Name: גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: למדו את שיטת תיקון הקלאמפ שלם-תא לתאי שיער חיצוניים בחולדות לחקר פיתוח השמיעה. טכניקה זו מאפשרת הערכת תפקוד תאים בודדים ומספקת תובנות לביולוגיה של השבלול ותחילת השמיעה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים התוכנית 973 (2014CB943002), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (11534013, 31500841).

כל הפרוטוקולים ניסיוני מעורבים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה חיה של האוניברסיטה הרפואית בדרום.
1. מכינים את פתרונות לניסויים
<ol><li>להכין ההרדמה (ראה טבלה של חומרים): סודיום פנטוברביטל 1.5% מומס ddH2O.</li>
	<li>להכין את הפתרון לנתיחה (ראה טבלה של חומרים): להמיס שקית אחת של אבקת L-15 של Leiboviz ב 1 ליטר של ddH2O. התאם pH ל 7.3 עם 1 M NaOH. התאם osmolarity ל 300-330 mOsm על-ידי שימוש, osmometer ו 10 מ מ HEPES לפני השימוש.</li>
	<li>לפזר 2 מ"ג/מ"ל collagenase הרביעי (ראה טבלה של חומרים) בתמיסה לנתיחה מוכן בשלב 1.2.</li>
	<li>להכין את הפתרונות immunostaining (ראה טבלה של חומרים): להמיס את paraformaldehyde 4% בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS). התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל; לענוד הגנה הולמת.</li>
	<li>לדלל את הסוכן חדירות 0.3% ב- PBS. לדלל את הנסיוב עז נורמלי 10% ב- PBS כמו המאגר חסימה. לדלל את 1:200 נוגדן prestin במאגר חסימה. לדלל את 1:600 Alexa488 מצומדת נוגדן במאגר חסימה. לדלל את 1:200 isothiocyanate Phalloidin-Tetramethylrhodamine B ב- PBS.</li>
	<li>להכין את הפתרון חוץ-תאית (ראה טבלה של חומרים): להכין L-15 בינוני של Leiboviz, כפי שתואר לעיל (שלב 1.2).</li>
	<li>להכין את הפתרון תאיים (ראה טבלה של חומרים).</li>
</ol>2. ABR הקלטה
הערה: ABR הקלטה תוארה בעבר בפירוט שלנו המחקר הקודם9.
<ol><li>עזים ומתנגד חולדות ספראג Dawley (SD) (בת 1-14 יום הגורים ו- 2 - בת חודשים מבוגרים, שני המינים) עם זריקה אחת של 1.5% סודיום פנטוברביטל (22 מ"ג/ק"ג עבור הגורים ו- 30 מ"ג/ק"ג למבוגרים, בקרום הבטן (i.p.)).</li>
	<li>מקם את החיה anesthetized תבנית פוליאתילן מוקצף לשתק גוף החיה. במקום החיה על טבלת אנטי רטט בחדר attenuating-קול. לשמור על טמפרטורת גוף של החיה 37.5 ° C עם כרית חימום.</li>
	<li>נגב באזור הראש עם אתנול 70% (vol/כרך). באמצעות מספריים בסדר, לבצע חתך 1-2 מ מ ventrolateral פינה חיצוני כדי למקם את הפניה אלקטרודה או הקרקע. אלקטרודה המחט תת-עורי (הקלטה אלקטרודה) ממוקם מעל לקודקוד הגולגולת (איור 1 א').</li>
	<li>שימוש מחולל אותות, ליצור התפרצויות הטון מכויל (עלייה ms 1/סתיו, מישור 3 ms) של תדרים שונים (2, 4, 8, 16, 24 ו- 32 kHz) בעוצמות (ירד מ 85 dB SPL 10 בשלב 5 dB). לגוון את תדירות משרעת באופן ידני או באמצעות מחשב. לספק גירויים קול באמצעות רמקול אלקטרוסטטי ממוקם 10 ס מ משם לכיוון הראש של חיה.</li>
	<li>סינון (100-1, 000 Hz), להגביר, ממוצע (256 פעמים) קול elicited פוטנציאל באמצעות מעבד מרובה פונקציות כדי לקבל את Abr. עקבות ABR להשגחה באינטרנט ומאוחסן לניתוח במצב לא מקוון. זה לוקח בערך 40 דקות כדי להשלים את ABR הקלטה מחיה לחיה. הערה: בדרך כלל, 3-7 פסגות (גל אני לגל VII) עם השהיות ארוכות יותר פחות מ 15 ms יכול להיות מזוהה (איור 1B). הסף ABR מוגדר של רמת הקול המינימלי-מאיזה גל I ו- II יכול להתגלות.</li>
	<li>המתת חסד לפני החיות ער מן ההרדמה (עם זריקה בקרום הבטן של 0.3 mL 1.5% סודיום פנטוברביטל).</li>
</ol>3. ניתוח של איבר קורטי (OC)
<ol><li>עזים ומתנגד עכברוש הגורים. עבור חולדות בן פחות מ 6 ימים (< P6), לשמור את החיה לצלחת תרבות 100 מ מ, מכסים את הכלי עם קרח למשך 10 דקות. עבור חולדות > P6, עזים ומתנגד החיה עם זריקה אחת של 1.5% סודיום פנטוברביטל (22 מ"ג/ק"ג, i.p.). לערוף את הגורים עכברוש לאחר הרדמה.</li>
	<li>לחטא את הראש ע י ריסוס עם 70% (vol/כרך) אתנול.</li>
	<li>לפתוח את הגולגולת לאורך הקו האמצעי הסאגיטלי עם מספריים; מסירים את המוח כדי לחשוף את האוזן הפנימית.</li>
	<li>העברת האוזן הפנימית לתוך צלחת פטרי 35 מ מ מלא 3 מ"ל של קרח L-15 (איור 2 א).</li>
	<li>תחת המיקרוסקופ לנתיחה, להשתמש מלקחיים בסדר כדי להסיר את הקפסולה הגרמי של שבלול (איור 2B).</li>
	<li>עטיפה OC ומקושרת לחריץ vascularis (SV) מ- modiolus.</li>
	<li>על-ידי החזקת בחלק הבסיס של ה-SV עם מלקחיים, להפריד OC של ה-SV לחלוטין על-ידי רגיעה לאט מן הבסיס-כדי-איפקס (איור 2C).</li>
	<li>לחתוך OC באופן שווה לתוך שלוש חתיכות באמצעות מספריים בסדר (איור דו-ממדי).</li>
</ol>4. immunofluorescence מכתים
<ol><li>באמצעות טיפ פיפטה µL 200, להעביר את הקטעים של OC (שלב 3.8) על זכוכית, לתקן עם 100 µL של 4% paraformaldehyde במשך 4 שעות לפחות ב 4 º C. התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל; לענוד הגנה הולמת.</li>
	<li>לשטוף את הרקמה באמצעות הסטת את paraformaldehyde עם µL 100 ל- PBS טריים. לשטוף את הרקמה שלוש פעמים במשך 10 דקות.</li>
	<li>דגירה הרקמה עם סוכן חדירות 0.3% ב- PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>למחוק את הסוכן חדירות ב- PBS ולשטוף את הרקמה שלוש פעמים עם PBS.</li>
	<li>בלוק עם הנסיוב עז נורמלי 10% ב- PBS לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה עם נוגדן anti-prestin-קצה קרבוקסילי (1:200) בחסימה פתרון 2 h בטמפרטורת החדר או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>לשטוף שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות.</li>
	<li>דגירה עם נוגדנים משניים מצומדת-Alexa488 (1:600) בתמיסה החסימה לשעה בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>לשטוף שלוש פעמים עם PBS עבור 5 דקות בחושך.</li>
	<li>תקופת דגירה עם rhodamine-phalloidin (1:200) של 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>לשטוף שלוש פעמים עם PBS עבור 5 דקות בחושך.</li>
	<li>הר על משטח זכוכית הרכבה בינונית (מכיל דאפי). התמונה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות 405 ננומטר, 488 ננומטר, 594 ננומטר לייזר. קבע את עוצמת הלייזר-0.1-0.5 mW מהירות הסריקה-מסגרת 0.5/s.</li>
</ol>5. תיקון קלאמפ הקלטה של OHCs מבודדים
<ol><li>השתמש את פולר פיפטה, מיקרו-הזייפן לבצע תיקון סיליקון בקוטר טיפ 2-3 מיקרומטר. מילוי חוזר של פיפטות עם פתרון תאיים. בדרך כלל, ההתנגדות הראשונית של תיקון פיפטה היה 2.5-3.5 MΩ בתמיסה אמבט.</li>
	<li>באמצעות טיפ פיפטה 200 µL, להעביר פיסת OC (מתוך שלב 3.8) 35 מ מ פטרי. לעכל את הרקמה עם 100 µL עיכול אנזימטי בינוני (collagenase הרביעי, ראה טבלה של חומרים) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>תחסיר המדיום עיכול אנזימטי עם 100 µL של L-15. חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות בעזרת אזמל מיקרו לבודד את תאי השיער.</li>
	<li>לאחר pipetting עדין, להעביר את התאים לתא פלסטיק קטן תוצרת בית (קוטר ~ 1.5 ס מ) מלא אמבטיה ללא אנזים פתרון (~ 1.5 מל ', ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>מניחים את התא על השלב של מיקרוסקופ הפוכה. למצוא את OHCs בודד בריא להופיע.</li>
	<li>לטעון על פיפטה תיקון לתוך השלב הראשי של מגבר 700B. להעביר את פיפטה תיקון בקפידה על-ידי micromanipulator ומקמו אותו סביב החלק התחתון של התא שיער החיצוני (איור 3 א).</li>
	<li>תיקון שלם-תא מהדק OHC על ידי איטום הקיר לרוחב של גוף התא. החל יניקה קלה עד נקרע קרום התא. הגדר החזקת פוטנציאליים ב-70 mV. תאים עם הגישה התנגדות נע בין 10 ל 17 MΩ והתנגדות ממברנה נע בין 100 ל 500 MΩ, והם נחשבים תצורה שלם-תא מוצלחת.</li>
	<li>באמצעות שליטה במחשב, החל hyperpolarizing depolarizing מתח (משך 250 ms והחל −140 וכלה +94 mV ב- 13 שלבים mV) על התא שמעודדים תאים כל הזרמים.</li>
	<li>להגביר את הזרמים תאים שלמים, לסנן (תדירות פינה של 5 קילו-הרץ) על ידי מגבר 700B. להמיר את הנתונים על-ידי ממיר 1440A חנות לניתוח במצב לא מקוון.</li>
	<li>למדוד את קיבול הממברנה של OHCs באמצעות פרוטוקול גירוי מתח גל סינוס שני נשלט על ידי תוכנת מלחציים תיקון. הגדר את טווח מתח stimulate מ-140 110 mV. לאחסן את הנתונים לניתוח במצב לא מקוון.</li>
</ol>

<ol><li>He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+in+to+the+amazing+outer+hair+cell%3A+membrane+wizardry+with+a+twist+and+shout%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout.</a> J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).</li>
<li>Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+amplification%2C+outer+hair+cells+and+prestin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cochlear amplification, outer hair cells and prestin.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405, 149-155 (2000).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
<li>Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+morphological+and+functional+maturation+of+mechanotransduction+in+rat+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells.</a> J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).</li>
<li>Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+specific+influences+of+early+acoustic+environments+on+primary+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex.</a> Nat Neurosci. 4, 1123(2001).</li>
<li>De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+window+for+spectral+tuning+defined+in+the+primary+auditory+cortex+%28A1%29+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat.</a> J Neurosci. 27, 180-189 (2007).</li>
<li>He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+appearance+and+development+of+electromotility+in+neonatal+gerbil+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells.</a> Hearing Res. 78, 77-90 (1994).</li>
<li>Hang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+Progression+of+Prestin+Expression+and+Auditory+Brainstem+Response+during+Postnatal+Development+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats.</a> Neural Plast. , 4545826(2016).</li>
<li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+absolute+auditory+thresholds+in+the+house+mouse+%28Mus+musculus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Audiol+Soc%22%5BJournal%5D)">Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus).</a> J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).</li>
<li>Møller, A. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%B8ller%2C+AR+%22Hearing%3Aanatomy%2C+physiology%2C+and+disorders+of+the+auditory+system%22">Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system</a>. , Academic Press. Dallas. (2006).</li>
<li>He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cochlear+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of cochlear inner hair cells.</a> Hearing Res. 145, 156-160 (2000).</li>
<li>Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Pendrin+Protein%2C+an+Anion+Transporter+and+Molecular+Motor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biological+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor.</a> J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).</li>
<li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Urethane+on+Rat+Outer+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells.</a> Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בחולדות צעיר יותר היום ה-11, אין פוטנציאל פעולה בתגובה לגירוי צליל יכול להיות שנצפו בקליפת השמיעה6,7. לכן, כמחנכת היום ה-11 מתואר "תחילת הדיון"10. פיתוח שמיעה פונקציה לפני תחילת הדיון היה לא טוב למד עדיין. באמצעות השיטה דומה עבור הקלטת ABR למבוגרים, נדגים כי Abr יכול להיות שהפיק צליל טהור פרץ מן החולדה הגורים צעיר יותר P11 (איור 1). עם זאת, ואת ABR המתקבל הגורים עכברים הראה כמה תכונות שונות מאלו של מבוגרים בעל...

שתי פונקציות שונות של שבלולי תאים שיער החישה הם חיוניים עבור יונקים שמיעה: mechanoelectric התמרה חושית (MET) ו- electromotility1,2. על ידי ערוצי MET ממוקם על הצרור שיער, IHCs (IHCs) OHCs המר רטט קול לתוך שינויי פוטנציאל ממברנה, כמו גם את האותות החשמליים של ספירלה innervated גנגליון נוירונים. OHCs לשנות את אורכם תא עם קרום פוטנציאליים ומגבירים את הרטט של קול ברמה נמוכה. פעילות זו כינה electromotility נגזר על ידי prestin חלבון המנוע ממוקם בקיר הלטראלי של OHCs3.
במינים רבים כולל מכרסמים, הפונקציה שמיעה היא בשלה4,מוקדמת אפוק כמחנכת5. אין פוטנציאל פעולה בתגובה אותות קול יכול להתגלות בקליפת המוח השמיעתית לפני6,תחילת7שמיעה. התפתחות המורפולוגיה והתפקוד של שבלול נחקרה נרחב העכבר, גרביל, עכברוש-4,-5,-8. Mechanotransduction ואת electromotility של תאים שיער מפותחים גם בתחילת החיים אפוק5.
על מנת להעריך את הרגישות שמיעה של חולדות בגילאים שונים כמחנכת, פיתחנו שיטה של גזע המוח השמיעתית תגובה (ABR) הקלטה עכברוש הגורים. תיקון שלם-תא קלאמפ היא טכנולוגיה אידיאלי כדי לחקור את OHCs electrophysiologically. עם זאת, בהשוואה את המלחציים תיקון הופיעה נוירונים ותאי אפיתל אחרים, שיעור נמוך של תאים שלמים איטום מוגבלת החקירה של electromotility של OHCs מבודדים.
כאן נתאר הליך כדי לחקור את OHCs מורפולוגית, electrophysiologically ב שבלול בחריפות הפומבית של חולדות כמחנכת. בשיטה זו יכול להיות שונה כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המסדירים הפנימי תא שיער התפתחות ותפקוד.

<table><tbody><tr><td><חזק>מאדים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פנטוברביטל נתרן</td><td>סיגמא</td><td>P3761</td><td>1.5% במים</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>תגובות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>תמיסת דיסקציה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td> של לייבוביץ <td>1 חבילה ב-1 ליטר</td></tr><tr><td>מים קולגנאז IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td>2 מ"ג/מ"ל ב-L-15</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 מ"מ</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>תגובות</ תמיסות חזקות</td></tr><tr><td>><חזקות>צביעה חיסונית</חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>10010023</td><td>PH 7.3</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא</td><td>158127</td><td>4% ב-PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>ZS-0694</td><td>0.3% ב-PBS</td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10000C</td><td>10% ב-PBS</td></tr><tr><td>נוגדן פרסטין</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-22694</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>נוגדן מצומד Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>dil 1:600</td></tr><tr><td>Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>C0060</td><td>dil 1:2</td></tr><tr><td><0 חזק>שם</חזק></td><td><חזק> חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>פתרון חוץ-תאי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td> של לייבוביץ <td>1 חבילה ב-1 ליטר מים</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 מ"מ</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>תמיסה תוך-תאית</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>סיגמא</td><td>7647-17-8</td><td>140 מ"מ</td></tr><tr><td>MgCl<תת>2</תת></td><td>סיגמא</td><td>7791-18-6</td><td>2 מ"מ</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>סיגמא</td><td>67-42-5</td><td>10 מ"מ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 מ"מ</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>ציוד<חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אוסמומטר</td><td>Gonotec</td><td>OSMOMAT 3000 בסיסי</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>WPI</td><td>14095</td><td>פינצטה dumont</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>מכשיר סאטר</td><td>MODLE-P97</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו פורג'</td><td>Narishigen</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>מיני מערכת הפעלה</td><td>מכשיר סאטר</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp</td><td>Axon</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>מערכת רכישת נתונים עם רעש נמוך</td><td>אקסון</td><td>1440A</td><td></td></tr><tr><td>ES1 רמקול</td><td>Tucker-Davis Technologies</td> TDT system 3 Tucker-Davis Technologies<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigGenRP software</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSigRP software</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>jClamp</td><td>Scientific Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מרכז חיות ניסוי של חולדות SD של האוניברסיטה</td><td></td><td></td> הרפואית הדרומית<td></td></tr></tbody></table>

גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

תא שיער החיצוני הוא אחד משני הסוגים של תאי חישה שיער ב שבלול יונקים. הם לשנות אורכם תא עם הקולטן פוטנציאליים כדי להגביר את הרטט חלש של אותות קול ברמה נמוכה. מורפולוגיה ורכוש אלקטרופיזיולוגיות של תאים שיער החיצוני (OHCs) להתפתח מוקדם הגילאים כמחנכת. ההבשלה של תא שיער החיצוני יכול לתרום להתפתחות של מערכת השמיעה. עם זאת, התהליך של פיתוח OHCs לא למדה היטב. זה גם בגלל הקושי למדוד את תפקידם על ידי גישה אלקטרופיזיולוגיות. במטרה לפתח שיטה פשוטה כדי לטפל בבעיה לעיל, כאן אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי ללמוד את הפונקציה של OHCs ב שבלול בחריפות הפומבית של חולדות כמחנכת. בשיטה זו, אנו יכולים להעריך את התגובה שבלולי לגירויים צליל טהור, לבחון את רמת הביטוי והתפקוד של prestin חלבון מנוע ב- OHCs. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור את תאי השיער הפנימי (IHCs).

ABR יכול להיות ממיתוס עכברוש מרדימים גורים שגילם יום כמחנכת 7 (P7) באמצעות התפרצויות צליל טהור (איור 1 א'). כפי שמוצג באיור 1B, ואת ABR המתקבל הגורים עכברים הראה רק 3-4 גלים ברורים עם משרעת קטן. בדרך כלל, עד שבע הפסגות נצפו ב ואת ABR למבוגרים בעלי חיים (איור 1B).
כדי להפוך את immunostaining הבאים מדידות אלקטרופיזיולוגיות, האוזן הפנימית חולד...

פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי להקליט התגובה גזע המוח של עכברוש לאחר הלידה הגורים. לבחון התפתחות תפקודית של תאים שיער החיצוני, ההליך ניסיוני של קלאמפ תיקון שלם-תא הקלטה בתאים מבודדים שיער החיצוני מתואר צעד אחר צעד.

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

המטרה הכוללת של בדיקה אלקטרופיזיולוגית זו היא לחקור את השינויים המורפולוגיים והתפקודיים של תאי שיער שבלול במהלך ההתפתחות לאחר הלידה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלקת העוזר הקולי, כגון מתי תאי השיער שלנו מקבלים את תפקידיהם במהלך תחילת השמיעה? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו מסוגלים להעריך את תפקודם של תאי שיער בודדים, המבודדים מגורי החולדות שלאחר הלידה.ידגימו את ההליך וונלו פאן, שאשה גואו וננה שו שהיו סטודנטים מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, הניחו את החיה המורדמת בתבנית קצף פוליאתילן כדי לשתק את גוף החיה. לאחר מכן, הניחו את החיה על שולחן נגד רטט בחדר מחליש קול.שמור על טמפרטורת הגוף של החיה על 37.5 מעלות צלזיוס בעזרת כרית חימום. לאחר מכן, נגב את אזור הראש עם 70% אתנול. בצע חתך של מילימטר עד שניים בגחון לרוחב לאפרכסת החיצונית כדי למקם את אלקטרודת הייחוס או האלקטרודה הקרקעית.לאחר מכן, הנח אלקטרודת הקלטה תת-עורית מעל קודקוד הגולגולת. באמצעות מחולל הפונקציות, צור פרצי טון מכוילים בתדרים ובעוצמות שונות. העבירו את גירוי הקול דרך רמקול אלקטרוסטטי הממוקם במרחק של 10 סנטימטרים מראש החיה.כדי להשיג את תגובות גזע המוח השמיעתיות, הפוטנציאלים המעוררים קול מסוננים, מוגברים וממוצעים באמצעות מעבד רב תכליתי. הקלטת ה-ABR בת 40 הדקות מנוטרת באופן מקוון ומאוחסנת לניתוח לא מקוון. בחלק זה יש לעקר את ראש החיה על ידי ריסוס באתנול 70%.לאחר מכן, פתחו את הגולגולת לאורך קו האמצע הסגיטלי בעזרת מספריים והסירו את המוח כדי לחשוף את האוזן הפנימית. לאחר מכן, העבירו את האוזן הפנימית לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר מלאה בשלושה מיליליטר L-15 מדיום קר כקרח. תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, השתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר את הקפסולה הגרמית של השבלול.לאחר מכן, פרקו את ה-OC וה-SV המשויכים ל-modiolus. על ידי החזקת החלק הבסיסי של SV עם מלקחיים, הפרד את OC מ-SV לחלוטין על ידי התפרקות איטית מהבסיס לקודקוד. לאחר מכן, חתוך OC באופן שווה לשלוש חתיכות באמצעות מספריים עדינים.יש לבצע את כל השלבים ב-L-15 קר כקרח במהירות האפשרית על מנת למזער את ההידרדרות וההידרדרות של הרקמות. בשלב זה, בעזרת קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, העבירו את מקטעי ה-OC למגלשת זכוכית. תקן אותם עם 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד למשך ארבע שעות לפחות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, שטפו את הרקמה על ידי עקירת הפרפורמלדהיד עם 100 מיקרוליטר PBS טרי. לאחר מכן, שטפו את הטישו שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. לאחר מכן, דגרו את הרקמה עם חומר חדירות של 0.3% ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר 30 דקות, השליכו את חומר החדירות ושטפו את הרקמה שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, חסום את הרקמה עם סרום עיזים רגיל של 10% ו-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר. דגרו על הרקמה עם נוגדן אנטי-פרסטין C טרמינוס ותמיסת חסימה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.לאחר מכן, שטפו את הטישו שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, דגרו את הרקמה עם נוגדן משני מצומד Alexa 488 בתמיסת חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. שטפו את הטישו שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות בכל פעם בחושך.לאחר מכן, דגרו את הרקמה עם רודמין פלואידין למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. שטפו את הטישו שלוש פעמים עם PBS למשך חמש דקות בחושך. לאחר מכן, הרכיב את הדגימה על מגלשת זכוכית עם מדיום הרכבה.צלם אותו עם מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות לייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו-594 ננומטר. בהליך זה, השתמש בחולץ הפיפטה ובמיקרו-פורגר. הכינו פיפטות תיקון בקוטר קצה של שניים עד שלושה מיקרון.לאחר מכן, מלאו מחדש את הפיפטות בתמיסה תוך-תאית. בעזרת קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, העבירו חתיכת OC לצלחת פטרי של 35 מילימטר. עכל את הרקמה עם 100 מיקרוליטר של מדיום עיכול אנזימטי למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, עקור את מדיום העיכול האנזימטי עם 100 מיקרוליטר L-15. חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות בעזרת מיקרואזמל כדי לבודד את תאי השיער. לאחר פיפטינג עדין, העבירו את התאים לתא פלסטיק קטן תוצרת בית מלא בתמיסת אמבטיה נטולת אנזימים.לאחר מכן, הנח את החדר על הבמה של מיקרוסקופ הפוך ומצא את ה-OHCs הבודדים שנראים בריאים. לאחר מכן, טען את פיפטת התיקון לשלב הראש של מגבר 700B. יש למקם את פיפטת המדבקה סביב החלק התחתון של תא השיער החיצוני.לאחר מכן, תיקון תא שלם מהדק את ה-OHC על ידי איטום הדופן הצדדית של גוף התא. הפעל יניקה קלה עד שקרום התא נקרע. לאחר מכן, הגדר את פוטנציאל ההחזקה על 70 מילי-וולט.תאים עם התנגדות גישה הנעה בין 10 ל-17 מגה-אוהם והתנגדות ממברנה הנעה בין 100 ל-500 מגה-אוהם נחשבים לתצורת תא שלם מוצלחת. הפעל מתח היפרפולריזציה ודפולריזציה על התא כדי לעורר זרמי תא שלמים. מדוד את קיבול הממברנה של OHCs באמצעות פרוטוקול גירוי מתח של שני גלי סינוס הנשלט על ידי תוכנת מהדק התיקון.הגדר את טווח מתח הגירוי בין 140 ל-110 מילי-וולט ואחסן את הנתונים לניתוח לא מקוון. לאחר עיכול עדין, ה-OHCs בודדו מה-OC. הקלטות מהדק מתח תא שלם בוצעו מ-OHCs שבודדו באופן חריף משבלול החולדה. דוגמה מייצגת לכל זרם התא שנרשם מ-P9 OHC מבודד בתגובה לפוטנציאל הממברנה שהשתנה מ-140 ל-107 מילי-וולט מוצגת כאן.איור זה מציג את קיבול הממברנה הלא ליניארי המתקבל משני OHCs בגילאים שונים. תגובות מתח הקיבול הותאמו לפונקציית בולצמן. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים, אם היא מבוצעת כראוי.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע אמצעים אחרים כמו Western Blotting ו-PCR על מנת לענות על שאלות נוספות כגון הערכת רמת הביטוי של חלבון כלשהו, כגון פרסטין בתאי שיער חיצוניים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תאי השיער לחקור תכונות אלקטרופיזיולוגיות בשבלול ובמערכת שיווי המשקל. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לחקור את השינויים המורפולוגיים והתפקודיים של תאי שיער שבלול במהלך ההתפתחות לאחר הלידה.

auditory-brainstem-response-outer-hair-cell-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Whole-cell-clamp תיקון הקלטות של עצב השמיעה דנדריטים סיבים בבית סינפסה סרט פנימי תא שיער שבלול יונקים.

הקלטות Postsynaptic ב דנדריטים מביא פנייה שבלול תאים שיער פנימית: שחרור Multivesicular ניטור ב סינפסה סרט

שיטה אמינה לחקור תא השיער החיצוניים (OHC) תגובות ניעתי, כולל electromotility, תנועתיות איטית כיפוף, הוא תיאר. תנועתיות OHC הוא שהושרו על ידי גירוי חיצוני עם שדה חשמלי לסירוגין, ואת השיטה מנצלת את הקלטת במהירות גבוהה התמונה, מבוססי LED תאורה, הדור האחרון התמונה תוכנת ניתוח.

חקירות תנועתיות החיצונית Cell שיער עם שילוב של גירוי חיצוני לסירוגין שדה חשמלי במהירות גבוהה ניתוח תמונה

מטרת סרטון זה היא להדגים הליכים לקבלת תאי שיער בריאים, ללא פגע מהאיברים הפנימיים של דג זברת האוזן בוגר ולאחר מכן להשתמש בם ללימודים מהדקים תיקון שנועדו לאפיין את מאפייני biophysical של ערוציהם מתח המגודרים.

הקלטות קלאמפ תיקון בתאי שיער באוזן פנימיים מבודדות מדג הזברה

סרטון זה מדגים שיטה להקלטת תגובות גזע המוח השמיעתיות (ABRs) מגורי חולדות. הוא מתאר את השלבים למיקום אלקטרודות, יישום גירוי קול וניתוח עיבוד אותות בגזע המוח כדי להעריך תגובות עצביות.

רישום תגובות שמיעתיות בגזע המוח אצל גור חולדות

סרטון וידאו זה מדגים את ההליך להשתלת מכשיר שבלול בעכבר מחריש והפעלת גירויים חשמליים כדי להקליט תגובות גזע מוח שמיעתיות. הליך זה מאפשר להבין את המנגנונים הבסיסיים של שמיעה חשמלית ויכול לתרום להתקדמות בטכנולוגיית שתל השבלול ובמדעי המוח השמיעתיים.

הקלטת תגובות שמיעתיות חשמליות של גזע המוח בעכבר חירש

סרטון זה מדגים את טכניקת מהדק המדבקה למדידת זרמים יוניים בגופי תאי נוירון חושיים באוזן הפנימית. הוא מפרט את ההכנה והשימוש בפיפטת מהדק טלאי מלוטשת מלאה בתמיסה פנימית המכילה אמפוטריצין B, המנקב את הממברנה כדי לאפשר תנועת יונים תוך שמירה על התנאים התוך-תאיים. פולסי מתח מופעלים כדי להפעיל ולתעד את פעילות תעלת היונים, ומספקים תובנות לגבי תכונותיהם והתנהגותם.

הקלטות מהדק טלאי מחורר של גופי תאי עצב חושיים באוזן הפנימית

סרטון זה מדגים את בחינת עוררות תאי העצב התחושתיים בגרעיני השורש הגבי באמצעות טכניקת מהדק טלאי כדי למדוד את בסיס הריאוס ואת פוטנציאל הממברנה, תוך ניתוח תגובות הנוירונים לזריקות זרם מצטבר.

הקלטות מהדק טלאי של תא שלם על גרעיני שורש גבי חולדה שלמים

כתב יד זה מתאר כיצד להכין גרעיני שורש גב שלמים להקלטות מהדק טלאי. תכשיר זה שומר על המיקרו-סביבה עבור נוירונים ותאי גליה לווייניים, ובכך נמנע מהשינויים הפנוטיפיים והתפקודיים הנראים באמצעות נוירוני DRG מנותקים.

הצמד תיקון הקלטות על Intact השורש הגבי הגרעינים מן חולדות בוגרות

אנו מציגים טכניקה לניהול מקומי של תרופות דרך המסלול טרנס-tympanic לתוך שבלול. משלוח סמים דרך מסלול זה לא להפריע נגד סרטן היעילות של תרופות כימותרפיות כגון ציספלטין.

משלוח סמים טרנס-Tympanic לטיפול Ototoxicity

גזע המוח מעורר תגובה audiometry הוא כלי חשוב נוירופיזיולוגיה קלינית. כיום, גזע המוח התגובה עורר מאומטריה הוא גם מיושם במדע הבסיסי מחקרים טרום קלינית מעורבים הן מודלים תרופתי וגנטי בעלי חיים. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של איך התגובות שמיעתי גזע המוח ניתן להקליט וניתח בהצלחה בעכברים.

רכישת נתונים וניתוח בברטומטריה תגובה מעורר בעכברים

מוצגות כאן שיטות המספקות הוראות מפורטות לניתוח, ניתוק, תרבית ורישום מהדק טלאי מגנגליון שיווי המשקל ונוירוני גנגליון ספירלי באוזן הפנימית.

בידוד וטיפוח סומאטה גנגליון ווסטיבולרי וספירלי ממכרסמים יילודים להקלטות טלאי

למדו את שיטת תיקון הקלאמפ שלם-תא לתאי שיער חיצוניים בחולדות לחקר פיתוח השמיעה. טכניקה זו מאפשרת הערכת תפקוד תאים בודדים ומספקת תובנות לביולוגיה של השבלול ותחילת השמיעה.

גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

גלה סרטונים נוספים