זיהוי ובידוד של Oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית ממח העצם העכבר

שיטה זו יכולה להיות מועילה עבור המטולוגים ואימונולוגים החוקרים את הייצור והתפקוד של תאים מיאלואידים, כולל נויטרופילים, מונוציטים ותאים דנדריטיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת זיהוי מדויק יותר של תת-קבוצות אב מיאלואידיות מאשר אסטרטגיות קודמות. כדי להעשיר את תאי מח העצם עבור אבות על ידי מיון תאים המופעל על ידי מגנטים, או MACS, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה והשעיה מחדש של הגלולה ב-40 מיקרוליטר של מאגר צביעה MACS לכל אחד כפול 10 לשבעת תאי מח העצם.

כדי לדלל תאים חיוביים לשושלת מובחנת, הוסף 10 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים ביוטין לכל אחד כפול 10 לשבעת התאים ולערבב על ידי פיפטינג למשך 10 דקות דגירה בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר צביעה לכל אחד כפול 10 לשבעת התאים עם ערבוב, ואחריו 20 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים אנטי-ביוטין לכל אחד כפול 10 לשבעת התאים. לאחר 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, שטפו את התאים עם מיליליטר אחד של מאגר צביעה לכל אחד כפול 10 לשבעת התאים והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר צביעה טרי עד פעם אחת כפול 10 לשמונת התאים.

לאחר מכן, הגדר את המפריד המגנטי האוטומטי בהתאם להוראות היצרן והנח את צינור התאים המסומנים במפריד. התחל את תוכנית הברירה השלילית כדי לאסוף את השבר השלילי המכיל את התאים השליליים המועשרים בשושלת האב. גלולה את התאים השליליים של השושלת על ידי צנטריפוגה והשעו מחדש את הגלולה, שכעת לבנה, בשני מיליליטר של מאגר צביעה לכל עכבר לספירה.

כדי לבודד את תאי האב המיאלואידים על ידי FACS, הוסף 1 פעמים 10 לתאים שליליים לשושלת החמישית לכל אחד משמונה צינורות מיקרו-צנטריפוגות בקרה לבחירת מתח ופיצוי צבע והוסף את שאר דגימת התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה תשיעי לצביעה עם כל שבעת הנוגדנים לסמן פני השטח המעניינים לזיהוי ומיון אבות. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה והשעיה מחדש את כדורי הבקרה ב-100 מיקרוליטר של מאגר צביעה FACS ואת גלולת הדגימה הניסיונית ב-100 מיקרוליטר של מאגר צביעה לכל חמישה כפול 10 לששת התאים. לאחר מכן, הוסף נוגדן אנטי-CD16/CD32 לצינור הצבע היחיד של קולטן הגמא Fc ולצינור הדגימה.

מערבולת בעדינות ודוגרת על הדגימות למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בתום הדגירה, הוסף את הנוגדנים האחרים לצינורות הכתם הבודדים המתאימים ולצינור הדגימה ולאחר מערבולת עדינה, דגר את הדגימות למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בתום הדגירה, הוסף 900 מיקרוליטר של מאגר צביעה לצינורות הבקרה ומיליליטר אחד של מאגר צביעה לכל אחד כפול 10 לשבעת התאים לצינור הדגימה לצנטריפוגה.

השעו מחדש את כדורי הבקרה ב-200 מיקרוליטר של מאגר צביעה טרי לכל שפופרת ואת כדור הניסוי ב-500 מיקרוליטר לכל 2.5 כפול 10 לשבעת התאים והעבירו את התאים המסומנים לצינורות FACS תואמים של חמישה מיליליטר. לאחר מכן הגדר את ציטומטר הזרימה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים והשתמש בפקדים הלא מוכתמים והמוכתמים הבודדים כדי להגדיר את המתחים ואת פיצויי הצבע. כדי לזהות ולבודד את תאי האב המיאלואידים, טען את דגימת התא הניסיוני על הציטומטר וצור אזור פיזור קדימה לעומת חלקת אזור פיזור צדדית, שער כדי לא לכלול את הפסולת והתאים המתים.

צור תרשים גובה פיזור קדימה לעומת רוחב פיזור קדימה של התאים החיים והשער כדי לא לכלול את הכפילים. חזור על תהליך זה עם גובה פיזור צדדי לעומת רוחב פיזור צדדי של סינגלי הפיזור קדימה והשער כדי לא לכלול את הכפילים. צור תרשים ושער Sca-1 לעומת c-Kit כדי לבחור את האבות השליליים החיוביים של C-Kit Sca-1.

לאחר מכן צור תרשים ושער של קולטן גמא CD-34 לעומת FC כדי לבחור את אוכלוסיות האב המיאלואיד המשותף המעורב ואת אוכלוסיות האב המעורבות של גרנולוציטים מונוציטים. חשוב לבודד את אוכלוסיות האב המיאלואיד המשותף המעורב והגרנולוציטים המעורבים בצורה מדויקת ככל האפשר. זה יכול להיות מועיל להשתמש בתרשים צפיפות צבע פסאודו-או בעלילת קווי מתאר לשער מדויק יותר.

השתמש בתאים בשער האב המיאלואיד המשותף המעורב כדי ליצור תרשים ושער CD115 לעומת Flt3 כדי לבחור את האב המיאלואיד הנפוץ Flt3 חיובי CD115 תאים נמוכים, האב המיאלואיד הנפוץ Flt3 שלילי CD115 תאים נמוכים, ואבות התאים הדנדריטיים החיוביים ל-Flt3 CD115 מונוציטים גבוהים. השתמש בתאים בשער האב המעורב של מונוציטים גרנולוציטים כדי ליצור תרשים ושער של קולטן גמא Ly6C לעומת FC כדי לבחור את התאים השליליים Ly6C ואת התאים החיוביים של Ly6C. לאחר מכן צור תרשים CD115 לעומת Flt3 עבור כל תת-אוכלוסיית תאי אב מונוציטים מעורבים מגודרים ושער את אבות המונוציטים השליליים של Ly6C שליליים Flt3 CD115, אבות מונוציטים נמוכים של גרנולוציטים חיוביים Ly6C שליליים Flt3 CD115, ואבות אבות מונוציטים גבוהים של Ly6C חיובי Flt3 שלילי CD115

דלדול שושלת מקסימלית יעיל בדלדול תאים ממוינים ולהעשרת תאי האב החיוביים c-Kit. השבר השלילי של השושלת עדיין מכיל כמה תאים שליליים c-Kit, אך תאים אלה יסולקו בשלבי שער ציטומטריית הזרימה הבאים. תפוקת האב לאחר מיון FACS יכולה להשתנות בהתאם להגדרות הממיין המשמשות, אך אמור להיות אפשרי להשיג בין אחד לארבעה כפול 10 עד תא רביעי לכל שבר מכל עכבר עם טוהר לאחר המיון של יותר מ-95% עבור כל שבר.

צביעה טובה היא קריטית להפרדה נקייה של האוכלוסיות. ייתכן שתצטרך לטטר את הנוגדנים או לבחור פלואורופורים שונים כדי להבטיח הפרדה אופטימלית. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות תאי אב כדי להעריך הבדלים בהרכב מח העצם בין דגימות, לבודד אבות לניתוח מולקולרי או להעריך את יכולתם לייצר תאים מיאלואידים.