הגישה קומבינטורית תא בודד כדי לאפיין את מולקולרית והטרוגניות Immunophenotypic של גזע האדם ואוכלוסיות קדמון

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בשדות תאי גזע וסרטן כגון איך נראית הטרוגניות של תאי גזע וכיצד ניתן לבודד טיפול בתאי סרטן רגישים. היתרון העיקרי של מחקר זה הוא שהוא משלב ניתוח ביטוי גנים חד-תאי חזק מבחינה טכנית יחד עם חיסון לאפיון במורד הזרם של תת-כפילויות יעד. למרות שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור את הסרטן ואת הטרוגניות תאי גזע, זה יכול גם לתת תובנות לתוך priming גנים ופוטנציאל שושלת.

כדי להתחיל את הפרוטוקול, על ספסל נטול RNA / DNA, הכינו מספיק מאגר תמוגה ל-96 בארות עם תוספת של 10% על ידי ערבוב של 390 מיקרוליטרים נוקלאז מים חופשיים, 17 מיקרוליטרים של 10%NP-40, 2.8 מיקרוליטרים 10 מילימולרים dNTP, 10 מיקרוליטרים 0.1 מוליכים DTT, ו 5.3 מיקרוליטרים RNAse מעכב. וורטקס ותסתובבי במורד הצינור. לאחר מכן, להפיץ ארבעה microliters של חיץ תיזה לכל באר של צלחת PCR 96-well ולאטום את הצלחות עם סרט דבק.

לסובב את הצלחות כדי לאסוף את הנוזל בתחתית. שמור את הצלחות על הקרח עד למיון התאים למשך 24 שעות לכל היותר. לאחר שמכונת FACS הוגדרה כראוי, בצע ניתוח מחדש של אוכלוסיית היעד על-ידי מיון לפחות 100 תאי יעד לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש עם 100 מיקרוליטרים של מאגר כתמים.

FACS מנתח את התאים ממוינים על-ידי הקלטת המדגם ממוין ולוודא שהם בסופו של דבר בשער המיון. לאחר מכן להגדיר מיון לוח תא יחיד על ידי מרורכז את הירידה באר A1 בצלחת 96 היטב. כאשר הוא ממורכז, למיין 50 עד 106 חלקיקי מיקרומטר בכל הבארים סביב הקצה של צלחת ריקה 96 בארות כדי להבטיח כי כל הבארים יקבלו תא במרכז כל באר.

הסר את סרט ההיבקות מהצלחות. מיין תא יחיד של Lin-CD34 בתוספת CD38 מינוס תאים לתוך 92 מתוך 96 בארות. הפעל מיון אינדקס בתוכנת המיון FACS כדי לשמור את הפרופיל האימונופניוטיפיק עבור CD45RA, CD49F ו- CD90 עבור כל תא בודד.

מיין שתי בארות עם 10 ו- 20 תאים בהתאמה עבור פקדי ליניאריות בהגברת PCR. ולס H1 ו H2 משמשים בדרך כלל. שמור שתי בארות ללא תאים כמו אין פקדי תבנית, בדרך כלל בארות H3 ו H4. לאטום את הצלחות עם סרט דבק ברור ולסובב את הצלחות ב 300 פעמים כוח הכבידה במשך דקה אחת.

הצמד להקפיא את הצלחות על קרח יבש. ואז לאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. הפוך שעתוק ומגבר יעד ספציפי לערבב על ידי הוספת 632.5 microliters של תערובת תגובה פעמיים, 101.2 microliters Taq / SuperscriptIII, 151.8 מיקרוליטרים פריים לערבב, ו 0.7 microliters זינק בבקרה RNA.

Vortex הפתרון ולסובב אותו למטה כדי לאסוף את הנוזל בתחתית הצינור. שמור את התערובת על הקרח עד שהוא מוכן להתווסף לדגימה. לאחר מכן, להפשיר את צלחות לייסאט על קרח.

הוסף 8.75 מיקרוליטרים של שעתוק הפוך שהוכן בעבר ותערובת הגברה ספציפית של יעד ל-92 בארות, כולל ליניאריות וללא פקדי תבנית. הוסיפו 8.75 מיקרוליטרים ללא תערובת בקרת שעתוק הפוכה לארבעת הבירות הנותרות. לאחר מכן לאטום את הצלחות עם סרט דבק ברור ולסובב את הצלחות כדי לאסוף נוזל בתחתית.

בצע שעתוק הפוך והגברת יעד ספציפית על-ידי הפעלת הלוחית במכונת PCR בהתאם לתוכנית preamp. הכינו את צלחת הטעינה על ידי צינורות שלושה microliters של reagent טעינת הבדיקה לכל באר של צלחת 96 היטב. הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של כל פריימר ל בארות בודדות בצלחת הטעינה.

לאטום את הצלחת עם סרט דבק ולסובב אותו. לאחר סיבוב הצלחת, להכין את צלחת הדילול על ידי צינור שמונה microliters של מים חופשיים נוקלאז לתוך כל בארות של צלחת 96 היטב. מוסיפים שני מיקרוליטרים של דגימה מוגברת לצלחת הדילול.

לאטום את הצלחת עם סרט דבק. מערבבים על ידי מערבולת הצלחת במשך 10 שניות. ואז לסובב את הצלחת.

לאחר מכן, הכינו את תערובת הטעינה לדוגמה על ידי ערבוב זהיר של 352 מיקרוליטרים של תערובת אב עם 35.2 מיקרוליטרים של רגנט טעינה לדוגמה. הכן את צלחת הטעינה לדוגמה על ידי aliquoting 3.3 microliters של תערובת טעינה לכל באר של צלחת 96 היטב. הוסף 2.7 microliters מן המדגם מדולל לתוך כל באר של צלחת הטעינה מדגם.

לאטום את הצלחת עם סרט דבק ולסובב אותו. להוציא חדש 96 על ידי שבב microfluidic. הכינו את הדחפים על ידי דקירתם במזרק עם כובע כדי לוודא שניתן להזיז אותם.

מוסיפים את מלוא נפח המזרקים לכל שסתום תוך הטיית השבב ל-45 מעלות ולחיצה על השסתום. הקם את השבב באמצעות בקר IFC. לטעון כל מדף assay עם 4.25 microliters מכל בארות בצלחת הטעינה בדיקה ולהימנע בועות.

אם בועות מופיעות באר, הסר אותן עם קצה פיפטה. המשך לטעון כל מדף מדגם עם 4.25 מיקרוליטרים מכל אחת מה בארות בצלחת הטעינה לדוגמה, הימנעות בועות, ואם בועות מופיעות להסיר אותם עם קצה פיפטה. טען את השבב באמצעות בקר מעגל Fluidics המשולב או בקר IFC.

תבדקו השבב נראה שווה ושת כל התאים נטענו. הסר אבק מפני השטח של השבב על ידי נגיעה בו עם סרט הדבקה. לבסוף, הפעל את השבב בפלטפורמת ביטוי הגנים המיקרופלואידיים מולטיפלקס.

מפת חום של ריצה מוצלחת מציגה את הביטוי להתפשטות שווה על פני דגימות עם אות חזק של סביב שבעה עד 25 CTs. עקומת הגברה זו של RNA שליטה זינק מוודא כי כל הבארים יש ביטוי ברור של סביב 10 CT עם וריאציה מועטה עד ללא וריאציה, מאמת כי התגובות מראש הגברה qPCR היה מוצלח עבור כל התאים. ניתוח רכיבים עקרוניים או PCA אשר מדמיין את הדמיון בין קבוצות תאים באמצעות הפחתת ממדים יכול להיות שימושי כדי להבחין אשכולות של תאים שונים מולקולרית אחד מהשני כאן זיהוי ארבע קבוצות משנה.

כדי לזהות את האימונופנוטיפ של תאים מאשכולות מולקולריים שונים, טען את קובץ FCS של האינדקס לתוך FlowJo. פתח את עורך קבצי ה- Script והדבק את קובץ ה- Script של האינדקס, הקש Run. כל תא יהיה עכשיו בשער נפרד.

הוסף כל תא לתוך עורך הפריסה וצבע אותם בהתאם לקיבוץ המוגדר מולקולרית מ- SCXV הזמין בקובץ sample_complete_data.xls. עלילות FACS מציגות את ביטוי סמן פני התא עבור סמני תאי הגזע ההמוטופיטיים CD90 ו- CD45RA אשר ניתן להשתמש בהם כדי להפלות בין האשכולות ולבודד אותם לניתוח פונקציונלי. בעקבות הליך זה, טכניקה אחרת כמו רצף RNA של subpopulations שהתגלו לאחרונה או במבחנה וניסויים במבחנה ובויו ניתן לבצע כדי לענות על שאלה נוספת כמו איזה מנגנון מולקולרי גורם הטרוגניות זו וכיצד תת-התפקוד שונה מבחינה תפקודית.

אסטרטגיה זו סללה את הדרך לחוקרים לא רק לחקור את ההטרוגניות בהמוטופיסיס רגיל וממאאיר, אלא גם לשמש לבידוד פוטנציאלי של תת-התת-כפילויות שהתגלו כדי להמשיך לחקור אותן.