי exudation פלזמה, בניגוד דגם24תרבות תא ברוק. לבסוף, immunocytochemistry וב -באתרו הכלאה גם ניתן לבצע באמצעות תאים sputum7.
הטכניקה sputum המושרה יש מספר מגבלות. אינדוקציה חייב להתבצע תחת פיקוח רפואי. זה חיוני גם באופרטור לתת הוראות יסודיות לחולים. מגבלות אחרות כוללות את שיתוף הפעולה ואת מצבו הרפואי של חולים, מאמצים במערכת הנשימה. בנוגע להיתכנות של טכניקה זו אצל ילדים, מספר מחקרים דיווחו שזה היה מוצלח ובטוח לילדים מעל גיל 6 בת25. נתונים על ילדי &#60; 6 שנים של גיל חסרים25, אך סביר כי sputum אינדוקציה היא קשה לבצע את הילדים האלה14. הטכניקה היא מוגבל ומרכזים שירותים מיוחדים כי זה טכנית תובעניים, זמן רב, וזה דורש צוות מיומן1. מגבלה נוספת היא כי הטכניקה של אינדוקציה sputum וניתוח אינה תמיד מוצלח, כלומר כי cytospin קריא לא תמיד מתקבל26. אולם, שיעור ההצלחה הוא בדרך כלל בסביבות 80% בגדודים שונים של מטופלים4,26,27,28,29. בסופו של דבר, זהירות יש לנקוט בעת השוואת גדודים שונים של חולים בדבר ההתאמה בין גיל כמו זה הוצג לפגיעה30,31ספירת תאים sputum. באופן דומה, פרמטרים אחרים כגון הרגלי מין וטבק צריך להיות מתאימים כפי הם גם עלולים להפריע29,32ספירת תאים ברוק. בעת התאמת המטופל אינו אפשרי, דרך נוספת לקחת לגיל, מין או מצב עישון בחשבון היא להתאים את ניתוח סטטיסטי עבור מאפיינים אלו.
השיטה sputum המושרה לעומת טכניקות אחרות, המאפשרים איסוף תאי איירווייז, ביופסיות, bronchoalveolar lavages, יש את היתרונות של להיות פשוטה נסבל היטב, בטוח, לשחזור, חסכונית, לא פולשנית. יתרונות אלה מאפשרים את הטכניקה sputum המושרה להתבצע ב בקנה מידה גדול, שוב ושוב לאורך זמן, ולהפוך אותו חלופה של בחירה עבור הדגימה את דרכי הנשימה. Bronchosorption היא טכניקה נוספת ומאפשר את האוסף של הנוזל שורות mucosal כדי להעריך את דרכי הנשימה מגשרים33. אמנם שיטה זו (דרישת ברונכוסקופיה) פולשניים יותר מאשר sputum המושרה, יש את היתרונות של הימנעות כל זיהום עם הרוק וקבלת ריכוז גבוה של מגשרים מאשר ב שטיפת bronchoalveolar33.
פעולות קריטיות צריך תשומת לב בפרוטוקול. ראשית, שים לב חייב להילקח בדבר ריכוז מלח ואת הזמן של אינדוקציה, כי אלה שני פרמטרים יכול להשפיע על התוצאות ולכן צריך להיות מתוקנן34,35. שנית, mucolysis עם DTT היא צעד חשוב של העיבוד. לעומת PBS, הוצגה DTT כדאי לפזר sputum תאים7, אשר משפר את איכות השקופית cytopsin חיוני יש ספירת תאים לשחזור2. עם זאת, הסוכן mucolytic עלולים להפריע המדידה של רכיבים הביוכימי.עולה ניסויים ואז לבצע בעת מדידת תרכובת ביוכימית36חדש. לבסוף, צעד קריטי נוסף של ההליך היא התא ספירת צעד, אשר חייב להתבצע על ידי טכנאי מוסמך כדי להבטיח תוצאות interpretable ואמין.
שיטה חלופית באמצעות sputum תקעים (חלקים viscid או צפופה), במקום ברוק שלמה, המתואר גם ספרות7. בשתי הטכניקות יש יתרונות וחסרונות. הטכניקה sputum כל מאפשר מהירה יותר עיבוד7, אך לעתים קרובות מזוהם עם הרוק, אשר מדללת את הדגימה, יכול להפחית את האיכות של2,cytospins7. עם הטכניקה הבחירה הכנס, הזיהום רוק מופחת, מה שאומר כי דגימות לעיתים קרובות באיכות טובה יותר את המינון של מתווכים פאזה נוזלית ועבור שקופיות cytospin7. העיבוד עם זאת עוד7 , תקעים שנבחר לא יכול להיות נציג של כל מדגם37. . זה גם ראוי לציין כי לא כל דוגמאות מכילים תקעים, אשר יכולים להיות הגבלת... שתי השיטות הן המאומת לשחזור, ויש כיום אין ראיות כי הסעיפים תא דיפרנציאלית המתקבל שתי השיטות האלה הם שונים14,38.
בעתיד, sputum המושרה יכול לשמש ככלי קליני כדי לספק סמנים ביולוגיים החקירה, אבחון וניהול של כל מיני מחלות דלקתיות במערכת הנשימה.

מספר שיטות משמשים כדי לחקור דלקת דרכי הנשימה: ישיר מדידות (כמו ביופסיות הסמפונות או bronchoalveolar lavages), שיטות עקיפות (כמו הערכה סימפטום, דם מדגם ניתוח ויצירת ריאה תפקודי)1. הטכניקות ישירה יש את היתרון של אמין הערכת הדלקת של דרכי הנשימה, אבל הם פולשנית, לא ריאלי בקנה מידה גדול בגלל נוחות המטופל, הסיכון שיגרמו1. לגבי שיטות עקיפות, הם לקוי לתאם עם בחינה ישירה של דלקת דרכי הנשימה1.
אוסף sputum דרך נוספת לתאים מדגם של דרכי הנשימה ומאפשר את ההערכה ישירה של דלקת דרכי הנשימה. למרות זאת, בהפקת sputum באופן ספונטני עלול להוביל דגימות של איכות ירודה, אינה אפשרית עבור חולים כל2. יש כבר להתגבר על בעיה זו על-ידי שימוש ultrasonically nebulized היפרטונית כדי לעודד את ייצור sputum2. שיטה זו שימשה בתחילה בחולים נגוע וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) לאבחון של דלקת ריאות Pneumocystis carinii 3 , הותאמה עבור חולי אסטמה 19924והנושאים בריא. ברוק אינדוקציה היא גם אפשרית בחולים חמורות יותר באמצעות מלוחים מול5. אמנם בדרך כלל נסבל היטב, שאיפת תמיסת מלח עלולה לגרום לעווית הסימפון בחולים עם hyperresponsive איירווייז5. לכן, מומלץ לנהל אגוניסט בטא קצרת לפני ההליך1. יתר על כן, אנו בעבר הראו כי הוספת סאלבוטאמול תמיסת מלח ב מפוחים אולטראסאונד נוסף ירד זה סיכון6. היתרונות של ברוק אינדוקציה היא כי זה לא פולשנית2 בטוח בעת הצורך באמצעי זהירות נלקחים5.
עיבוד sputum דגימות, שתי שיטות משמשים כיום בספרות: הטכניקה כל ברוק, את הבחירה של הכנס7. במעבדה שלנו, הטכניקה sputum כולו מתבצע. המטרה העיקרית של עיבוד ברוק היא כדי לקבל ספירת תאים דיפרנציאלית ללמוד את הסוג של דלקת נוכח לומן דרכי הנשימה. עם זאת, רבים ניתוחים נוספים הינם אפשריים להמשיך לחקור תהליכים דלקתיים ומנגנונים המערכת החיסונית, על ידי לימוד מגשרים sputum supernatant8 או על-ידי ביצוע חקירה מפורטת על תאים ברוק (למשל , flow cytometry9, תרביות תאים10, גנומיקה10, פרוטאומיקס10, immunocytochemistry7, בחיי עיר הכלאה7, וכד')
הטכניקה של אינדוקציה sputum וניתוח מוגבלת כעת ומרכזים שירותים מיוחדים הקלינית כי היא תובענית מבחינה טכנית, זמן רב, והיא דורשת צוות מיומן1. דלקת דרכי הנשימה עשוי להיחקר בשיטה זו עבור מחלות שונות בדרכי הנשימה כמו אסתמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), שיעול כרוני או idiopathic פיברוזיס ריאתי11.

<table><tbody><tr><td>ספירומטר - Spirobank</td><td>MIR צרפת</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salbutamol MDI - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0135-913</td><td>ראה תרופה זמינה בארץ</td></tr><tr><td>Nebulizer UltraNeb</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>UltraNeb U3000</td><td></td></tr><tr><td>Devilbiss UltraNeb כוסות חד פעמיות & מכסים</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>100HD-647</td><td></td></tr><tr><td>מסנן חיידקים DeVilbiss עבור נבולייזרים UltraNeb</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>1001005879</td><td></td></tr><tr><td>שסתומים חד כיווניים</td><td>הדסון RCI ארה"ב</td><td>41664</td><td></td></tr><tr><td>שסתומים חד כיווניים</td><td>הדסון RCI ארה"ב</td><td>41665</td><td></td></tr><tr><td>מחבר T אירוסול&nbsp;</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41077</td><td></td></tr><tr><td>מעגל אוורור חד-ענפי גלי</td><td>Int'Air Medical France</td><td>TA30A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5 %&nbsp;</td><td>/</td><td>/</td><td>הופק ע"י בית המרקחת של בית החולים</td></tr><tr><td>Mini-Plasco NaCl 0.9%</td><td>B.Braun Medical&nbsp; Diegem בלגיה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סלבוטמול סולפט 5 מ"ג/מ"ל - ונטולין</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0094-987</td><td>ראה תרופה זמינה בארץ</td></tr><tr><td>Ipratropium bromide 0.25 מ"ג/2 מ"ל - Atrovent</td><td>Boehringer Ingelheim גרמניה</td><td>CNK: 1543-305</td><td>ראה תרופה זמינה בארץ</td></tr> מגיב מלח <tr>פוספט <td>LONZA בלגיה</td><td>BE17512F</td><td></td>Sputolysin<td>של Dulbecco</td></tr><tr><td></td><td>Calbiochem</td><td>56000</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול 0.4% תמיסה 100 מ"ל</td><td>LONZA Bio Whittaker בלגיה</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>המוציטומטר - תא תומא</td><td>Labor Optik Lancing UK</td><td>1500000</td><td></td></tr><tr><td>Hemacolor Stainig סט Merck</td><td>בלגיה</td><td>1116610001</td><td>מוצר חלופי&nbsp; : סט צביעה Diff Quik &nbsp; מדיון אבחון&nbsp;</td></tr><tr><td>אמצעי הרכבה - Entellan</td><td>Merck בלגיה</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Statspin Cytofuge 12&nbsp;</td><td>בקמן קולטר בלגיה</td><td>X00-003066-001</td><td></td></tr></tbody></table>

מתודולוגיה sputum אינדוקציה ועיבוד מעבדה

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

הטכניקה של אינדוקציה sputum ועיבוד היא שיטה לא פולשנית מוכר המאפשר איסוף וניתוח של תאים של דרכי הנשימה, וזה מעניין למחלות שונות בדרכי הנשימה כמו אסתמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), שיעול כרוני או idiopathic פיברוזיס ריאתי. טכניקה זו היטב נסבל, בטוחה, לא פולשנית, אך מוגבלת כעת שירותי מחקר ומרכזי מתמחה באימון קליניים כי היא תובענית מבחינה טכנית, זמן רב, והיא דורשת צוות מיומן. שיעור ההצלחה של אינדוקציה sputum וניתוח הוא כ- 80%.
כאן, אנו מתארים עיבוד אינדוקציה והמעבדה sputum דגימות. ברוק הנגרמת על ידי שאיפת תמיסת hypertonic או מול עם סאלבוטאמול. עיבוד, אנו משתמשים בטכניקה sputum שלם. Dithiothreitol (DTT) משמש כדי לאפשר mucolysis של ברוק דגימות. המטרה העיקרית של עיבוד ברוק היא כדי לקבל ספירת תאים דיפרנציאלית ללמוד את סוגי תאים נוכח לומן דרכי הנשימה. ניתן לבצע ניתוחים נוספים גם על ברוק supernatant ותאים ברוק, אשר עשוי לאפשר את המשך בחקירת תהליכים דלקתיים, מנגנונים חיסוניים. דוגמאות כוללות לומד מגשרים בברוק supernatant וביצוע מגוון גדול של ניתוח בתאי sputum כגון cytometry זרימה, גנומיקה או פרוטאומיקס.
לבסוף, מוצגים תוצאות נציג של ניתוח sputum פקדים בריא לחולי אסתמה, מטופלי COPD.

Hemocytometer תמונה אופיינית מוצג באיור 1 זה הוא מדמיין עם המיקרוסקופ באמצעות את hemocytometer. תאים קשקשיים מזוהים בקלות, כפי שהם הרבה יותר גדול מאשר תאי קשקש. אלה תאים קשקשיים הם תאים אפיתל בא מן הפה. שני סוגים של תאים מוכתמות Trypan Blue כאשר מת. זהירות יש לנקוט כדי להימנע ספירת שמרים חיידקים, גרוטאות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig1.jpg"> 
איור 1 : Hemocytometer תמונה המציגה (A) חיים שאינם-קשקש, (B), מת ללא-קשקש ו (ג) הקשקש התא. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
Cytospin שקופית: איור 2 מציג תמונת הנציגה של שקופית cytospin שהושג לאחר העיבוד ברוק. ניתן להבחין את סוגי תאים שונים (נויטרופילים, אאוזינופילים, מקרופאגים, לימפוציטים, ותאי האפיתל) על-ידי הגיוון ומורפולוגיה שלהם. במקרים מסוימים, זיהום על ידי תאים קשקשיים יכול להיות חשוב ונחשבת, אם האחוז של תאים קשקשיים גדול מ- 80%, המדגם לא מוצלח (איור 3).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig2.jpg"> 
איור 2 : Cytospin שקופית תמונה המציגה (A) של נויטרופילים, (B) macrophage, (ג) eosinophil, (ד) הלימפוציטים, ו- (E) תא אפיתל. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig3.jpg"> 
איור 3 : דוגמה של שקופית cytospin באיכות ירודה עם &gt; 80% של תאים קשקשיים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
אחוזי הצלחה במחלקה שלנו, שיעור ההצלחה של הפרוצדורה (שילוב של אינדוקציה מוצלחת של cytospin קריא), בהתבסס על מדגם של חולים 1,129 (לנסיינים בריאים, חולי אסטמה או מטופלי COPD), 82% (924/1,129). בניתוח משנה בהתאם לסוג של חולים, שיעור ההצלחה הוא 75% (57/76) במקצועות בריאות, 82% (827/1,004) בחולי אסטמה, 82% (40/49) בחולי COPD.
תוצאות במקצועות בריא ב ניתוח רטרוספקטיבי של סדרה של 289 לנסיינים בריאים מהמחלקה שלנו, החציון (טווח בין רבעוני) משקל sputum היה 3.72 g (טווח בין רבעוני של 2.46 g - 5.54 g), ספירת החציוני הכולל הלא-קשקש/g של ברוק 0.59 x 106 ( טווח בין רבעוני של 0.37 x 106 - 1.29 x 106).
בנושאים האלה בריאים, חלקם של תאים קשקשיים הוא נמוך ב- 19% (10% 34%) והוא הכדאיות בגובה של 66% (54-78%). לגבי האחוז של סוגי תאים שונים, תוצאות מסוכמות באיור 4A. ניתן להבחין כי האחוז של מקרופאגים (49% [31-68%]) הוא גבוה יותר מאשר האחוז של נויטרופילים (34% [14% - 60%]), ואילו האחוזים של לימפוציטים (2% [1-3%]), אאוזינופילים (0% [0% 0%]) ותאי אפיתל (4% [2-11%]) נמוכים. תוצאות אלו דומים כאשר הנתונים מבוטאים בערכים מוחלטים (איור 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig4.jpg"> 
איור 4 : התוצאות נציג של ספירת דיפרנציאלית שנצפתה לנסיינים בריאים המבוטא באחוזים (A) או לערכים מוחלטים (B). התוצאות יוצגו כמו חציון (טווח בין רבעוני). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
חשוב גם להתחשב הגיל של המטופלים. אכן, מתאם חזק הוא בין גיל החולה את הפרופורציה של נויטרופילים נוכח sputum דגימות (איור 5). באופן דומה, בעת מיון מטופלים לפי קבוצות גיל 10 שנה (איור 6), הבחנו עלייה משמעותית באחוזים נויטרופילים עם הגדלת קבוצת גיל. לכן, משתנה זה יש לקחת בחשבון כאשר משווים תוצאות גדודים שונים, זהירות יש לנקוט את ההתאמה של נושאים.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig5.jpg"> 
איור 5: מתאם בין גיל לבין ברוק אחוז נויטרופילים. המתאם חושבה עם הבדיקה ספרמן. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig6.jpg"> 
איור 6: האבולוציה של האחוז נויטרופילים בהתאם לקטגוריית גיל. הערך-p של אנובה היה &lt; 0.0001 עבור ההשוואה של נויטרופילים אחוז בין כיתות גיל. השוואות מרובות נעשו עם מבחן השוואות מרובות של דאן. ערכי p-מיוצגים כדלקמן: * p &lt; 0.05, * * p &lt; 0.01, ו * * * p &lt; 0.001. התוצאות יוצגו כמו חציון (טווח בין רבעוני). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
התוצאות בחולים הסובלים ממחלות מערכת הנשימה הטכניקה של ברוק המושרה משמש בדרך כלל כדי להעריך את הפרופיל תאים דלקתיים אצל חולי אסתמה.טכניקה זו ויכול להיות מיושם גם לחולים הסובלים ממחלת ריאות חסימתית כרונית, מחלות נשימה דלקתי אחר. בעת השוואה בין הנבדקים בריא לחולי אסתמה, מטופלי COPD (הקבוצות 3 להיות תואמות גיל, מגדר, טבק הרגלים), הבחנו כי הפרופיל תאים דלקתיים שונה לגמרי בין קוהורטות אלה (איור 7). אכן, חולי אסתמה בדרך כלל מאופיינים אאוזינופילים sputum מוגבה, ואילו חלקם של נויטרופילים sputum הוא בדרך כלל גבוה יותר בחולי COPD לעומת שולט בריא, אשר קשורה לחומרת המחלה.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig7.jpg"> 
איור 7 : ברוק תאים דלקתיים לפרופיל לנסיינים בריאים (n = 45), חולי אסתמה (n = 108), ומטופלים COPD (n = 54). לשלוש הקבוצות היו תואמות מגדר, גיל, הרגלי טבק. ערכי-p של אנובה היו &lt; 0.05, &lt; 0.0001, ו &lt; 0.0001 עבור ההשוואה של נויטרופילים, אאוזינופילים מקרופאגים בין קבוצות, בהתאמה. השוואות מרובות נעשו עם מבחן השוואות מרובות של דאן. ערכי p-מיוצגים כדלקמן: * p &lt; 0.05 ו * * * p &lt; 0.001. התוצאות יוצגו כמו חציון (טווח בין רבעוני). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

כאן נתאר את הטכניקה של ברוק אינדוקציה. פרוטוקול זה גם מסביר את ברוק עיבוד כדי לבצע ספירה מבדלת תא וכדי לאסוף sputum supernatant תאים עבור ניתוח נוסף.

מתודולוגיה Sputum אינדוקציה ועיבוד מעבדה

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

הטכניקה של ליחה מושרית פותחה בתחילת שנות ה -90. הטכניקה הוצעה כדי לחקור מידע חדש במחלות חסימתיות של דרכי הנשימה כמו אסתמה, COPD, ולאחרונה היה עניין גם להסתכל על מידע חדש בפיברוזיס ריאתי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יחסית לא פולשנית בניגוד לברונכוסקופיה.העיבוד דורש עבודת מעבדה, וזה לוקח זמן, אז זה די תובעני, גוזל זמן, וצריך להיות לו מומחיות מסוימת במעבדה, כך שברור שזו טכניקה שקשה להשיג בכל מרכזים. הטכניקה של ליחה מושרה מורכבת משני חלקים, החלק הראשון הוא האינדוקציה, והחלק השני הוא העיבוד. לפני השראת ליחה, עלינו לבצע ספירומטריה, שהיא הערכה של הנפח וקצב הזרימה שהמטופל מסוגל לייצר.ואנחנו צריכים לעשות את זה כי השראת הליחה כשלעצמה עלולה לגרום לברונכיוויזם, אז אנחנו בהחלט צריכים לדעת את הערך הבסיסי של הספירומטריה של המטופלים. אז אנחנו קודם כל מבצעים ספירומטריה, אחר כך אנחנו נותנים למטופלים מרחיבי סימפונות, אנחנו בדרך כלל נותנים 400 מיקרוגרם סלבוטמול, כדי לפתוח בצורה מקסימלית את דרכי הנשימה של המטופלים, וגם כדי למנוע עווית סימפונות שעלולה להתרחש בשלב האינדוקציה. ואחרי 15 דקות, אנחנו מודדים שוב את הספירומטריה, כדי לקבל את מה שאנחנו מכנים הערך הבסיסי של הספירומטריה, ובמיוחד אנחנו מסתכלים על ה-FEV1 שהוא הנפח שהמטופל מסוגל לנשוף תוך שנייה אחת.שופכים מים מזוקקים לתא הנבולייזר עד לרמה המומלצת. הניחי נקייה בתא הנבולייזר. מכסים את המכסה המלא במכסה המתאים.מלאו את הכוס בתמיסת מלח היפרטונית 50 מ"ל 5% אם FEV1 לאחר מרחיב הסימפונות גדול מ-65% חזוי, או 50 מ"ל תמיסת מלח איזוטונית 9% אם FEV1 לאחר מרחיב הסימפונות נמוך מ-65%. הוסף לכוס תמיסת סלבוטמול סולפט 1.75 בריכוז של חמישה מיליגרם למ"ל. חבר את הצינורות והשסתומים בהתאם להוראות היצרן.הטכניקה צריכה להתבצע תחת פיקוח רפואי. הסבירו למטופל את עקרון הבדיקה. בקש מהמטופל להשתמש בקליפ לאף.הפעל את הנבולייזר ובחר את הרמה הנמוכה ביותר של הגדרת התרסיס והמאוורר. בקש מהמטופל לשאוף את התרסיס דרך הפיה עם נשימת גאות ושפל. ניתן להגדיל את רמת התרסיס והגדרת המאוורר בהתאם לסובלנות המטופל.במקרה של לחץ בחזה או אי נוחות נשימתית, הפסק את ההליך ובצע ספירומטריה למדידת ערך FEV1 של המטופל. לאחר חמש דקות של שאיפה, או במקרה של שיעול או בחילה, עצור את הנבולייזר. בקשו מהמטופל להסיר את אטב האף, לשטוף את הפה ולגרגר פעמיים במי ברז, ולהשליך את המים הללו לכיור.לאחר מכן, כשהמטופל משתעל ליחה ויורק את מה שיוצא מהגרון במיכל פלסטיק. בצע את תמרון הנשימה הראשון למדידת FEV1. לאחר כל טנטטיבי של ייצור כיח, אנו מודדים את ערך ה-FEV1.אם ערך ה-FEV1 יורד ביותר מ-20% אנו מפסיקים את ההליך ואנו נותנים למטופלים ערפול של איפרטרופיום ברומיד, שהוא חומר אנטי-כולינרגי שיפעל בשילוב עם בטא-שני אגוניסטים שכבר נתנו במהלך ההליך. אם ערך ה-FEV1 אינו יורד ביותר מ-20%, אנו ממשיכים בהליך למשך זמן כולל של 10 עד 20 דקות בהתאם לאיכות ונפח הליחה המיוצר על ידי המטופל. לאחר קבלת דגימת הליחה, שמור אותה במקרר עד לעיבוד.אז החלק השני מורכב מעיבוד הליחה, ולשם כך עלינו להכין תחילה את שני הפתרונות בהם אנו הולכים להשתמש לעיבוד זה. אז אנחנו צריכים להכין את ה-Dithiothreitol הידוע גם בשם DTT. יש להכין את התמיסה על ידי דילול ה- DTT במים סטריליים על מנת לקבל תמיסה של 6.5 מילימולרים.אז אתה צריך להימנע מחשיפת ה-DTT לאוויר הסביבה, ולשם כך אנו משתמשים במזרק ובמחט. שנית, עליכם להכין את התמיסה הכחולה של הטריפאן, ולשם כך עליכם לבצע דילול של DPBS עם טריפן כחול, כדי לקבל תמיסה של 0.08%אז לגבי הליחה, עליכם להעביר את כל הליחה בצינור פלסטיק תחתון חרוטי של 50 מ"ל, ולשקול את הדגימה. הוסף משקל פי שלושה של תמיסת DPBS.מערבול לאט את הדגימה למשך 30 שניות, צנטריפוגה ב 800 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אוספים את הסופרנטנט בצינור פלסטיק תחתון חרוטי של 50 מ"ל, לאחר סינון דרך שתי שכבות בודדות של גזה סטרילית. הקצו את הסופרנטנט בצינורות פלסטיק של 2 מ"ל ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס.שימו לב שדגימות הסופרנטנט שימושיות עבורנו כמרכיב תלת פאזי של ליחה. אם נפח משטח התאים נמוך מ-5 מ"ל, הוסף DPBS כדי להגיע לנפח של 5 מ"ל של מתלה תאים. מדללים את תרחיף התא בנפח אחד של DTT ב -6.5 מילימולר.נדנד את מתלה התאים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בעזרת עובד ספסל. יש לדלל את תרחיף התאים לפחות שלוש פעמים באמצעות DPBS. צנטריפוגה את תרחיף התאים המדולל ב -550 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.השליכו את הסופרנטנט. השעו את לוח התאים בסביבות מ"ל DPBS אחד. הערך ורשום את הנפח המדויק של תרחיף התאים.הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים ל -50 מיקרוליטר של תמיסת הטריפן הכחולה המדוללת והומוגני. שים את הדגימה מתחת לתלוש הכיסוי של ציטומטר המוציל, והנח אותה מתחת למיקרוסקופ אופטי. להעריך את ריכוז התאים של תרחיף התאים, את אחוז תאי הקשקש ואת אחוז הכדאיות של תאים שאינם קשקשיים.לדלל הקצאה של המתלה עם DPBS כדי להשיג לפחות 350 מיקרוליטר של תרחיף תאים ב-500,000 תאים למ"ל. הרכיבו את רכז התאים בהתאם להוראות היצרן. הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף התא בכל אחד משלושת התאים של רכז התא.סובב שתי דקות בחום של 150 גרם בטמפרטורת החדר בצנטריפוגה ציטו. השליכו את הסופרנטנט. הניחו למגלשה להתייבש באוויר.מכתים את השקופית עם div מהיר או ערכת כתמי ערכיות ניקל בהתאם להוראות היצרן. הר עם מדיום הרכבה והחלקת כיסוי. הנח את השקופית מתחת למיקרוסקופ האופטי עם טבילות שמן.ספרו לפחות 500 תאים שאינם קשקשיים, הנויטרופילים, האאוזינופילים, המקרופאגים, הלימפוציטים ותאי האפיתל, ורשמו את הערכים המוחלטים ואת האחוז וסוג התא. לגבי התוצאות, באמצעות ההמוציטומטר, עלינו לספור את התאים החיים שאינם קשקשיים שאינם צבעוניים. כמו כן, התאים המתים שאינם קשקשיים שצבועים בכחול.ותאי הקשקש. תאים אלה הם תאי אפיתל המגיעים מהפה. הם גדולים, כך שקל לזהות אותם בהשוואה לתאים אנושיים קטנים.אז אתה צריך להימנע גם מלספור חיידקים, שמרים או גרוטאות. אם תרחיף התאים מכיל יותר מ -80% מתאי הקשקש, דגימה זו נחשבת באיכות ירודה ואינה מתאימה לשקופית ציטוספינים. לכן דגימה זו נחשבת כלא מוצלחת.הספירה על הציטוספין המוכתם מתבצעת על פי צבע התאים והמורפולוגיה שלהם. הנויטרופילים, המאפיינים העיקריים הם הגרעין הרב-אוני שהקל על זיהוי התאים. תאים אלה עגולים, קטנים וצבועים בוורוד ניטרלי.האאוזינופילים, תאים אלה מורכבים מגרגירים אדומים, קלים לזיהוי. גודלם של תאים אלה קרוב לנויטרופילים. המקרופאגים, הם גדולים פי שניים עד חמישה מהנויטרופילים, וצבועים בכחול.הציטופלזמה יכולה להכיל פסולת ואקואולים. הלימפוציטים, תאים אלה עגולים וקטנים, צבועים בכחול, ובעלי גרעין גדול וצפוף. לתאי האפיתל יש צורה עמודית, הם צבועים בוורוד, ולעתים קרובות מציגים ריסים בחלק העליון.הנה כמה דוגמאות לדגימות ציטוספין בלתי קריאות עם יותר מ-80% מתאי הקשקש. אני חושב שזו טכניקה שימושית מאוד, אולם עלינו להיות זהירים מאוד מכיוון שהשראת הליחה חייבת להיעשות תחת פיקוח רפואי, אך הטכניקה של השראת כיח נותנת לך מידע רב על המצב הדלקתי של החולים בדרכי הנשימה. זה יכול לאפשר לך למדוד סמנים ביוכימיים שונים בסופרנטנט, ואתה יכול גם למדוד דברים שונים בחלקים התאיים, כך שליחה מושרה מאפשרת לך לבצע ציטומטריית זרימה, פרוטאומיקה, טרנסקריפטומיקה ואפילו גנומיקה.

methodology-for-sputum-induction-and-laboratory-processing

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

דרכי הנשימה המחוברות לריר של חולי סיסטיק פיברוזיס (CF) הן סביבה אידיאלית לפטוגנים חיידקים לשגשג. כתב היד מתאר שיטה חדשה לחקר מיקרוביום הריאות CF בסביבה שבה מחקה את המחלה, וכיצד שינויים בתנאים כימיים יכולים להניע דינמיקה מיקרוביאלית.

מודל ה- WinCF - מיקרוסקוס הזול והבלתי נסבל של ברונכייל מחובר ריר לחקר המיקרוביולוגיה של זיהומי ריאות

פרוטוקול זה מספק שיטות להדמיה של תאי חיידקים ורב-סוכר סינתזת רב-סוכר (Psl) בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס.

הדמיה של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס

פרוטוקול זה מתאר מיצוי של תרכובות אורגניות נדיפות מדגימה ביולוגית בשיטת מיצוי סורבנט בסיוע ואקום, כרומטוגרפיית גז בשילוב עם ספקטרומטריית מסה באמצעות מסילת הכנת דגימות Entech וניתוח נתונים. הוא מתאר גם תרבית של דגימות ביולוגיות ובדיקת איזוטופים יציבה.

לכידת תרכובות אורגניות נדיפות מיקרוביאליות המיוצרות באופן פעיל מדגימות הקשורות לבני אדם עם מיצוי סורבנט בסיוע ואקום

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לניתוק כיח למתלה תא בודד ואת האפיון הבא של תת-קבוצות סלולריות בפלטפורמות ציטומטריות סטנדרטיות של זרימה.

ניתוח כיח מבוקר איכות לפי ציטומטריית זרימה

פתוגנים חיידקיים שונים עלולים לגרום לזיהומים בדרכי הנשימה ולהוביל לבעיות בריאותיות חמורות אם לא מזהים אותם במדויק ומטפלים בהם מיד. זיהוי מהיר ומדויק של פתוגנים אלה באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאה מספק ניהול ובקרה יעילים של זיהומים בדרכי הנשימה בסביבות קליניות.

זיהוי מהיר של פתוגנים חיידקיים הגורמים לזיהומים בדרכי הנשימה התחתונות באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאה בתיווך שבב מיקרופלואידי

מאמר זה מתאר פרוטוקול ניסויי מפורט למדידת תכולת הפחמן של מקרופאגים בדרכי הנשימה במטרה להעריך את מינון החשיפה הפנימית ברמת החשיפה לחלקיקים בודדים.

מדידת תכולת פחמן במקרופאגים בדרכי הנשימה שנחשפו לחלקיקים המכילים פחמן

אנו מציגים שיטה אופטימלית למיצוי DNA מליחה מזוהמת באמצעות שיטת מיצוי מבוססת מטריצה בשילוב עם טיהור חרוזים מגנטיים לריצוף ממוקד במורד הזרם של Mycobacterium tuberculosis.

מיצוי DNA מבוסס מטריצה לריצוף ממוקד של הדור הבא על דגימות ליחה מטוהרות

השאיפה כרית שומן היא גישה מועדפת, עלות פולשנית, נמוכה בהשוואה לשיטות אחרות כדי לזהות עמילואיד לאבחון עמילואידוזיס מערכתית. מאמר זה מדגים וידאו המתאר פרוצדורליים לביצוע השאיפה כרית שומן עם עיבוד מתאים של הדגימה לתוצאות אבחון אופטימלי.

ביצוע ועיבוד FNA של Pad שומן Anterior עבור עמילואיד

Gyrification מדידה (קיפול קליפת המוח) בכל גיל מהווה חלון אל התפתחות המוח מוקדם. לפיכך, אנו קודם לכן פיתחו אלגוריתם למדוד gyrification המקומית אלפי נקודות מעל חצי...

כיצד למדוד מתקפל קליפתיים מתמונות MR: מדריך שלב אחר שלב כדי לחשב מדד Gyrification מקומי

למד את שיטת אינדוקציית הליחה לאיסוף דגימות לא פולשניות לניתוח מחלות נשימה כמו אסתמה ו-COPD. הפרוטוקול כולל ספירומטריה, נבוליזציה ועיבוד מעבדה לניתוח תאים דיפרנציאלי ואיסוף סופרנטנט.

מתודולוגיה Sputum אינדוקציה ועיבוד מעבדה

גלה סרטונים נוספים