פרוטוקול לlentiviral התמרה וניתוח במורד הזרם של המעיים Organoids
20 באפריל 2015
בפרוטוקול וידאו זה אנו נותנים הסבר שלב אחר שלב על התמרה לנטי-ויראלית באורגנואידים של אפיתל המעי הראשוני ועל עיבוד וניתוח במורד הזרם של תרביות אלה על ידי RT-PCR כמותית, מיקרו-מערך RNA ואימונוהיסטוכימיה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור אורגנואידים שהועברו ביציבות מאפיתל המעי הראשוני של העכבר לניתוח במורד הזרם של אורגנואידים במעי. זה מושג על ידי העברה ראשונה של תאי HEC 2 93 T עם וקטורי אריזה לנטי-ויראליים ופלסמיד לנטי-ויראלי, המקודד את הגן המעניין לייצור חלקיקים לנטי-ויראליים בעלי טיטר גבוה. השלב השני הוא טיפול מקדים באורגנואידים במעי עכברים מתורבתים עם מספר גורמי גדילה כדי להשיג קריפטות היפר-פרוליפרטיביות ציסטיות.
לאחר מכן, התמרו את האורגנואידים עם וירוס הטיטר הגבוה ודגרו על האורגנואידים המומרים במטריג'ל. השלב האחרון הוא להטמיע אורגנואידים מתמרים בוגרים מלאים בפרפין לניתוח אימונוהיסטוכימיה במורד הזרם. בסופו של דבר, התמרה אורגנואידית לנטי-ויראלית משמשת ליצירת שינויים גנטיים במודל מבחנה של אפיתל המעי שהוא אמין, ניתן לשחזור ומהיר.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון קווי תאים סרטניים, הוא שאורגנואידים הם היררכיה של תאי גזע שנעקרו ללא מוטציה. בקיטוב תאי טקסט, הוא יכול להתמיין לכל סוגי התאים השונים של אפיתל המעי הדק. בנוסף, ניתן להשתמש באורגנואידים מותמרים לחקר אלמנטים גנטיים ספציפיים, ובכך לעלות על השימוש בעכברים טרנסגניים והיבטים של עלות ומהירות.
ייצור חלקיקים לנטי-ויראליים הוא פרוטוקול של חמישה ימים שמתחיל בפיצול תאי HEC 2 93 T לשטף של 60 עד 80% בבקבוק של 162 סנטימטר מרובע במדיום תרבית תאים. דגרו את התאים למשך הלילה בחממת תרבית תאים לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למחרת. הכן את תמיסת העברת ה-DNA ואת תמיסת הטרנספקציה של פוליאתילן אמין או PEI כמתואר בטקסט הפרוטוקול.
הוסף את תמיסת טרנספקציית ה- DNA למערבולת תמיסת PEI או הפוך מספר פעמים ודגירה למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר. טפטפו שני מיליליטר של תמיסת DNA TRANSFECTION בתוספת PEI על תאי HEC 2 93 T ודגרו במשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לאחר ארבע שעות.
רענן את מדיום התרבות. כדי להסיר את ה-PEI דגרו על התאים במשך יומיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ביום הרביעי, אספו את הסופרנטנט בצינור של 50 מיליליטר. הוסף מדיום תרבית חדש לתאים והחזיר את הבקבוק לצנטריפוגת האינקובטור את הסופרנטנט שנאסף ב-500 גרם למשך חמש דקות.
כדי להסיר תאים מתים, השתמש במזרק גדול של 60 מיליליטר כדי לדחוף את ה-SUPERNAT דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר. אחסן את הסופרנט המסונן למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת. אסוף צנטריפוגה וסנן את האצווה השנייה של סופרנטנט כפי שמוצג עבור האצווה הראשונה.
אסוף את שתי קבוצות הסופרנטנט בצינורות אולטרה צנטריפוגה. צנטריפוגה ב-50,000 GS למשך 90 דקות. בסיום הצנטריפוגה, בזהירות רבה, הסר את הכמוסות המכילות את צינורות הצנטריפוגה האולטרה-צנטריפוגה והכניס אותן למכסה זרימה למינרית.
פתח את הקפסולה המחזיקה את צינור האולטרה צנטריפוגה ושפך את המדיום בזהירות עם הגלולה בצד העליון של הצינור. חשוב לזכור איזה צד של ערעור הצינור היה נוצר מכיוון שכדורים נגיפיים עשויים להיות קשים לדמיון. לאחר מכן, השתמש במיקרו פיפטה כדי להסיר את פיסת המדיום האחרונה תוך הקפדה לא לעורר את הכדור החום האטום הנראה בצד החלק התחתון של צינור האולטרה-צנטריפוגה.
השעו מחדש את הכדור הזה ב-500 מיקרוליטר של מדיום תרבית אורגנואידים בתוספת מעכבי ניקוטינמיד קינאז ו-poly brain resus. תרחיף במדיום זה חשוב מכיוון שנגיף טיטר גבוה ישמש ישירות להעברת אורגנואידים יומיים לפני ההעברה. פצלו באר מלאה של 0.95 סנטימטר רבוע של אורגנואידים לבאר חדשה של צלחת 48 בארות.
בעקבות פרוטוקול שפורסם בעבר. שאפו להשיג כ-50 אורגנואידים קטנים בתרבית אורגנואידים. מדיום בתוספת מעכב גליקוגן סינתאז קינאז וניקוטינאמיד.
כדי להשיג קריפטות ציסטיות היפר-פרוליפרטיביות. דגרו על האורגנואידים במשך יומיים ביום הקציר אורגנואידים עם מיקרו פיפטה P 1000. פיפטה את ג'ל המאטרה ומדיום למעלה ולמטה, ובכך משבש את התערובת.
מניחים את התערובת בצינור של 15 מיליליטר. שבש את התערובת עוד יותר באמצעות PEs הפיפטה שלך שבה הפתח הדיסטלי ירד על ידי המסת גלולה האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב -100 גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט ב-500 מיקרוליטר של טריפסין אחד לחימום מראש והשהה מחדש את האורגנואידים בדגירה למשך שלוש דקות.
באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, השביתו את הטריפסין על ידי הוספת 3.5 מיליליטר של צנטריפוגה בינונית מתרבית קו תאים למשך חמש דקות. ב 500 גרם.הסר את הסופר נתן כדי להשאיר את הכדור בכ -20 מיקרוליטר בינוני. מעבירים את האורגנואידים בכמות הקטנה האחרונה הזו של מדיום לבאר.
על צלחת 48 באר. הוסף את נגיף הטיטר הגבוה שהוכן בעבר במדיום התמרה לאורגנואידים והשהה מחדש. דגרו את תערובת הנגיף האורגנואיד למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית כדי לאפשר התמרה לאחר שעה, הוסיפו מיליליטר אחד של תרבית אורגנואיד, מדיום לתערובת הנגיף האורגנואידי, השעו מחדש והעבירו את התערובת לצנטריפוגה של צינור מיקרו צנטריפוגה ב-850 GS למשך חמש דקות.
כדי לגלול את האורגנואידים, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה. ב -20 מיקרוליטר ג'ל מאטרה קר כקרח, הכניסו את הטיפה באמצע באר. בצלחת של 48 בארות ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
כדי שהטיפה תתמצק לאחר 15 דקות. מוסיפים בזהירות 250 מיקרוליטר של תרבית אורגנואיד. מדיום בתוספת מעכבי ניקוטינאמיד וקינאז.
מחממים גוש אלומיניום בחממה בחום של 70 מעלות צלזיוס כדי לשמור על נוזל הפרפין. הסר את המדיום מבאר אחת עם אורגנואידים בוגרים מלאים והשאיר את האורגנואידים המוטבעים שלמים והוסף מיליליטר אחד של 4% אלדהיד פרפורם ב-PBS ישירות לבאר. החלף את הפרפורם אלדהיד במיליליטר אחד של PBS.
השעו מחדש את האורגנואידים הקבועים ב-PBS והעבירו לבקבוקון זכוכית. תנו לאורגנואידים לשקוע לתחתית למשך דקה. לאחר מכן, פיפטה מה- PBS והחלף באתנול 70% בו מומסות כמה טיפות של תמיסת eoin.
כדי לאפשר הדמיה של אורגנואידים לאורך תהליך ההטמעה, השאירו את האורגנואידים ב-70% אתנול בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הסר את האתנול 70% על ידי פיפטינג בזהירות. ניתן לראות את האורגנואידים בעין בגלל צבע ה-eoin הורדרד.
החלף את תמיסת ההטבעה באתנול 96% והשאיר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות באופן זה. לאחר מכן, העבירו את האורגנואידים דרך 70% אתנול, 90% אתנול, 96% אתנול, 100% אתנול, 100% אתנול, קסילן וקסילן. שפכו את שטיפת הקסילן האחרונה ושפכו פרפין לבקבוקון הזכוכית.
הכניסו את הבקבוקון מיד לגוש האלומיניום המחמם מראש בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, החלף את הפרפין בפרפין נקי חדש עם חימום מראש, PE או פיפטה. יוצקים את הפרפין ומשתמשים במזיק או פיפטה חמים מראש עם פתח גדול כדי להחדיר את האורגנואידים לתבנית גוש הפרפין לשכבת פרפין נוזלי.
מחממים מחט דיסקציה עם מבער בונסן ומניפולציות על כל האורגנואידים ככל האפשר לכיוון מרכז תבנית בלוק הפרפין. כאשר לוקליזציה של האורגנואידים בתבנית משביעת רצון, יש לצנן מעט את התבנית כדי למצק את שכבת הפרפין. סיים את הבלוק על ידי שפיכת פרפין נוסף מעל והוסף קלטת הטבעה היסטולוגית סטנדרטית.
בפרוטוקול זה, אורגנואידים של אפיתל המעי הומרו עם לנטי-וירוסים. אורגנואידים רגילים גדלים כמבנים וילוסיים של קריפטת K עם מספר קריפטות שיוצאות מתחום וילוס משותף. עם טיפול באורגנואידים אלה עם מעכב GSK 3 B, CHIR 9 9 0 21, התפשטות גדלה והקריפטות הופכות לציסטיות לאחר התמרת אורגנואידים.
באמצעות ביטוי יתר של EGFP לנטיויראלי, האורגנואידים מבטאים שלבי שיפור התמרה פלואורסצנטיים של EGFP שעשויים להתבצע כאשר יעילות ההתמרה נמוכה, כגון חיסון או דגירה ויראלית ממושכת, מכיוון שצעדים אלה לא יגדילו את היעילות הגבוהה ממילא. לאחר מכן, אורגנואידים אלה מעובדים עבור טכניקות RNA ואימונוהיסטוכימיה. תמונה מייצגת זו היא קטע של אורגנואיד מעיים של עכבר, מוכתם ל-BRDU לאחר הדגירה עם BRDU במשך שעה לפני הקיבוע.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להמיר אורגנואידים מאפיתל המעי הראשוני באמצעות חלקיקים לנטי-ויראליים או רטרו-ויראליים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול וידאו זה מספק הסבר מפורט על טרנסדוקציה לנטיווירלית באורגנואידים המופקים מאפית מעי ראשונית. הוא מפרט את העיבוד ואת הניתוח הבא בתור של תרביות אלו באמצעות quantitative RT-PCR, RNA-microarray ואימונוהיסטוכימיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- הנדסה גנטית
רקע
- טרנסדוקציה לנטיוויראלית היא שיטה המשמשת להחדרת חומר גנטי לתאים.
- אורגנואידים הם מבנים תלת-ממדיים המדמים את הארכיטקטורה והתפקוד של איברים.
- אורגנואידים של אפיתל מעי ראשוני הם בעלי ערך רב למחקר של ביולוגיה של המעי.
- טכניקות של אנליזה במקדם (Downstream analysis) חיוניות לתיקוף של שינויים גנטיים.
מטרת המחקר
- ליצירת אורגנואידים שעברו טרנסדוקציה יציבה לצורך מחקר על אפיתל המעי.
- לאפשר שינויים גנטיים במודל in vitro.
- להקל על ביצוע מחקרים אמינים וניתנים לשחזור של ביולוגיה של המעי.
שיטות שהשתמשו בהן
- טרנספקציה של תאי HEC 2 93 T עם וקטורים לאריזת לנטי-וירוס.
- ייצור של חלקיקי לנטי-וירוס בטיטר גבוה.
- טיפול מקדים של אורגנואידים בגורמי גדילה.
- טרנסדוקציה של אורגנואידים באמצעות לנטי-וירוס ודגירה במטריג'ל (matrigel).
- טמינת אורגנואידים בפרפין לצורך אימונוהיסטוכימיה.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של אורגנואידים של המעי שעברו שינוי גנטי.
- תיקוף של יעילות הטרנסדוקציה באמצעות quantitative RT-PCR.
- ניתוח של ביטוי גנים באמצעות RNA-microarray.
- אפיון אימונוהיסטוכימי של מבני האורגנואידים.
מסקנות
- טרנסדוקציה לנטיווירלית היא שיטה יעילה לשינוי אורגנואידים של המעי.
- גישה זו מספקת מודל מהימן לחקר הביולוגיה של אפיתל המעי.
- ניתן ליישם את השיטות המתוארות במגוון מחקרים גנטיים באורגנואידים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טרנסדוקציה לנטיבירילית של אורגנואידים של המעי מאפשרת גנומיקה פונקציונלית מהירה וחסכונית במודל in vitro בעל רלוונטיות פיזיולוגית, ובכך מפחיתה את ההסתמכות על מודלים של עכברים טרנסגניים. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות (target validation) ובהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות למניפולציה גנטית מדויקת במערכת השומרת על ההיררכיה של תאי הגזע במעי, על הפולריות ועל סוגי תאים מובחנים. הפרוטוקול מספק זרימת עבודה ניתנת להרחבה ליצירת שינויים גנטיים יציבים המתאימים לניתוחים כמותיים בהמשך, ובכך הוא מאיץ את הגילויים בביולוגיה של מערכת העיכול ובתחומים טיפוליים קשורים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ביטוי של טרנסגן הניתן להשראה או השתקה מתווכת shRNA באורגנואידים של המעי.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מידול של הפרעות גנטיות בארכיטקטורה אפיתליאלית דמוית-טבעית.
- ערך ניבוי: מגביר את הביטחון בתוצאות המודולציה של המטרה על ידי שימור דיפרנציאציה הומאוסטטית ופולריות של התאים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר אוכלוסיות אורגנואידים שעברו טרנסדוקציה המתאימות לבדיקות quantitative RT-PCR, RNA-microarray ואימונוהיסטוכימיה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת האורגנואידים באמצעות טיפול מקדים בגורמי גדילה ליצירת קריפטות היפר-פרוליפרטיביות ציסטיות לטרנסדוקציה עקבית.
- מוכנות הבדיקה: מאפשרת פלטפורמות אמינות לסריקת תרכובות או סריקה גנטית באמצעות רפורטרים פלואורסצנטיים או אימונוהיסטוכימיים כגון EGFP.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומרת על ביולוגיה של אפיתל המעי הרלוונטית למחלה, ובכך תומכת בהשלכה למודלים in vivo.
- תועלת פרה-קלינית: מאפשרת ניתוח המותאם לסממנים ביולוגיים (biomarkers) באמצעות עיבוד המשכי לזיהוי חלבונים וחומצות גרעין.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשרת מחזורי שינוי גנטי איטרטיביים להפחתת סיכונים של מטרות לפני תיקוף in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
השיטה משתלבת בתהליכי העבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי אפשור מחקרי הפרעה גנטית המכוונים את בחירת המטרה ואת אופטימיזציית המולקולה המובילה (lead optimization), כאשר התוצרים מזינים את התקיפות הפרה-קלינית באמצעות פרופילינג מולקולרי והיסטולוגי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות באמצעות ביטוי יתר הניתן להשראה או השתקה של גנים רלוונטיים במערכת אפיתלית מקוטבת.
- סריקה: מספק יעילות טרנסדוקציה המתאימה לקריאות ניתנות להרחבה באמצעות qPCR, מערך ז probes (microarray) או IHC, ללא צורך במסמני ברירה.
- אנליטיקה: מייצר נתונים כמותיים של ביטוי חומצות גרעיים וחלבונים להשוואת מצבים גנטיים ולהערכת השפעה פנוטיפית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מודיפיקציות גנטיות לקריאות תפקודיות בהקשר דמוי-רקמה, ובכך תומך בקורלציה של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר עבור מודולציה מתווכת לנטי-ויראלית של מטרות מרובות במודלים של מחלות מעי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון בחיזוי על ידי מידול השפעות גנטיות במערכת אפיתליאלית שאינה שעורה ובעלת דיוק פיזיולוגי.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות שלבי ייצור לנטיווירליים וטיפולים מקדימים של אורגנואידים בסטנדרט אחיד.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי האצת לוחות הזמנים של תיקוף יעדים בהשוואה לגישות טרנסגניות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף יעדים מותאם סיכון על בסיס תוצאות פונקציונליות בתחליף רקמה רלוונטי לבני אדם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור וקטורים לנטיביריים, תרביות אורגנואידים ועיבוד היסטולוגי.
- תלוי בגישה לתשתיות של אולטרה-צנטריפוגציה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וטמיעה בפרפין.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין יחידות הווירולוגיה, תרביות התאים וההיסטולוגיה להשגת תוצאות עקביות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה לאורגנואידים של המעי הגס או למערכות המבוססות על מודלי מחלה.
- מוגבל על ידי תנובת האורגנואידים והרגישות לשלבי הדיסוציאציה האנזימטית במהלך העיבוד.
