בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור ספריית מוטאנטים אקראית עבור רצף DNA מטרה נתון, ולזהות ולאפיין במהירות מוטאנטים באמצעות ברירה פונקציונלית חצי כמותית. זה מושג על ידי הפיכת פלסמיד עם קולי, מקור שכפול אחד המכיל את רצף המטרה לזן המוטטור. לאחר ציפוי ודגירה של התאים למשך הלילה, הם נקצרים ופלסמיד המטרה מבודד כדי להשיג את ספריית המוטנטים, ספריית המוטאנטים הופכת לאחר מכן לזן קריאה כדי לאפיין את המוטציות בחלק השני של הפרוטוקול, נבנית לוחית גידול שיפוע ותרביות חיידקים של זן הקריאה נטענות לתוך צלחת פטרי נפרדת המכילה אוויר רך.

השלב האחרון של ההליך הוא החתמת העברת תרביות חיידקים אלה לשיפוע. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שינויים בפרופיל הפנוטיפ של רצף מטרה נתון באמצעות הבדלים בצמיחה בשיפוע תרופה. סרטון זה מציג שיטה לאבולוציה מכוונת של חלבונים באי קולי.

תהליך זה מחקה את האבולוציה הטבעית ביצירת ספריות חומרים מזינים אקראיות, ואחריה ברירה המגבילה את המגוון הזה. לפיכך, הוא משפר את יכולתנו לייצר פעילויות ביוכימיות חדשות למטרות תעשייתיות או ביו-רפואיות. להליך זה שני מרכיבים, יצירת ספריית מוטציות אקראיות והבחירה הפונקציונלית להשגת רווח של מוטציות תפקוד המדגימות הליך זה תהיה ג'ניפר אלן, טכנאית מהמעבדה שלי.

לפני תחילת פרוטוקול זה חשבו שתאי JS 200 מוכשרים אלקטרו-מוכשרים המבטאים וריאנט נאמנות נמוכה של DNA פולימראז אחד או קוטב נאמנות נמוך, כזה שהוכן בעבר כמתואר בפרוטוקול הכתוב, תאים אלה מכילים אלל רגיש לטמפרטורה של קוטב אחד, כך שפעילות קוטב נאמנות נמוכה שולטת ב-37 מעלות צלזיוס, מבנה. פלסמיד מטרה המכיל קולי, מקור אחד של שכפול עם רצף המטרה משובט בסמוך למקור השכפול, קוטב נאמנות נמוכה אחד יוזם קולי, שכפול פלסמיד אחד. ובכך הציגו מוטציות להתחלת מוטגנזה.

שלב 40 מיקרוליטר של תאים מוכשרים אלקטרו ובין 30 ל-250 ננוגרם של DNA פלזמה מטרה בפער של שני מילימטרים. דופק וטרינר אלקטרופורציה, התערובת באלקטרו ב -1800 וולט. בדוק את קבוע הזמן או TC כדי להבטיח תנאי התאמה אחידים עבור כל דגימה.

באופן אידיאלי TC שווה לחמש עד שש אלפיות השנייה. אפשר לתערובת ה-DNA של התאים להתאושש במיליליטר אחד של מרק LB למשך 40 דקות ב-37 מעלות צלזיוס לרעוד ב-250 סל"ד. השג צלחת 100 מילימטר LV agro Petri מחממת מראש ל-37 מעלות צלזיוס המכילה אנטיביוטיקה מתאימה כדי לבחור עבור שני הפלסמידים צלחת את התאים המשוחזרים בדילול מתאים כדי להשיג ריכוז קרוב לדשא, המוגדר כמספר מובהק אך בלתי ניתן לספירה של מושבות כפי שמוצג בדוגמה זו.

לאחר הדגירה של הלילה, קצרו את מושבות החיידקים של מנות הפטרי עם מרק LB. לבודד פלסמיד, DNA מהתאים שנקטפו, הפלסמיד שנוצר. הדנ"א מהווה את ספריית המוטאנטים האקראית.

בצע תקציר הגבלה על ידי חיתוך ספריית הפלסמיד עם אנזים הגבלה שהופך גם את פלסמיד המטרה וגם את הקוטב ליניארי. פלסמיד אחד מריץ ג'ל ארו אנליטי על ה- DNA המבודד של הפלסמיד כדי לאשר איכות וכמות. לאחר אימות הפלסמידים, עכל מיקרוגרם אחד מהספרייה עם אנזים הגבלה שהופך את הקוטב לפלסמיד אחד, אך אינו חותך את פלסמיד המטרה.

לאחר השלמת תקציר ההגבלה, נקה את הספרייה באמצעות ערכת טיהור DNA. לבסוף, הפוך את הספרייה הנקייה לזן קריאה כדי לאפיין את המוטציות. כדי להתחיל בהכנת שיפוע, סמן 10 נתיבים במרווחים שווים על פני קצה אחד של החלק התחתון של צלחת הפטרי המרובעת.

הניחו את המנה בשיפוע כך שהקצה המסומן התחתון מוגבה שבעה מילימטרים. יוצקים 25 מיליליטר אגר lb חם מעורבב היטב עם ריכוז מתאים של חומר הבחירה לתוך צלחת השיפוע. זוהי השכבה התחתונה של השיפוע.

ודא שהאגר LB מצפה את צלחת הפטרי כך שהקצה המסומן המוגבה של המנה מכיל כמילימטר אחד של אגר LB, והחלק המונמך מכיל כשמונה מילימטרים. מכסים את הצלחת במכסה KU לאוורור ומניחים לחקלאות להתייצב למשך 10 עד 15 דקות. לאחר שהשכבה התחתונה של אגר LB התקשה, העבירו את המנה למשטח ישר.

לאחר מכן, שפכו 25 מיליליטר אגר חם ללא חומר הבחירה שיכסה את משטח החקלאות הראשון, והקפידו לכסות את כל השכבה התחתונה. מכסים את הצלחת במכסה KU לאוורור, ולאחר מכן מניחים לחקלאות להתייצב למשך 10 עד 15 דקות כדי לבצע את העברת החותמת של חיידקים. ראשית, השג תרביות חיידקים של זן הקריאה ודלל אותן לצפיפות תאים זהה עם צפיפות אופטית של 600 ננומטר של פחות מ-1.0.

לאחר מכן, העבירו שני מיליליטר אגר רך נוזלי מאוזן ל -42 מעלות צלזיוס לתחתית צלחת פטרי עגולה של 100 מילימטר, פיפטה 40 מיקרוליטר מתרבית החיידקים לרך יותר ואז ערבבו על ידי נדנוד הצלחת. מצפים את הקצה הארוך של שקופית מיקרוסקופ הזכוכית בתערובת הרכה יותר. לאחר מכן יישר את הקצה המצופה של השקופית עם הסימן התחתון על צלחת השיפוע.

גע בשקופית לפני השטח של האגר. די במגע רך בכדי להעביר סרט של האגר הרך למשטח השיפוע. לאחר מכן המגלשה מונחת בצד לניקוי ושימוש חוזר.

חזור על תהליך זה. יש לכלול את שאר הדגימות, בקרות ניסיוניות על כל צלחת שיפוע. אם מופעלים שיפועים מרובים, דגרו את צלחת השיפוע מלמעלה למטה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס פעמים וטמפרטורות הדגירה עשויות להיות שונות עבור זני חיידקים שונים שנקראו, אך לילה ב-37 מעלות צלזיוס מספיק בדרך כלל לצמיחה נראית לעין.

לבסוף, דמיין ונתח את צמיחת התאים כמתואר בפרוטוקול הכתוב. המוצג. להלן תמונות של זן קריאה שעבר טרנספורמציה עם P-G-F-U-V לא מושתק או ספריית מוטנטים PG FPUV שהועברו דרך. ארבעה סבבים של מוטגנזה מושבות כהות או עמומות מצביעים על פלסמיד המכיל מוטציות משביתות GFP.

נתון זה מייצג את תדירות המוטציות לאורך הרצף הנייטרלי של פלסמיד המטרה במרווחים של 100 זוגות בסיסים. שימו לב שהמוטציות מתרחשות על פני כל רצף הפלסמיד, אך בתדירות הגבוהה ביותר הקרובה ביותר למקור השכפול. כאן, צמיחה של מוטאנטים מוצגת כנגד שיפוע תרופות.

המרחק שגדל לקראת החלק העליון של השיפוע מצביע על פרופיל עמידות דיפרנציאלי לתרופות בקרב המוטאנטים. בדוגמה זו, ספריות פלסמיד של דמתילאז ABH 2 החמצוני האנושי נבדקו לאיתור מוטציות עם עמידות מוגברת למתיל מתאן סולפונאט באמצעות שיפועי בחירת תרופות. שניים. ספריות כאלה המייצגות שתיים וארבע איטרציות של פרוטוקול המוטגנזה מוצגות בהשוואה לסוג הפראי ההורי והווקטור הריק.

הקו הלבן מציין את הסף שמעליו בודדו מושבות מוטנטיות בודדות. לניתוח פנוטיפי נוסף, מוטציות בטא-לקטמאז, R 1 64 H ו-E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R שזוהו בעבר באמצעות מוטגנזה P אחת בנאמנות נמוכה ובחירת אסטרי ו-m מוצגות על 0.4 מיקרוגרם למיליליטר וארבעה מיקרוגרם למיליליטר. הגנת שיפוע Cefotaxime מפני cefotaxime מעידה על פעילות בטא-לקטמז בספקטרום מורחב.

שימו לב שאנזים בטא-לקטמאז מסוג פרא אינו מעניק הגנה ביחס לתאים המבטאים וקטור ריק. לכן, מוטציות אלה מייצגות הסתגלות או התפתחות של פעילות ביוכימית חדשה. כאן הצגנו שילוב רב עוצמה של מוטגנזה וברירה פונקציונלית לדור זה של פעילויות ביוכימיות חדשות.

ניתן להשיג ברירה פונקציונלית באמצעות בחירת תרופות או באמצעות השלמה גנטית, והיא מנצלת את היכולת שלנו לייצר מגוון גנטי גדול. ייתכן שיהיה צורך להגביל את הפתוגנזה לרצף נתון על מנת לייעל את פעילויות החלבון הקיימות או לפתוגנזה מכוונת אתר. ניתן לעשות זאת בקלות על ידי שיבוט.

בנוסף, ניתן לנתק מוטגנזה מבחירה פונקציונלית על מנת להשיג התקפות חתימה או טביעות רגל מוטציות.