רגישות גבוהה זיהוי של Micrometastases שנוצרו על-ידי Organoids Lentivirus transduced GFP תרבותי מגידול נגזר המטופל הגס

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הגידול לגבי המיקרו-גרורות הנמצאות בחולי סרטן המעי הגס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת זיהוי רגיש ביותר עם מיקרו-גרורות הנגרמות על ידי אורגנואידים של סרטן המעי הגס שמקורם בחולה בעכברים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שיכול להיות קשה לזהות מיקרו-גרורות שמקורן באורגנואידים של גידול המעי הגס באיברים מרוחקים בעכברים.

מי שידגים את ההליך עם יו אוקאזאווה יהיו קוסוקה מיזוקושי ויו קויאמה, שניהם דוקטורנטים ומנתחים מהקבוצה שלי. כדי ליצור אורגנואידים של תאי סרטן המעי הגס האנושיים, הוסף תחילה 150 מיקרוליטר של מטריצה חוץ-תאית מלאכותית לכל באר לצלחת של 12 בארות על קרח. לאחר שכל הבארות מצופות, דגרו את הצלחת למשך 30 עד 60 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 כדי למצק את הג'לים.

לאחר מכן, השעו מחדש גלולת תאי קסנוגרפט של גידול שמקורו בחולה במדיום תרבית אורגנואידים טריים של סרטן המעי הגס בתוספת סרום עגל עוברי של 5%, או FCS, כדי להשיג שלוש פעמים 10 עד חמישה תאים לריכוז מיליליטר, ולזרוע מיליליטר אחד של תאים על כל מטריצה חוץ-תאית מלאכותית. לאחר מכן, החזירו את התאים לחממת תרבית התאים. למחרת בבוקר, העבירו בזהירות את חומרי התרבית, כולל התאים הצפים, לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר לצנטריפוגה שלהם, והשעו מחדש את הכדורים ב-70 מיקרוליטר של מטריצה חוץ-תאית מלאכותית טרייה על קרח.

כדי להגביר את הכדאיות של תאי סרטן המעי הגס, שכבו את תא הגידול הצף המכיל מטריצה חוץ-תאית מלאכותית בחזרה על הבארות המלאכותיות המצופות מטריצה חוץ-תאית, ודגרו את תרביות תאי הגידול למשך 30 דקות בחממת תרביות התאים. כאשר ג'ל המטריצה החוץ-תאי החדש התמצק, האכילו את התרביות במיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים אורגנואידים טריים של סרטן המעי הגס בתוספת 1% FCS, והחזירו את התאים לחממת תרביות התאים. לאחר שבעה עד 10 ימים של תרבית, נתק את האורגנואידים באופן מכני עם מגרד תאים סטרילי, והעביר את האורגנואידים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר לצנטריפוגה שלהם.

לאחר מכן, השעו מחדש את הכדורים ב-500 מיקרוליטר PBS עם הקשה עדינה לצנטריפוגה נוספת. כדי לנתק את האורגנואידים של סרטן המעי הגס, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת אנזים פרוטאוליטי וקולגנוליטי לשפופרות, וערבב עם הקשה עדינה. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, הוסיפו לתאים 500 מיקרוליטר של מדיום בתוספת 1% FBS, והעבירו בעדינות רבה את תרחיף התא מספר פעמים כדי לפרק את האורגנואידים.

פיפטינג עדין של אורגנואידים CRC אנושיים במהלך העיבוד הוא קריטי לשמירה על היווצרות ספרואידים שלמה בתרבית. צנטריפוגה נוספת של התאים, והשעיה מחדש של הכדורים ב-100 מיקרוליטר של מלאי 5X GFP lentivirus ו-400 מיקרוליטר של מדיום תרבית אורגנואיד טרי של סרטן המעי הגס. חיוני להדביק את האורגנואידים האנושיים של CRC בטיטר גבוה של GFP lentivirus, במיוחד כדי להשיג כמעט 100% זיהום של CRC.

התאם את הנפח בכל צינור כדי להשיג חמש פעמים 10 לחמשת תאי הגידול המנותקים לכל 500 מיקרוליטר של ריכוז בינוני, וצלחת 500 מיקרוליטר של תאים לכל באר של צלחת מלאכותית מצופה מטריצה חוץ-תאית של 12 בארות כפי שהודגם. לאחר 18 שעות בחממת תרבית התאים, העבירו את הסופרנטנטים הצפים המכילים תאים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה בודדים של 1.5 מיליליטר לצנטריפוגה, ולאחר מכן השעיה מחדש של הכדורים ב-70 מיקרוליטר של מטריצה חוץ-תאית מלאכותית לכל צינור על קרח. כדי לשפר את כדאיות תאי סרטן המעי הגס, שכבו את המטריצה החוץ-תאית המלאכותית המכילה תאי גידול על האורגנואידים של הגידול בצלחת 12 הבארות, והניחו את הצלחת בחממת תרבית התאים למשך 30 דקות.

כאשר ציפוי המטריצה החוץ-תאית המלאכותית התמצק, האכילו את התרביות במיליליטר אחד של מדיום תרבית אורגנואיד CRC טרי בתוספת 1% FCS, והחזירו את התאים לחממת תרבית התאים למשך שלושה ימים. לאחר מכן, התבונן בתאים הנגועים במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר חיוביות של כמעט 100% GFP, והחזיר את התאים לאינקובטור למשך ארבעה עד שישה ימים נוספים. כדי לבסס מודל עכבר גרורתי ספונטני של קסנוגרפטים של גידול שמקורו בחולה CRC, לנתק את האורגנואידים המסומנים ב-GFP כפי שהודגם, ולדלל את תרחיפי תאי הגידול הבודדים בחמישה פי 10 לחמשת תאי הגידול לכל 50 מיקרוליטר של PBS בתוספת ריכוז מטריצה חוץ-תאית מלאכותית של 50%.

טען 50 מיקרוליטר תאים לכל עכבר למזרק המצויד במחט בגודל 22, והנח את תאי הגידול על קרח. לאחר מכן, יש לאשר חוסר תגובה לצביטה בבוהן, ולהניח את עכבר ה-NOG המורדם הראשון במצב שכיבה על ספסל המעבדה. בעזרת פינצטה סטרילית, משוך בעדינות את רירית פי הטבעת מפי הטבעת, והזריק מיד את תאי הגידול לתת-רירית פי הטבעת.

כדי לבסס מודל גרורות ניסיוני של השתלות גידול שמקורן בחולי CRC, יש לדלל את תרחיפי תאי הגידול הבודדים בארבע פעמים 10 לארבעת התאים לריכוז של 50 מיקרוליטר, ולהעמיס 50 מיקרוליטר תאים לכל עכבר למזרק המצויד במחט בגודל 22. הניחו את עכבר ה-NOG המורדם הראשון במצב שכיבה על הספסל, ובצעו חתך קטן באזור התחתון של האגף השמאלי. השתמש במספריים ובפינצטה סטריליות כדי לחתוך בזהירות את הצפק ולחשוף את הטחול, והשתמש בפינצטה כדי לתפוס את השומן המחובר לטחול.

לאחר מכן, יש להזריק לאט 50 מיקרוליטר מתרחיף תאי הגידול לטחול, תוך הקפדה שלא תיצפה דליפה. לאחר שכל העכברים הוזרקו ותפרו לפי הצורך, החזירו את בעלי החיים לכלובי הבית שלהם, ובדקו אם יש דליפת תפרים וכדאיות יום לאחר מסירת תאי הגידול. השתמש במחוגה כדי למדוד את הגידולים מדי שבוע, וקצור את הגידולים הראשוניים והרקמות הרלוונטיות עד לנקודות הקצה הניסיוניות המתאימות.

העבירו את הגידולים והאיברים המנותחים לחמישה מיליליטר של PBS קר כקרח בצלחת פטרי של 10 סנטימטר על קרח, והתבוננו ברקמות המנותחות תחת מיקרוסקופ סטריאו-פלואורסצנטי כדי להעריך את ביטוי ה-GFP שלהן. זיהום אורגנואיד CRC עם GFP lentivirus, כפי שהודגם, מביא כמעט לכל האורגנואידים המבטאים GFP בהיר מאוד. הזרקה אורתוטופית ותוך טחולית של האורגנואידים המסומנים ב-GFP לעכברי NOG מושתלים משניים חושפת היווצרות של גידולים ראשוניים חיוביים ל-GFP באתר האורתוטופי, כמו גם בריאות של רוב העכברים שנבדקו 2.5 חודשים לאחר ההזרקה.

יתר על כן, גרורות בכבד נצפות בבעלי חיים מקבלי NOG חודש לאחר הזרקה תוך טחולית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות מיקרו-גרורות של אורגנואידים של תאי סרטן המעי הגס האנושיים המסומנים ב-GFP לאחר החדרתם לעכברים מקבלים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שיעילות ביות הגידול והגרורות של אורגנואידים של תאי סרטן המעי הגס האנושיים בעכברים תלויה במידה רבה בשונות הבין-מטופלית של תאי הגידול המקוריים.