שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר
25 באוגוסט 2018
כאן אנו מציגים פרוטוקול לבודד ביעילות keratinocytes האדם העיקרי של רקמות העור למבוגרים. שיטה זו מפשטת את הפרוצדורה המקובלת על-ידי שימוש Y-27632 מעכב את רוק המדיום חיסון להפריד באופן ספונטני תאים אפידרמיס מתאי עורי.
המטרה הכללית של סרטון זה היא להציג שיטה פשוטה חדשה לבידוד ותרבית תאי אפידרמיס אנושיים ראשוניים מרקמת עור בוגרת. שיטה מתקדמת זו מתאימה יותר לייצור מספר רב של תאי אפידרמיס בעלי פוטנציאל גבוה ליישומים מעבדתיים וקליניים כאחד. שטפו את הטישו עם PBS לפני השקילה.
שקלו את רקמת העור במשקל אלקטרוני. שטפו את רקמת העור עם אתנול 70% למשך 30 שניות. דגרו את הרקמה ב-PBS עם אנטיביוטיקה פעמיים למשך חמש דקות בכל פעם.
העבירו את הרקמה לכלי סטרילי אחר והומוגניזציה יסודית באמצעות להבי אזמל. הוסף 200 מיקרוליטר PBS כל חמש דקות כדי לשמור על הרקמה רטובה. העבירו את הרקמה ההומוגנית לצינור של 50 מיליליטר.
הוסף 10 מיליליטר תערובת אנזימים לכל גרם אחד של רקמת עור. מערבבים היטב את האנזימים עם הרקמות ההומוגניות. דגרו את התערובת באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור.
לאחר מכן, הוסף 1/5 מהנפח של 0.25% טריפסין. המשיכו את הדגירה למשך 30 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. הוסף תמיסת Dnase I לתערובת ביחס של אחד ל -100.
לאחר מכן דגרו עוד חמש דקות. עצור את תהליך העיכול על ידי הוספת אותו נפח של מדיום נטרול. פפטו את התמיסה למעלה ולמטה כ-20 פעמים.
סנן את התאים המנותקים דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר כדי להסיר פסולת רקמות. צנטריפוגה בחום של 200 גרם למשך חמש דקות. התבונן בגלולה בתחתית הצינור.
הסר את חומרי העל ושטוף את כדור התא עם 10 מיליליטר של מדיום נטרול. ואז צנטריפוגה בחום של 200 גרם למשך חמש דקות. השעו מחדש את כדור התא במדיום החיסון עם מעכב ROCK 10 מיקרומולרי.
צלחת פעמיים 10 עד התאים השישיים בצלחת תרבית של 100 מילימטר. לאחר שלושה ימים, החלף את מדיום החיסון במדיום קרטינוציטים ללא סרום. החלף את המדיום כל יומיים.
כאשר התאים הגיעו לכ-80% מהצפיפות, עברו את התאים. שוטפים את התאים עם PBS. במידת הצורך, נסו במשך שתי דקות ושטפו את התאים עם PBS כדי להסיר תאי עור מזוהמים.
הוסף את אותו נפח של מדיום נטרול. צנטריפוגה בחום של 200 גרם למשך חמש דקות. לבסוף, הסר את הסופרנטנטים והשהה מחדש את כדורית התא.
הקרטינוציטים המבודדים מרקמות עור אנושיות הודגרו בנפרד בשתי שיטות. השיטה הקונבנציונלית היא עיכול דו-שלבי הכולל הליך של יומיים. לעומת זאת, השיטה החדשה היא עיכול חד-שלבי שלוקח כשלוש שעות לביצוע.
ביום השלישי, אנו יכולים למצוא בקלות אשכולות תאים רבים שגודלו בשיטה החדשה בעוד שתופעה זו אינה מתרחשת כאשר משתמשים בשיטה הקונבנציונלית. ביום החמישי נצפה כי השיטה החדשה מייצרת כמות גדולה יותר של תאים ראשוניים. כדי לבדוק את מצב ההתמיינות של קרטינוציטים מתורבתים, ניתחנו את סמן תאי הבסיס K5 וסמן ההתמיינות הסופי לוריקרין.
מצאנו ש-90% מכלל התאים היו חיוביים ל-K5, אך פחות מ-10% מהתאים ביטאו לוריקרין במעבר השלישי, מה שמצביע על כך שהם קרטינוציטים לא ממויינים. בדקנו את ביטוי הוימנטין המתבטא בפיברובלסטים העוריים כדי לבחון את זיהום תאי העור במהלך הבידוד. מצאנו כי כ-3% מתאי העור הופיעו במעבר הראשוני, אך רק כ-0.02% מתאי העור זוהו במעבר השלישי, מה שמעיד על טוהר גבוה של תאי האפידרמיס לאחר המעבר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפושט לבידוד קרטינוציטים אנושיים ראשוניים מרקמות עור מבוגרות. השיטה משתמשת במעכב ROCK Y-27632 כדי להקל על הפרדת תאי האפידרמיס מתאי הדרמיס.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאים
- דרמטולוגיה
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- קרטינוציטים אנושיים ראשוניים חיוניים ליישומים שונים של מחקר.
- שיטות בידוד קונבנציונליות יכולות להיות מורכבות ואורכות זמן רב.
- השימוש במעכב ROCK Y-27632 מציע גישה יעילה יותר.
- קרטינוציטים מבודדים יכולים לשמש הן בסביבת מעבדה והן בסביבה קלינית.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה יעילה יותר לבידוד תאי האפידרמיס.
- לשפר את התשואה של תאי אפידרמיס בעלי פוטנציאל גבוה.
- להקל על מחקר ויישום קליני הכולל תאי עור.
שיטות בהן נעשה שימוש
- לשטוף את רקמת העור עם PBS לפני שקילה.
- לשקול את רקמת העור באמצעות סולם אלקטרוני.
- לשטוף את הרקמה עם 70% אתנול למשך 30 שניות.
- לדגר את הרקמה ב-PBS עם אנטיביוטיקה פעמיים למשך חמש דקות כל אחת.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מצליח לבודד קרטינוציטים ראשוניים.
- הושגה תשואה גבוהה של תאי אפידרמיס חיים.
- השיטה היא שיחזורית ויעילה.
- ניתן להשתמש בתאים המבודדים ליישומים שונים.
מסקנות
- שיטה זו מפשטת את בידוד הקרטינוציטים הראשוניים.
- היא מספקת גישה אמינה לחוקרים בתחום.
- השימוש במעכב ROCK משפר את תשואת התאים ואת חיוניותם.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity primary human keratinocytes from adult skin remains a bottleneck in dermatology and regenerative medicine R&D due to low yield and contamination risks. This simplified one-step enzymatic method with ROCK inhibitor Y-27632 improves epidermal cell recovery and stemness, enabling scalable production for target validation and preclinical modeling. The approach reduces procedural complexity and time, supporting reproducible assay development and translational continuity from discovery to lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epidermal signaling pathways and target engagement in a physiologically relevant human cell system.
- Operational Value: Provides a renewable source of primary keratinocytes with high K5+/Loricrin- purity for consistent target de-risking.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by maintaining stem cell characteristics and low fibroblast contamination (<0.02% at P3) for reliable phenotype screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates large numbers of viable epidermal cells suitable for high-throughput compound screening and cytotoxicity testing.
- Standardization: The one-step digestion protocol (~3 hours) improves reproducibility across batches and laboratories.
- Scalability: Eliminates epidermis-dermis separation, allowing application to diverse adult tissues and increasing throughput for lead identification campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Produces keratinocytes with stem cell properties that model human epidermal homeostasis and barrier function.
- Translational Continuity: Maintains phenotypic stability through passaging, supporting preclinical efficacy and safety testing.
- Risk-Adjusted Advancement: High purity and yield reduce biological variability, improving confidence in go/no-go decisions for topical or regenerative candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by supplying validated primary human keratinocytes for early target validation, enabling assay development for screening campaigns, and supporting preclinical evaluation of dermatological therapeutics.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on epidermal targets using a purified, stem-cell-enriched human cell system.
- Screening: Delivers standardized, quantitative cell preparations for dose-response and biomarker readouts in compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of differentiation markers (K5, Loricrin) and contamination levels (vimentin) to assess cellular phenotype and purity.
- Translational Research: Supports continuity from isolated primary cells to preclinical models by preserving epidermal stemness and functionality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable across multiple projects requiring human epidermal cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through high-purity, stem-cell-enriched keratinocyte production.
- Operational Value: Reduces isolation time from two days to ~3 hours, improving laboratory throughput and resource efficiency.
- Strategic Value: Enhances predictive confidence in early-stage programs by minimizing biological noise from dermal contamination.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on reliable epidermal cell-based assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and enzymatic tissue dissociation techniques.
- Necessitates access to ROCK inhibitor Y-27632, enzyme mixtures (e.g., dispase, trypsin), and DNase I for digestion.
- Demands standardized centrifugation, filtration, and sterile technique to maintain cell viability and purity.
- Requires adaptation of inoculation and keratinocyte media formulations for optimal expansion and passaging.
- Practical limitations include donor variability in skin tissue quality and the need for aseptic handling to prevent microbial contamination.
