Name: פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: למדו שיטת התמרה לנטיווירוסית באורגנואידים של אפיתל מעיי עכברים לצורך חקר ביולוגיה מעייתית. הפרוטוקול כולל ייצור חלקיקים ויראליים, טיפול בגורמי גדילה וניתוח במורד הזרם באמצעות RT-PCR ואימונוהיסטוכימיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J. Heijmans נתמך על ידי מלגה מהקרן ההולנדית לסרטן (KFW). G.R. van den Brink נתמך על ידי מימון ממועצת המחקר האירופית במסגרת תוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7/2007-2013)/הסכם מענק מספר 241344 של מועצת המחקר האירופית ועל ידי מענק VIDI מהארגון ההולנדי למחקר מדעי (GvdB).

1. הכנת Polyethylenimine (PEI) כTransfection מגיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר כ -150 מ&quot;ג של PEI לשל H 2 O. 100 מיליליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם פתרון לpH 7.4 ידי הוספת HCl עד פתרון הופך ברור ומערבבים עד שהיא נמס לחלוטין. פעולה זו עשויה להימשך בין 10 ל 60 דקות ומוסיפה מים עד לריכוז סוף 1 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ברור, לסנן את פתרון PEI דרך מסנן 0.22 מיקרומטר סטרילי וחנות במקפיא -80 מעלות צלזיוס בaliquots של 5 מיליליטר. </li></ol> 2. ייצור lentiviral החלקיקים יום 1: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תאי HEK293T 60% confluency -80% בבקבוק 162 סנטימטר 2 או צלחת פטרי גדולה במדיום תרבות שורת תאים (DMEM בתוספת 10% FCS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ותוספת גלוטמין 2 מ&quot;מ). </li></ol> יום 2: <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון transfection DNA המכיל 45 מיקרוגרם בסך הכל DNA פלסמיד על ידי הוספה ביחדוקטורי lentiviral אריזה (7 מיקרוגרם של pVSVg; 5 מיקרוגרם של rev pRSV; 13 מיקרוגרם של pMDL) ו -20 מיקרוגרם של פלסמיד lentiviral קידוד הגן של עניין או shRNA של עניין. התאם לנפח של 1 מיליליטר באמצעות DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון transfection PEI על ידי הוספת 90 μl של 1 מ&quot;ג / מיליליטר PEI לμl 930 של DMEM ודגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון transfection DNA לפתרון PEI. מערבולת או להפוך מספר הפעמים ודגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר כדי להשיג פתרון transfection DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפטף 2 מיליליטר של פתרון transfection DNA על גבי תאי HEK293T ודגירה של 4 שעות בתרבית תאי חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות, לרענן את מדיום התרבות להסיר PEI. אין צורך לשטוף את התאים לפני הוספת מדיום חדש. הערה: PEI הוא פעמים ציטוטוקסיות ודגירה ארוכות יותר מ -4 שעות עלולות לגרום נזק לתאי HEK293T. </li></ol> יום 4: <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף Supernatant עם מדיום התרבות חדש. שמור supernatant (המכיל וירוס); זה ישמש בשלב 2.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים supernatant ב -15 בקבוק מיליליטר. כדי להסיר תאים מתים, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף supernatant באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר באמצעות מזרק 60 מיליליטר גדול. אחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> יום 5: <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את המנה השנייה של supernatant; צנטריפוגה ומסנן כמו בשלבים 2.8-2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת supernatants מצעדי 2.9 ו2.10 בצינורות ultracentrifuge ו צנטריפוגות ב 50,000 XG בultracentrifuge למשך 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את כמוסות המכילות את צינורות ultracentrifuge מאוד בזהירות והכניס לתוך הזרימה למינרית, לזכור את הכיוון של הצינור בתוך צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמוסה פתוחה מחזיקה צינור ultracentrifuge ובינוני למזוג בזהירות באופן כזה שהגלולה היא בצד העליון של הצינור. מאז כדורים נגיפיים עלולים להיות קשים לדמיין, לזכור על מההצד של צינור גלולה תהיה יצרה. קח micropipette ולהסיר אחרון קצת בינוני תוך הקפדה שלא כדי להתסיס את הגושים חומים האטומים כי הוא גלוי בצד של החלק התחתון של צינור ultracentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה זו ב500 μl של מדיום תרבות organoid בתוספת 10 nicotinamide מ&quot;מ, 10 מיקרומטר Chir99021, 10 מיקרומטר Y27632 ו8 מיקרוגרם / מיליליטר polybrene. Resuspension במדיום הזה הוא חשוב שכן וירוס גבוה כייל משמש לtransduct organoids ישירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין: להקפיא את הווירוס במדיום זה aliquoted בשתי קבוצות של 250 μl ב-80 ° C. </li></ol> 3. lentiviral התמרה של Organoids יום 0: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול 0.95 סנטימטר 2 גם מלא organoids יומיים לפני התמרה לבאר חדשה, במטרה להשיג כ -50 organoids הקטן. פיצול organoids על פי פרוטוקול שפורסם בעבר 1 (איור 3 א &#39;, ב&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים organoid מדיום תרבות עם 10 מיקרומטר Chir99021 ו -10 nicotinamide מ&quot;מ להשיג מאורות היפר פיברוזיס שגשוג (איור 3 ג). הערה: מאורות Cystic יפתחו הטובים ביותר כאשר organoids טרי לפצל גדלים בנוכחות Chir99021. </li></ol> יום 2: <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> organoids קציר על ידי pipetting מעלה ומטה matrigel והבינוני, ובכך לשבש את התערובת עם micropipette p1000. מניחים את התערובת בשפופרת 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש נוסף באמצעות pipet פסטר שבפתיחת דיסטלי כבר ירד ב נמס. organoids צנטריפוגה לגלולה במשך 5 דקות ב 100 x גרם. הערה: תלוי בגודל של צנטריפוגות, להשתמש במהירות צנטריפוגות שונה. זה הכרחי כדי למצוא את המהירות המדויקת שבו שיבש organoids מופרדים מהתערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף 500 μl של טריפסין 1x מראש חימם (בדומה לטריפסין 0.25%). Resuspend organoids בטריפסין ודגירה3 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית טריפסין ידי הוספת 3.5 מיליליטר של מדיום תרבות שורת התאים (DMEM בתוספת 10% FCS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין וגלוטמין). צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant לעזוב גלולה בכ -20 μl של מדיום. העבר את organoids בכמות קטנה האחרונה של מדיום לתוך באר בצלחת 48-בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף lentivirus כייל גבוה במדיום התמרה כמתואר בשלב 2.14, resuspend והמשך לשלב 3.10. כאשר נתקל ביעילות התמרה נמוכה, צעד 3.9 ניתן להוסיף. הערה: לתמרה יעילה, בדרך כלל להוסיף aliquot אחד של 250 μl של lentivirus כייל הגבוה ולאחת מorganoids. זה מייצג 50% מכל lentivirus שנקטפו מייצור יחיד כמתואר בשלב 2 של פרוטוקול זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין: כדי לשפר את יעילות התמרה, לבצע spinoculation על ידי הצבת 48 organoids הצלחת המכילה גם בצנטריפוגה מראש חיממה על 326; C ולסובב ב 600 XG במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים תערובת organoid-וירוס בתרבות חממת דגירה עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בחממה תרבות כדי לאפשר התמרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין: כדי לשפר עוד יותר את יעילות התמרה, דגירה organoids במשך 3 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס בחממה תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מדיום תרבות organoid וresuspend תערובת organoid-הווירוס, להעביר לתוך צינור microcentrifuge ו צנטריפוגות בmicrocentrifuge למשך 5 דקות ב 850 XG כדי גלולה organoids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב -20 μl של matrigel קר כקרח. מכיוון שהחומר מתמצק כאשר הוא הופך להיות חם יותר, להשתמש בטיפי פיפטה המקוררים על ידי pipetting מעלה ומטה קרח הקר PBS למספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים הטיפה באמצע גם בצלחת 48 בארות דגירה בחממת תרבות על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 15 דקות, בזהירות להוסיף 250 μl של מדיום תרבות organoid בתוספת10 nicotinamide מ&quot;מ, 10 מיקרומטר Chir99021 ו -10 מיקרומטר Y27632. שברי organoid שיבשו קטנים יהוו לorganoids פיברוזיס הקטן בתוך 24 שעות. </li></ol> יום 5: <ol start="16" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן בינוני ולהשלים עם אנטיביוטיקה בחירה (לpuromycin, להשתמש 4 מיקרוגרם / מיליליטר). </li></ol> יום 7: <ol start="17" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני למדיום תרבות organoid הסטנדרטי, בתוספת אנטיביוטיקה בחירה. הערה: הניצנים יהיו שלמים 2-3 שבועות לאחר נסיגת Chir99021. לאחר בחירה, organoids עשוי להיות מבוגר ללא אנטיביוטיקה בחירה. </li></ol> 4. Organoid RNA הכנה לכמותי RT-PCR או Microarray <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת RNA, השתמש בערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. הוצא את המדיה מorganoids ולהוסיף 350 μl של RLT חיץ, בתוספת β-mercaptoethanol ישר על כיפת organoids matrigel מכיל. Resuspend materiאל בRLT ידי pipetting באמצעות micropipette p1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את הכנות RNA נוספות על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין: להגדיל את תשואת RNA על ידי הגברה שימוש במערכת Ovation הפיק WTA, הדורשים השקעה ראשונית של 50 מיקרוגרם RNA הכולל על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין: לבקרת איכות לפני microarray RNA, דגימות מנוהלות על Bioanalyzer 2100 באמצעות שבב ננו RNA eukaryote כולל, מכוון למספר שלמות RNA (רין) של 8.5 או יותר (איור 5) על פי הפרוטוקול של היצרן. </li></ol> 5. Organoids העיבוד לפרפין הטבעה ואימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת organoid הטבעה מראש לחמם בלוק אלומיניום עם חורים בקוטר צינורות זכוכית מתאימים 12 מ&quot;מ באינקובטור ב 70 ° C כדי לשמור על נוזל פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח גם אחת עם organoids מלא גדל ולהסיר את המדיום, ומשאיר את organoids המשובץ בשלמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטרשל paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS ישר לטוב ולתקן על 4 מעלות צלזיוס בכל מקום בין שעות 1 עד הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף paraformaldehyde עם 1 מיליליטר של PBS הקר כקרח. לחלופין: לשמור organoids הקבוע בPBS עד השבוע 1 על 4 מעלות צלזיוס לאחר שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend organoids הקבוע ב 1 מיליליטר של PBS ומקום לתוך בקבוקון זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בוא organoids לשקוע לתחתית דקות 1, למזוג PBS ולהחליף עם 70% אתנול שבכמה טיפות של תמיסת eosin הם מומסים על מנת לאפשר להדמיה של organoids לאורך כל תהליך ההטבעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר organoids באתנול 70% בטמפרטורת חדר. לאחר 30 דקות, להסיר את אתנול 70% באמצעות אחסון בזהירות, להיות מסוגל לדמיין organoids לפי העין בגלל צבע ורדרד eosin קל. החלף פתרון הטבעה עם 96% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 5.7, בכל פעם שמחליפה את פתרון ההטבעה עם הבא. עובר דרך organoids את הפתרונות הבאים לאחר מכן: 70% אתנול, 90% אתנול, 96% אתנול, etha 100%נול, אתנול 100%, קסילן, קסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג לשטוף קסילן האחרון ולשפוך נפט לצינור. שים את הצינור מייד בבלוק האלומיניום מראש חימם על 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולהחליף פרפין עם פרפין הנקי החדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים organoids פרפין את וpipet לתוך תבנית בלוק פרפין באמצעות pipet פסטר מראש חימם עם פתח גדול. להתחמם pipet פסטר באמצעות מבער בונזן. מניחים את כל organoids בעובש בלוק פרפין בשכבה קטנה של פרפין הנוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עד כמה שניתן, מנסה לתפעל את כל organoids לכיוון המרכז של עובש בלוק פרפין באמצעות מחט לנתיחה חיממה. להתחמם מחט לנתיחה באמצעות מבער בונזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הלוקליזציה של organoids בעובש היא משביעת רצון, עובש צינה מעט כדי לחזק את שכבת הנפט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את הבלוק על ידי שפיכה יותר פרפין על גבי ולהוסיף הטבעת קלטת היסטולוגית סטנדרטית. </li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+on+cell+proliferation+of+the+gastrointestinal+mucosa+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+B%2C+Cell+Pathology+Including+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin1%2C+a+novel+intestinotrophic+mitogen%2C+ameliorates+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+transgenic+epithelial+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC transgenic epithelial organoids.</a> PLoS One. 8 (10), e76871(2013).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li>
<li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li>
<li>Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+murine+leukemia+virus+DNA+depends+on+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.</a> The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).</li>
<li>Bahnson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+enhancement+of+retroviral+mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer.</a> Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול הווידאו הנוכחי מתאר התמרה lentiviral של organoids מאפיתל במעי ראשוני וניתוח במורד הזרם של organoids אלה תוך שימוש בטכניקות RNA כמותי ואימונוהיסטוכימיה. התמרה lentiviral מבוצעת לעתים קרובות בתאים חסיד או צפים בצלחות תרבות. מכיוון שהמבנה התל-ממדי של organoids הופך אותם קשה לחדור ידי חלקיקים נגיפיים, במספר השיטות כדי להגדיל את היעילות בשימוש. טיפול מקדים של organoids באמצעות Chir99021 מגדיל התפשטות ובכך כדא...

אפיתל במעי הוא אחד מרקמות הגוף במהירות הרבה ביותר מתרבות, אשר גרמו לו למשוך עניין רחב ממחקר על תאי סרטן וגזע. בשינה 2009 פורסמה טכניקה ליצירת תרבויות לאורך זמן של מאורות מעי דקים בmatrigel, שימור מבנה ממדי 3 1. מבנים אלה, קרוי organoids מעיים, יכול להיות מתורבת באמצעות טכניקות סטנדרטיים, עם סובבים בתוספת בינונית עם מספר גורמי צמיחה מוגדרים, כולל הגולגולת של מעכב מסלול BMP-איתות (קולב), משפר מסלול Wnt-איתות rspondin 1 (Rspo1) ו גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) כל מצא כדי לשפר את התפשטות מעיים 2-4. Organoids לעלות שורות תאי הסרטן מסורתיות בהיבטים שהם-מוטציה שאינן, יש לשמור על היררכיה בתאי גזע, להציג קיטוב סלולארי ללא פגע ובידול תערוכה לכל תא השושלות שנמצאו בint הקטן המתהווהאפיתל estinal. שכן הם יכולים להיות transduced לבצע transgenes או התערבות RNA בונה 5, הם משמשים ללמוד אלמנטים גנטיים ספציפיים, להכריע ניסויים באמצעות עכברים הטרנסגניים בהיבטים של עלות ומהירות. ביטוי מהונדס בorganoids יכול להתבצע גם באמצעות retroviral העכברית או וקטורי lentiviral 6,7. בשל המגבלות של רטרווירוסים עכבריים, מסוגלים transducing תאי mitotic באופן בלעדי 8, התמרה lentiviral היא בתדירות גבוהה יותר בשימוש בתאים שקשה להדביק, כגון organoids. באופן ויראלי transduced וorganoids המהונדס ביציבות להביע יכול לשמש למספר רב של ניתוחים במורד הזרם, כולל RNA ניתוחים כמותיים ואימונוהיסטוכימיה. יחדיו, התרבות של organoids מתאי אפיתל במעי עיקרי התפתחה טכניקה שגרתית שהיא קל ליישום ללא דרישות מעבדה ספציפיות, והפכה לסטנדרט ברומן ceתרבות ll במחקר על אפיתל במעי. טכניקות של התמרה ויראלית וניתוח במורד הזרם שלאחר מכן בorganoids הן מייגע לבצע ולסייע לניסויי organoid נוצר פרוטוקול וידאו זה, המציג שיטות לתמרת lentiviral של organoids התרבותי. אנחנו בנוסף להראות כיצד נכונים עיבוד של organoids יכול להגדיל את התשואה ולכן לשפר את הביצועים של ניתוח במורד הזרם תוך שימוש בטכניקות RNA או אימונוהיסטוכימיה. בפרוטוקול, organoids שנגזרים ממאורות מעיים קטנים שימש באופן בלעדי, למרות שהטכניקות המתוארות ניתן להחיל organoids מעי הגס גם כן.

<table><tbody><tr><td>פוליאתילן imine</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM בינוני</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמין</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>מטריג'ל</td><td>BD</td><td>BD 356231</td><td></td></tr><tr><td>מתקדם DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטיל ציסטאין</td><td>סיגמא</td><td>A9165-1G</td><td></td></tr><tr><td>עכבר Egf</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8045</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>glutamax 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Y27632&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>פוליברן</td><td>סיגמא</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>ניקוטינאמיד</td><td>סיגמא</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>לונזה</td><td>BE02-007E</td><td></td></tr><tr><td>פורומיצין</td><td>סיגמא</td><td>P 7255</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy מיני קיט</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-מרקפטואתנול</td><td>Merck</td><td>8,057,400,250</td><td></td></tr><tr><td>מערכת Ovation Pico WTA</td><td>NuGen</td><td>3300-12</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון זכוכית חרוטי 12&nbsp; מ"מ x 75&nbsp; מ"מ 5&nbsp; מ"ל</td><td>VWR</td><td>LSUKM12</td><td></td></tr><tr><td>Eosin צהבהב</td><td>VWR</td><td>1,159,350,025</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים organoids

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

מבני קריפטה-וילוס במעי המכונים אורגנואידים, יכולים להישמר בתרבית מתמשכת באופן תלת מימדי כאשר משלימים אותם עם גורמי הגדילה המתאימים. מכיוון שאורגנואידים דומים מאוד לרקמה המקורית מבחינת התמיינות תאי גזע הומאוסטטיים, קוטביות התאים ונוכחותם של כל סוגי התאים המובחנים הסופניים הידועים לאפיתל המעי הבוגר, הם משמשים כמשאב חיוני במחקר ניסיוני על האפיתל. האפשרות לבטא טרנסגנים או להפריע ל-RNA באמצעות וקטורים לנטי-ויראלים או רטרו-ויראלים באורגנואידים הגדילה את ההזדמנויות לניתוח פונקציונלי של אפיתל המעי ותאי הגזע של המעי, ועלתה על טרנסגניקה מסורתית של עכברים במהירות ובעלות. בפרוטוקול הווידאו הנוכחי אנו מראים כיצד להשתמש בהתמרה של אורגנואידים במעי הדק עם וקטורים לנטי-ויראליים המומחשים על ידי שימוש בטרנסגנים הניתנים להשראת דוקסיצילין, או RNA סיכת ראש קצרה הניתנת להשראת IPTG לביטוי יתר או הפלת גנים. יתר על כן, בהתחשב בתרבית אורגנואידים מניבה ספירת תאים זעירה שעשויה אפילו להיות מופחתת על ידי טיפול ניסיוני, אנו מסבירים כיצד לעבד אורגנואידים לניתוח במורד הזרם המכוון ל-RT-PCR, RNA-microarray ואימונוהיסטוכימיה כמותית. טכניקות המאפשרות ביטוי טרנסגנים והפלת גנים באורגנואידים במעי תורמות לפוטנציאל המחקרי שמבני אפיתל מעיים אלה מחזיקים, ומבססים תרבית אורגנואידים כסטנדרט חדש בתרבית תאים.

התמרה lentiviral Organoid הטכניקה של התמרה organoid באמצעות חלקיקי lentiviral תלוי בטיפול הנכון בorganoids לפני ובמהלך התמרה. Organoids (איור 3 א) היו בתרבית והם שובשו למאורות יחידים (איור 3). כפי שדווח בעבר, מאורות יחידים אלה, כאשר בתרבית בנוכחות מעכב GSK3 Chir99021 הפכו מאורות פיברוזיס 9 (איור 3 ג). בהמשך לכך organoids היו trypsinized כדי לא...

בפרוטוקול וידאו זה אנו נותנים הסבר שלב אחר שלב על התמרה לנטי-ויראלית באורגנואידים של אפיתל המעי הראשוני ועל עיבוד וניתוח במורד הזרם של תרביות אלה על ידי RT-PCR כמותית, מיקרו-מערך RNA ואימונוהיסטוכימיה.

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לייצר אורגנואידים שעברו טרנסדוקציה יציבה מאפיתל מעי ראשוני של עכבר, לצורך ניתוח המשכי של אורגנואידים של המעי. דבר זה מושג תחילה על ידי טרנספקציה של תאי HEC 2 93 T עם וקטורים לאריזה לנטיויריסטית ופלסמיד לנטיויריסטי, המקודדים את הגן הרצוי, כדי להפיק חלקיקים לנטיויריסטיים בתיתר גבוה. השלב השני הוא טיפול מקדיים של אורגנואידים של מעי עכבר בתרבית באמצעות מספר גורמי גדילה, כדי להשיג קריפטות ציסטיות היפר-פרוליפרטיביות.בשלב הבא, בצע טרנסדוקציה לאורגנואידים באמצעות הלנטי-וירוס בריכוז גבוה והדגר את האורגנואידים שעברו טרנסדוקציה במטרי-ג'ל (matrigel). השלב הסופי הוא הטמעת אורגנואידים שעברו טרנסדוקציה והגיעו לגודלם המלא בפרפין לצורך ניתוח אימונוהיסטוכימי בהמשך. בסופו של דבר, טרנסדוקציה לנטי-ויראלית של אורגנואידים משמשת ליצירת שינויים גנטיים במודל in vitro של אפיתל המעי, שהוא אמין, הדיר ומהיר.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שורות תאי סרטן, הוא שאורגנואידים מהווים היררכיה של תאי גזע מושתלים שאינם מוטפים. בהקשר של קיטוב תאי, הם יכולים להבדיל את עצמם לכל סוגי התאים השונים של אפיתל המעי הדק. בנוסף, ניתן להשתמש באורגנואידים שעברו טרנסדוקציה כדי לחקור אלמנטים גנטיים ספציפיים, ובכך להעדיף אותם על פני שימוש בעכברים טרנסגניים מבחינת עלות ומהירות.ייצור חלקיקים לנטיביריים הוא פרוטוקול בן חמישה ימים המתחיל בפיצול תאי HEC 2 93 T ל-60% עד 80% התכנסות (confluency) בבקבוק של 162 סמ"ר במצע לתרבית תאים. יש לדגור את התאים למשך הלילה באינקובטור לח לתרבית תאים בטמפרטורה של 37 °C. ביום למחרת, הכין את תמיסת הטרנספקציה של ה-DNA ואת תמיסת הטרנספקציה של הפוליאתילן אימין או PEI כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול.הוסיפו את תמיסת הטרנספקציה של ה-DNA לתמיסת ה-PEI, ערבבו במכשיר וורטקס או הפכו את המבחנה מספר פעמים, והדגירו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. טפטפו 2 mL מתמיסת ה-DNA TRANSFECTION וה-PEI על תאי ה-HEC 2 93 T והדגירו למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 °C.רעננו את מצע הגידול. כדי להסיר את ה-PEI, דגרו את התאים למשך יומיים ב-37 °C. ביום הרביעי, אספו את העלייה (supernatant) לשפופרת של 50 ml. הוסיפו מצע גידול חדש לתאים והחזירו את הבקבוק לאינקובטור. סבבו את העלייה שנאספה בצנטריפוגה ב-500 Gs למשך חמש דקות.להסרת תאים מתים, השתמש במזרק גדול של 60 milliliter כדי לדחוף את ה-SUPERNAT דרך מסנן של 0.45 micrometer. אחסן את הנוזל העליון המסונן למשך לילה בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius. ביום למחרת, אסוף, סבב בצנטריפוגה וסנן את המנה השנייה של הנוזל העליון כפי שהודגם עבור המנה הראשונה.אגדו את שתי מנות הנוזל העליון (supernatant) למבחנות אולטרה-צנטריפוגה. סבבו בצנטריפוגה ב-50,000 GS למשך 90 דקות. עם סיום הסבוב, הוציאו בזהירות רבה את התאיים המכילים את מבחנות האולטרה-צנטריפוגה והניחו אותם במכסה זרימה למינרית.פתחו את הקפסולה המחזיקה את מבחנת העל-צנטריפוגה ושפכו בזהירות את המצע, כאשר המשקע נמצא בצדו העליון של המבחנה. חשוב לזכור באיזה צד של המבחנה נוצר המשקע, שכן ייתכן שיהיה קשה להבחין במשקעי נגיפים. לאחר מכן, השתמשו במיקרו-פיפט כדי להסיר את שאריות המצע, תוך הקפדה לא לערבב את המשקע החום העכור הנראה בצד התחתון של מבחנת העל-צנטריפוגה.יש להשעות מחדש משקע זה ב-500 microliters של תווך תרבית אורגנואידים, המועשר במעכבי nicotinamide kinase וב-poly brain resus. השעיה בתווך זה היא חשובה כיוון שנגיף בריכוז גבוה (high titer) ישמש ישירות לטרנסדוקציה של האורגנואידים יומיים לפני הטרנסדוקציה. יש להעביר אורגנואידים מתוך באר מלאה בשטח של 0.95 square centimeter לבאר חדשה בלוח של 48 בארות.בהתאם לפרוטוקול שפורסם בעבר. המטרה היא להשיג כ-50 אורגנואידים קטנים בתרבית אורגנואידים. מצע המורכב מתוספת של מעכב glycogen synthase kinase וניקוטינאמיד.כדי לקבל קריפטות ציסטיות היפר-פרוליפרטיביות, דגרו את האורגנואידים למשך יומיים. ביום הטרנסדוקציה, אספו את האורגנואידים באמצעות מיקרו-פיפט P 1000. ביצעו פיפטינג של ה-matrigel והתווך מעלה ומטה, ובכך פצלו את התערובת.העבר את התערובת למבחנה של 15 מיליליטר. המשך בפירוק התערובת באמצעות פיפטה שבה הפתח הדיסטלי הוקטן על ידי המסה. השג תרחיף של האורגנואידים על ידי סרכזגוגה ב-100 Gs למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את הנוזל העליון, הוסף 500 מיקרוליטר של 1x trypsin שחומם מראש, השהה את האורגנואידים בתרחיף והדגר למשך שלוש דקות.במקלחת מים בטמפרטורה של 37 °C, השבתו את ה-trypsin על ידי הוספת 3.5 milliliters של מדיום תרבית לקו התאים, וסבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-500 Gs. הסירו את supernatant כך שיישאר המשקע בערך ב-20 microliters של מדיום. העבירו את האורגנואידים יחד עם כמות קטנה זו של מדיום אל תוך באר.בפלטה בעלת 48 בארות, הוסף את הלנטי-וירוס בריכוז גבוה שהוכן מראש בתווך טרנסדוקציה לאורגנואידים וערבב להומוגניזציה. הדגר את תערובת האורגנואידים והווירוס למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור תרבית. לאחר שעה, הוסף מיליליטר אחד של תווך תרבית לאורגנואידים לתערובת האורגנואידים והווירוס, ערבב להומוגניזציה, והעבר את התערובת למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה. צנטריפוגה במהירות 850 ×g למשך חמש דקות.כדי לשקע את האורגנוידים, הסיר את הנוזל העליון ותלה את המשקע. ב-20 µL של matrigel קר מאוד, הנח את הטיפה במרכז הבאר. בצלחת 48 בארות, הדגר ב-37 °C למשך 15 דקות.כדי שהטיפה תתמצק לאחר 15 דקות, הוסיפו בזהירות 250 µL של מצע גידול לאורגנואידים, המועשר בניקוטינמיד ובמעכבי קינאז.חממו מראש בלוק אלומיניום באינקובטור בטמפרטורה של 70 °C כדי לשמור על הפרפין במצב נוזלי. הסירו את המצע מבאר בודדת המכילה אורגנואידים בוגרים, תוך השארת האורגנואידים המוטמעים ללא פגע, והוסיפו 1 mL של 4% Paraformaldehyde ב-PBS ישירות לבאר. החליפו את ה-Paraformaldehyde ב-1 mL של PBS.שחזר את האורגנואידים המקובעים ב-PBS והעבר אותם לבקבוק זכוכית. המתן דקה עד שהאורגנואידים ישקעו לתחתית. לאחר מכן, שאב החוצה את ה-PBS והחלף אותו ב-70% ethanol שבו מומסו מספר טיפות של תמיסת eoin.כדי לאפשר ויזואליזציה של האורגנואידים לאורך תהליך ההטמעה, השאירו את האורגנואידים ב-70% ethanol בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הסירו את ה-70% ethanol באמצעות פיפטה בזהירות. ניתן לראות את האורגנואידים בעין בשל צבע ה-eoin הוורוד.החליפו את תמיסת הקיבוע ב-96% ethanol והשאירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות באופן זה. לאחר מכן, העבירו את האורגנואידים דרך 70% ethanol, 90% ethanol, 96% ethanol, 100% ethanol, 100% ethanol, xylene ו-xylene. שפכו את שטיפת ה-xylene האחרונה ומזגו פאראפין לתוך מבחנה הזכוכית.העבירו מיד את הבקבוקון לבלוק אלומיניום שחומם מראש ל-70 °C למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, החליפו את הפרפין בפרפין נקי חדש באמצעות פיפטה או PE שחוממו מראש. שפכו את הפרפין החוצה והשתמשו בפיפטה עם פיה רחבה שחוממה מראש כדי להעביר את האורגנואידים לתבנית בלוק הפרפין, אל תוך שכבה של פרפין נוזלי.חממו מחט דיסקציה באמצעות מבער בונסן והזיזו את כל האורגנואידים ככל האפשר לכיוון מרכז תבנית בלוק הפרפין. כאשר מיקום האורגנואידים בתבנית מספק, קררו את התבנית מעט כדי להקשות את שכבת הפרפין. השלימו את הבלוק על ידי מזיגת פרפין נוסף מעל והוסיפו קסאט הטמעה היסטולוגית סטנדרטית.בפרוטוקול זה, אורגנואידים של אפיתלל המעי עברו טרנסדוקציה באמצעות לנטי-וירוסים. אורגנואידים תקינים גדלים כמבני קריפטה-וילוס (crypt-villous) עם מספר קריפטות היוצאות מדומיין וילוס משותף. לאחר טיפול של אורגנואידים אלו במעכב GSK-3β, שהו CHIR 99021, השגשוג עולה והקריפטות הופכות לציסטיות לאחר טרנסדוקציית האורגנואידים.בשימוש בביטוי יתר של EGFP באמצעות לנטי-וירוס, האורגנואידים מבטאים פלואורסצנציית EGFP. שלבים להגברת יעילות הטרנסדוקציה, שניתן לבצע כאשר יעילות הטרנסדוקציה נמוכה, כגון הזרקה (inoculation) או דגירה ויראלית ממושכת, אינם נדרשים, שכן שלבים אלו לא יעלו את היעילות הגבוהה כבר כעת. לאחר מכן, אורגנואידים אלו מעובדים עבור טכניקות RNA ואימונוהיסטוכימיה. תמונה מייצגת זו היא חתך של אורגנואיד מעי של עכבר, שנצבע עבור BRDU לאחר דגירה עם BRDU למשך שעה אחת לפני הקיבוע.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן התעתוק של אורגנואידים מאפיתל מעי ראשוני באמצעות חלקיקים לנטיביריים או רטרוביריים.

a-protocol-for-lentiviral-transduction-downstream-analysis-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

פרוטוקול זה מסביר תרבות העיקרית Lgr5-positve organoid והביצועים הבאים של התמרה retroviral. זה מאפשר ביטוי יתר או מציאה Cre-מושרה של transgene נמסר ומאפשר מחקרים פונקציונליים להתבצע ברומן בorganotypic המבחנה   מערכת מודל.

פרוטוקול וידאו של זיהום retroviral ביסודי מעיים Organoid תרבות

תא צורב מעיים תרבויות הוקם מתוך כל כוכים, ואינם מאפשרים הניתוח של התחדשות עצמית ובידול באופן ספציפי תא. פרוטוקול זה מתאר הכינון של גזע ממוינת (Lgr5+), נישה (Paneth) תאים, אשר להצמיח organoids תוך מתן אפשרות שינוי הביוכימי, גנטית מוקדמת שלהם, אנליזה פונקציונלית.

וזמינותו שיחזור תא צורב (אורה) לניתוח פונקציונלי של מעיים גזע ותאים נישה

אנו מתארים הוראות צעד אחר צעד ל: 1) ביעילות מהנדס מעיים אורגנואידים באמצעות ננו חלקיקים מגנטיים עבור התמרה-או כפוף, ו, 2) ליצור קטעים קפואים מן הנדסה ארגונית. גישה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לשנות ביעילות ביטוי גנים באורגנואידים לחקירת השפעות במורד הזרם.

הנדסה גנטית של מעיים עכבר ראשי אורגנואידים באמצעות מגנטית ננו-חלקיק התמרה וקטורים ויראלי עבור הקפאת שימוש

פרוטוקול זה מתאר כיצד להדביק organoids מעיים אנושיים מהצד apical או basolateral שלהם כדי לאפיין אינטראקציות מארח / פתוגן ברמת תא יחיד באמצעות טכנולוגיית רצף RNA של תא יחיד (scRNAseq).

התאמת Organoids במערכת העיכול עבור זיהום פתוגן ורצף תא יחיד תחת בטיחות ביולוגית רמה 3 (BSL-3) תנאים

פרוטוקול זה מציע הוראות מפורטות לביסוס אורגנואידים של המעי הדק של מורין, בידוד תאי לימפואידים מולדים מסוג 1 מהלמינה פרופריה של המעי הדק מורין, והקמת תרביות משותפות תלת-ממדיות (3D) בין שני סוגי התאים כדי לחקור אינטראקציות דו-כיווניות בין תאי אפיתל במעי לבין תאי לימפואידים מולדים מסוג 1.

תרבית משותפת של אורגנואידים אפיתליאליים של המעי הדק של מורין עם תאי לימפה מולדים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במעיים של חולדות ומשתמשים בהם במספר יישומים במורד הזרם. חולדות הן לעתים קרובות מודל פרה-קליני מועדף, ומערכת אורגנואיד המעי החזקה ממלאת את הצורך במערכת חוץ גופית שתלווה מחקרי vivo .

יצירה ומניפולציה של אורגנואידים במעיים של חולדות

פרוטוקול זה מתאר גישה לביצוע הדמיית סידן באורגנואידים של מעיים אנושיים נגועים בנגיף, ומציע גישה לניתוח.

הדמיית סידן חיה של חד-שכבות אורגנואידים במעי אנושי נגועים בנגיף באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית

הפרוטוקול משלב טכנולוגיית אורגנואיד מעיים אנושיים עם ניתוח תעתיק של תא בודד כדי לספק תובנה משמעותית לגבי ביולוגיית המעי שלא נחקרה בעבר.

שימוש באורגנואידים של המעי האנושי כדי להבין את אפיתל המעי הדק ברמת השעתוק של תא בודד

מאמר זה מתאר פרוטוקול מגיב רומן ולהגדיר מיועד מדידה רגישה של ההשפעות הנוירו של תרכובות וטיפולים על שיתוף תרבויות של נוירונים האסטרוציטים באמצעות ניתוח תוכן גבוהה. תוצאות מראים כי ניתוח תוכן גבוהה מהווה טכנולוגיה חדשנית מרגש להערכה neurotoxicity.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

למדו שיטת התמרה לנטיווירוסית באורגנואידים של אפיתל מעיי עכברים לצורך חקר ביולוגיה מעייתית. הפרוטוקול כולל ייצור חלקיקים ויראליים, טיפול בגורמי גדילה וניתוח במורד הזרם באמצעות RT-PCR ואימונוהיסטוכימיה.

פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids

גלה סרטונים נוספים