בוחן את התפקיד של פלסמידים Multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה

המטרה הכוללת של שיטה ניסיונית זו היא לבחון את תפקידם של פלסמידים מרובי עותקים באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה כגון תפקידם של פלסמידים מרובי עותקים באבולוציה של חידושים חיידקיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת רק שיטות בסיסיות של ביולוגיה מולקולרית ותכנון ניסיוני פשוט.

זה ממש מגניב. ראשית, בנה את זן ה-e coli MG1655 שיישא את גן העמידות לנוגדנים בכרומוזום בפאג' הלמבדה בצד המשוואה ATTB. לשם כך, PCR מגביר את 500 אזורי הפרלונג הבסיסיים משני צידי אתר ה-ATTB.

ואז PCR מגביר את גן העמידות לאנטיביוטיקה. לאחר מכן השתמש במכלול איזותרמי ב-50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי למזג את אזורי ההומולוגיה לתוצר ה-PCR. לאחר הרכבה איזותרמית, העבירו מיקרוליטר אחד של המוצר ל -40 מיקרוליטר של תאי MG1655 בעלי יכולת חשמלית לקובטה של שני מילימטרים.

לאחר מכן אלקטרופורציה של התאים ב -4 מעלות צלזיוס ו -2.5 קילו-וולט. לאחר אלקטרופורציה, העבירו את התאים במיליליטר אחד של מרק LB עם 0.2% ארבינוז. לאחר מכן פיפטה את מרק ה-LB המכיל תאים לצינור מיקרופוגה.

יש לנער את הצינור בעוצמה במשך שעתיים בחום של 30 מעלות צלזיוס. לאחר שעתיים, צלחת 100 מיקרוליטר מהתרבית על צלחת אגר LB, בתוספת אנטיביוטיקה. לאחר מכן סובב את התאים הנותרים.

ותלו מחדש את הגלולה ב -100 מיקרוליטר מרק LB טרי. צלחת מחדש של תאים אלה על צלחת אגר LB אחרת. לאחר מכן דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, PCR מגביר את השיבוטים כדי לאמת את המבנה באמצעות פריימרים חיצוניים ybhC extern ו-ybhB extern. לאחר מכן אשר את גודל האמפליקון באמצעות אלקטרופורזה של מעטפת האגרוז. במקביל, בצע ריצוף DNA כדי לאמת את רצף הגן שהוכנס.

כדי לבנות את הזן לשאת את גן העמידות לנוגדנים בפלסמיד המולטי-עותקים, PCR ראשון מגביר את גן העמידות לאנטיביוטיקה blaTEM-1. לאחר השלמת ה-PCR, זרחן את המוצר המוגבר באמצעות T4 פולינוקלאוטיד קינאז. לאחר מכן, השתמש בפולימראז ואוליגונוקלאוטידים בנאמנות גבוהה PBAD FINV ו-PBAD RINV, כדי להגביר את עמוד השדרה של הפלסמיד PBAD.

לאחר מכן קשר את שני שברי ה-PCR באמצעות T4 ligase. לאחר מכן, אלקטרופוראט 40 מיקרוליטר תאי אלפא DH5 עם 1 מיקרוליטר של תוצר הקשירה. לאחר מכן בחר את האנטיביוטיקה המתאימה לגן העמידות לאנטיביוטיקה ועמוד השדרה של הפלסמיד על צלחות אגר.

לאחר מכן בצע מיצוי פלסמיד באמצעות ערכת מיצוי DNA, בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן בצע ריצוף סנגר של גן העמידות המעניין כדי לאשר את היעדר מוטציות אפשריות לפני ניסויי האבולוציה. לאחר אימות הרצף, אלקטרופוראט את הפלסמיד בזן אי קולי MG1655 כדי להשיג סוף סוף את הפלסמיד הנושא את זן MG1655.

השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם בניית זני מערכות המודל ושחזור המוטציות שנצפו במהלך האבולוציה הניסויית. ראשית, פס את זני העניין MG1655 על לוחות אגר LB. לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטר של מדיום LB בכל באר של צלחת 96 בארות.

לאחר מכן, יש לחסן 48 מושבות מבודדות של כל זן בבארות בודדות של הצלחת. לאחר החיסון, דגרו את הצלחת למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר ב-200 סיבובים לדקה. שוב, יש לחסן שני מיקרוליטר של התרבית מכל באר עם אוכלוסיית המייסדים לצלחת חדשה של 96 בארות עם 198 מיקרוליטר של מדיום LB בבארות בודדות.

זה יתחיל את ניסוי ההצלה האבולוציוני. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על שייקר במהירות של 200 סיבובים לדקה למשך 20 שעות. בכל יום יש להכפיל את ריכוז האנטיביוטיקה מזה של היום הקודם.

למחרת, העבירו 2 מיקרוליטר מהתרבית המתאימה לצלחת באר טרייה של 96 והמשיכו בכך כל יום. רשום את קריאת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מהבארות הבודדות בקורא צלחות. שלב קריטי בפרוטוקול הוא האבולוציה הניסויית והריכוזים ההולכים וגדלים של אנטיביוטיקה.

קצב השינוי של ריכוזי האנטיביוטיקה הוא אחד הפרמטרים שניתן לשנות כדי לקדם את התפתחות העמידות לאנטיביוטיקה. שוב, דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר ב-200 סיבובים לדקה למשך 20 שעות. לאחר מכן מדוד את קריאת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר עבור כל אוכלוסייה ששרדה מדי יום בקורא הלוחות.

הקפיאו את האוכלוסיות מעת לעת, כל שלושה עד חמישה ימים. חלץ את ה-DNA הכולל מהאוכלוסיות המפותחות ואת השיבוטים מזנים וטיפולים שונים. לאחר מכן, מדוד את יחסי הספיגה ב-260:280 ו-260:230 ננומטר על הספקטרופוטומטר כדי לקבוע את איכות ה-DNA.

לאחר מכן השתמש בצבע קושר DNA פלואורסצנטי ואשר את ריכוז ה-DNA על ידי מדידת הקרינה בקורא הצלחות. בנוסף, הכניסו את ה-DNA לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז כדי לאשר שאין פירוק DNA או זיהום RNA. לאחר מכן, בצע ריצוף DNA עמוק עם דגימות שהתקבלו מאוכלוסיות שלמות ושיבוטים בודדים כדי לחקור את הבסיס הגנטי של עמידות לאנטיביוטיקה.

מחקר זה הוא דוגמה לתוצאות האפשריות של מערכת הניסויים המשתמשת בשלושה זני אי קולי. זנים אלה הם e coli MG1655, MG1655 הנושא את גן העמידות בכרומוזום MG1655 resA ו-MG1655 הנושא את גן ההתנגדות בפלסמיד המולטי-עותק, MG1655 pRESA. האנטיביוטיקה המשמשת היא ceftazidime ו-meropenem.

פאנל שמאלי זה מציג את עקומות ההישרדות תחת ריכוזים הולכים וגדלים של ceftazidime. מהעלילה, ברור כי תת-קבוצת האוכלוסייה של הזן MG1655 pRESA מסוגלת לגדול מעבר ל-14 יום גם לאחר הכפלת ריכוז הצפטזידים בכל יום. להיפך, הזנים האחרים אינם שורדים מעבר ל-8 ימים כאשר הם נחשפים לריכוזים דומים של צפתזידים.

עם זאת, אותם זנים אינם מראים הבדלים משמעותיים בתקופת ההישרדות כאשר הם נחשפים לריכוז דומה של אנטיביוטיקה אחרת, מרופנם. כל שלושת הזנים שורדים רק בין 6 ל-8 ימים כאשר הם נחשפים למרופנם. זה מצביע על כך שנוכחותו של הגן resA בפלסמיד המולטי-עותק מעצימה את התפתחות העמידות נגד ceftazidime אך לא meropenem.

לאחר שליטה, ניתן לבצע את פרוטוקול הניסוי המלא תוך מספר שבועות אם נעשה כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור את תפקידם של פלסמידים מרובי עותקים באבולוציה של חידושים בחיידקים.