גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי להקליט התגובה גזע המוח של עכברוש לאחר הלידה הגורים. לבחון התפתחות תפקודית של תאים שיער החיצוני, ההליך ניסיוני של קלאמפ תיקון שלם-תא הקלטה בתאים מבודדים שיער החיצוני מתואר צעד אחר צעד.

המטרה הכוללת של בדיקה אלקטרופיזיולוגית זו היא לחקור את השינויים המורפולוגיים והתפקודיים של תאי שיער שבלול במהלך ההתפתחות לאחר הלידה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלקת העוזר הקולי, כגון מתי תאי השיער שלנו מקבלים את תפקידיהם במהלך תחילת השמיעה? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו מסוגלים להעריך את תפקודם של תאי שיער בודדים, המבודדים מגורי החולדות שלאחר הלידה.

ידגימו את ההליך וונלו פאן, שאשה גואו וננה שו שהיו סטודנטים מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, הניחו את החיה המורדמת בתבנית קצף פוליאתילן כדי לשתק את גוף החיה. לאחר מכן, הניחו את החיה על שולחן נגד רטט בחדר מחליש קול.

שמור על טמפרטורת הגוף של החיה על 37.5 מעלות צלזיוס בעזרת כרית חימום. לאחר מכן, נגב את אזור הראש עם 70% אתנול. בצע חתך של מילימטר עד שניים בגחון לרוחב לאפרכסת החיצונית כדי למקם את אלקטרודת הייחוס או האלקטרודה הקרקעית.

לאחר מכן, הנח אלקטרודת הקלטה תת-עורית מעל קודקוד הגולגולת. באמצעות מחולל הפונקציות, צור פרצי טון מכוילים בתדרים ובעוצמות שונות. העבירו את גירוי הקול דרך רמקול אלקטרוסטטי הממוקם במרחק של 10 סנטימטרים מראש החיה.

כדי להשיג את תגובות גזע המוח השמיעתיות, הפוטנציאלים המעוררים קול מסוננים, מוגברים וממוצעים באמצעות מעבד רב תכליתי. הקלטת ה-ABR בת 40 הדקות מנוטרת באופן מקוון ומאוחסנת לניתוח לא מקוון. בחלק זה יש לעקר את ראש החיה על ידי ריסוס באתנול 70%.

לאחר מכן, פתחו את הגולגולת לאורך קו האמצע הסגיטלי בעזרת מספריים והסירו את המוח כדי לחשוף את האוזן הפנימית. לאחר מכן, העבירו את האוזן הפנימית לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר מלאה בשלושה מיליליטר L-15 מדיום קר כקרח. תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, השתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר את הקפסולה הגרמית של השבלול.

לאחר מכן, פרקו את ה-OC וה-SV המשויכים ל-modiolus. על ידי החזקת החלק הבסיסי של SV עם מלקחיים, הפרד את OC מ-SV לחלוטין על ידי התפרקות איטית מהבסיס לקודקוד. לאחר מכן, חתוך OC באופן שווה לשלוש חתיכות באמצעות מספריים עדינים.

יש לבצע את כל השלבים ב-L-15 קר כקרח במהירות האפשרית על מנת למזער את ההידרדרות וההידרדרות של הרקמות. בשלב זה, בעזרת קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, העבירו את מקטעי ה-OC למגלשת זכוכית. תקן אותם עם 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד למשך ארבע שעות לפחות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, שטפו את הרקמה על ידי עקירת הפרפורמלדהיד עם 100 מיקרוליטר PBS טרי. לאחר מכן, שטפו את הטישו שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. לאחר מכן, דגרו את הרקמה עם חומר חדירות של 0.3% ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר 30 דקות, השליכו את חומר החדירות ושטפו את הרקמה שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, חסום את הרקמה עם סרום עיזים רגיל של 10% ו-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר. דגרו על הרקמה עם נוגדן אנטי-פרסטין C טרמינוס ותמיסת חסימה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

לאחר מכן, שטפו את הטישו שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, דגרו את הרקמה עם נוגדן משני מצומד Alexa 488 בתמיסת חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. שטפו את הטישו שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות בכל פעם בחושך.

לאחר מכן, דגרו את הרקמה עם רודמין פלואידין למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. שטפו את הטישו שלוש פעמים עם PBS למשך חמש דקות בחושך. לאחר מכן, הרכיב את הדגימה על מגלשת זכוכית עם מדיום הרכבה.

צלם אותו עם מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות לייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו-594 ננומטר. בהליך זה, השתמש בחולץ הפיפטה ובמיקרו-פורגר. הכינו פיפטות תיקון בקוטר קצה של שניים עד שלושה מיקרון.

לאחר מכן, מלאו מחדש את הפיפטות בתמיסה תוך-תאית. בעזרת קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, העבירו חתיכת OC לצלחת פטרי של 35 מילימטר. עכל את הרקמה עם 100 מיקרוליטר של מדיום עיכול אנזימטי למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, עקור את מדיום העיכול האנזימטי עם 100 מיקרוליטר L-15. חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות בעזרת מיקרואזמל כדי לבודד את תאי השיער. לאחר פיפטינג עדין, העבירו את התאים לתא פלסטיק קטן תוצרת בית מלא בתמיסת אמבטיה נטולת אנזימים.

לאחר מכן, הנח את החדר על הבמה של מיקרוסקופ הפוך ומצא את ה-OHCs הבודדים שנראים בריאים. לאחר מכן, טען את פיפטת התיקון לשלב הראש של מגבר 700B. יש למקם את פיפטת המדבקה סביב החלק התחתון של תא השיער החיצוני.

לאחר מכן, תיקון תא שלם מהדק את ה-OHC על ידי איטום הדופן הצדדית של גוף התא. הפעל יניקה קלה עד שקרום התא נקרע. לאחר מכן, הגדר את פוטנציאל ההחזקה על 70 מילי-וולט.

תאים עם התנגדות גישה הנעה בין 10 ל-17 מגה-אוהם והתנגדות ממברנה הנעה בין 100 ל-500 מגה-אוהם נחשבים לתצורת תא שלם מוצלחת. הפעל מתח היפרפולריזציה ודפולריזציה על התא כדי לעורר זרמי תא שלמים. מדוד את קיבול הממברנה של OHCs באמצעות פרוטוקול גירוי מתח של שני גלי סינוס הנשלט על ידי תוכנת מהדק התיקון.

הגדר את טווח מתח הגירוי בין 140 ל-110 מילי-וולט ואחסן את הנתונים לניתוח לא מקוון. לאחר עיכול עדין, ה-OHCs בודדו מה-OC. הקלטות מהדק מתח תא שלם בוצעו מ-OHCs שבודדו באופן חריף משבלול החולדה. דוגמה מייצגת לכל זרם התא שנרשם מ-P9 OHC מבודד בתגובה לפוטנציאל הממברנה שהשתנה מ-140 ל-107 מילי-וולט מוצגת כאן.

איור זה מציג את קיבול הממברנה הלא ליניארי המתקבל משני OHCs בגילאים שונים. תגובות מתח הקיבול הותאמו לפונקציית בולצמן. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים, אם היא מבוצעת כראוי.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע אמצעים אחרים כמו Western Blotting ו-PCR על מנת לענות על שאלות נוספות כגון הערכת רמת הביטוי של חלבון כלשהו, כגון פרסטין בתאי שיער חיצוניים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תאי השיער לחקור תכונות אלקטרופיזיולוגיות בשבלול ובמערכת שיווי המשקל. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לחקור את השינויים המורפולוגיים והתפקודיים של תאי שיער שבלול במהלך ההתפתחות לאחר הלידה.