שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

המטרה הכללית של סרטון זה היא להציג שיטה פשוטה חדשה לבידוד ותרבית תאי אפידרמיס אנושיים ראשוניים מרקמת עור בוגרת. שיטה מתקדמת זו מתאימה יותר לייצור מספר רב של תאי אפידרמיס בעלי פוטנציאל גבוה ליישומים מעבדתיים וקליניים כאחד. שטפו את הטישו עם PBS לפני השקילה.

שקלו את רקמת העור במשקל אלקטרוני. שטפו את רקמת העור עם אתנול 70% למשך 30 שניות. דגרו את הרקמה ב-PBS עם אנטיביוטיקה פעמיים למשך חמש דקות בכל פעם.

העבירו את הרקמה לכלי סטרילי אחר והומוגניזציה יסודית באמצעות להבי אזמל. הוסף 200 מיקרוליטר PBS כל חמש דקות כדי לשמור על הרקמה רטובה. העבירו את הרקמה ההומוגנית לצינור של 50 מיליליטר.

הוסף 10 מיליליטר תערובת אנזימים לכל גרם אחד של רקמת עור. מערבבים היטב את האנזימים עם הרקמות ההומוגניות. דגרו את התערובת באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור.

לאחר מכן, הוסף 1/5 מהנפח של 0.25% טריפסין. המשיכו את הדגירה למשך 30 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. הוסף תמיסת Dnase I לתערובת ביחס של אחד ל -100.

לאחר מכן דגרו עוד חמש דקות. עצור את תהליך העיכול על ידי הוספת אותו נפח של מדיום נטרול. פפטו את התמיסה למעלה ולמטה כ-20 פעמים.

סנן את התאים המנותקים דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר כדי להסיר פסולת רקמות. צנטריפוגה בחום של 200 גרם למשך חמש דקות. התבונן בגלולה בתחתית הצינור.

הסר את חומרי העל ושטוף את כדור התא עם 10 מיליליטר של מדיום נטרול. ואז צנטריפוגה בחום של 200 גרם למשך חמש דקות. השעו מחדש את כדור התא במדיום החיסון עם מעכב ROCK 10 מיקרומולרי.

צלחת פעמיים 10 עד התאים השישיים בצלחת תרבית של 100 מילימטר. לאחר שלושה ימים, החלף את מדיום החיסון במדיום קרטינוציטים ללא סרום. החלף את המדיום כל יומיים.

כאשר התאים הגיעו לכ-80% מהצפיפות, עברו את התאים. שוטפים את התאים עם PBS. במידת הצורך, נסו במשך שתי דקות ושטפו את התאים עם PBS כדי להסיר תאי עור מזוהמים.

הוסף את אותו נפח של מדיום נטרול. צנטריפוגה בחום של 200 גרם למשך חמש דקות. לבסוף, הסר את הסופרנטנטים והשהה מחדש את כדורית התא.

הקרטינוציטים המבודדים מרקמות עור אנושיות הודגרו בנפרד בשתי שיטות. השיטה הקונבנציונלית היא עיכול דו-שלבי הכולל הליך של יומיים. לעומת זאת, השיטה החדשה היא עיכול חד-שלבי שלוקח כשלוש שעות לביצוע.

ביום השלישי, אנו יכולים למצוא בקלות אשכולות תאים רבים שגודלו בשיטה החדשה בעוד שתופעה זו אינה מתרחשת כאשר משתמשים בשיטה הקונבנציונלית. ביום החמישי נצפה כי השיטה החדשה מייצרת כמות גדולה יותר של תאים ראשוניים. כדי לבדוק את מצב ההתמיינות של קרטינוציטים מתורבתים, ניתחנו את סמן תאי הבסיס K5 וסמן ההתמיינות הסופי לוריקרין.

מצאנו ש-90% מכלל התאים היו חיוביים ל-K5, אך פחות מ-10% מהתאים ביטאו לוריקרין במעבר השלישי, מה שמצביע על כך שהם קרטינוציטים לא ממויינים. בדקנו את ביטוי הוימנטין המתבטא בפיברובלסטים העוריים כדי לבחון את זיהום תאי העור במהלך הבידוד. מצאנו כי כ-3% מתאי העור הופיעו במעבר הראשוני, אך רק כ-0.02% מתאי העור זוהו במעבר השלישי, מה שמעיד על טוהר גבוה של תאי האפידרמיס לאחר המעבר.