דיסקציה של משפר תפקוד באמצעות הפרעות משפר מבוססי CRISPR מולטיפלקס בשורות תא

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגנומיקה והוויסות של גנים, כגון כיצד אזורי ויסות גנים מרובים, הידועים גם כמשפרים, פועלים יחד כדי לשלוט בשעתוק. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבדוק מספר משפרים ליד מספר גנים שונים בו זמנית על מנת לזהות במהירות אזורים המעורבים בוויסות גנים. כדי להתחיל בתכנון RNA מדריך, צור תחילה רצפי DNA כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

השתמש בתוכנה כגון E-CRISP על רצפי ה-DNA שנוצרו כדי למצוא RNA מנחה עם יעדים נמוכים. רנ"א מנחה מורכב מ-20 נוקלאוטידים במעלה הזרם של מוטיב סמוך לפרוטו-ספייסר, שלובש צורה של NGG עבור ה-dCas9 מ-S.pyogenes. באתר E-CRISP, בחר את האורגניזם המעניין באמצעות התפריט הנפתח.

מכלול הגנום מופיע מימין לשם המין. בחר בלחצן האפשרויות קלט הוא רצף FASTA. העתק את רצפי ה- FASTA מלמעלה והדבק אותם בתיבת הדו-שיח.

ודא שכותרת FASTA כלולה עבור כל רצף. בחר את לחצן האפשרויות הבינוני ואת העיצוב היחיד בתפריט הנפתח. לחץ על הכפתור התחל חיפוש gRNA יחיד.

כרטיסיית דפדפן חדשה תיפתח והתוצאות יוצגו. הורד את רצפי המועמדים על ידי לחיצה על הכפתור, הורד דוח טבלאי מנוסח Excel עבור כל רצפי השאילתות יחד. לאחר מכן, השתמש בדפדפן הגנום של UCSC כדי להגיש מועמדות לרצפי RNA באורך מלא לגנום.

בדפדפן, נווט אל אתר דפדפן הגנום של UCSC. תחת הקטע הכלים שלנו, אתר את המילה BLAT ולחץ עליה. כלי החיפוש BLAT ייפתח.

השתמש בתפריטים הנפתחים הממוקמים מתחת לטקסט גנום החיפוש של BLAT כדי לבחור את האורגניזם ואת מכלול הגנום המעניינים. העתק את רצפי ה-RNA המנחה מהדוח הטבלאי שנוצר על ידי E-CRISP והדבק אותם בתיבת הדו-שיח. ודא שלכל רצף יש כותרת FASTA ייחודית ולאחר מכן לחץ על שלח בתחתית תיבת הדו-שיח.

בדף תוצאות החיפוש של BLAT, יופיעו יישורים של כל רצף RNA מדריך, כאשר כל קו מייצג יישור. באופן אידיאלי, צריכה להיות יישור אחד לכל RNA מנחה, המציין את הייחודיות של אותו RNA מנחה. הימנעו ממדריכים הממופים למיקומים מרובים בגנום, במידת האפשר.

כדי לבחון לוקליזציה והפצה של RNA מדריך באזור העניין, לחץ על קישור הדפדפן תחת סעיף הפעולות עבור אחד מ-RNA המדריך שנשאל. דפדפן הגנום יופיע, ויתרכז ב-RNA המדריך שנבחר. השתמש בלחצני התרחקות בחלק העליון של הדף כדי להמחיש את ההתפלגות של RNA מנחים אחרים שזוהו על ידי E-CRISP באזור העניין.

בחר ארבעה, רצוי לא חופפים, RNA מנחים המפוזרים ברחבי אזור העניין. אם אזור העניין עולה על 600 זוגות בסיסים, שקול להוסיף קו יישור אחד או שניים נוספים. הימנע מ-RNA מנחה עם מתיחות הומופולימריות, ותכולת GC קיצונית, מכיוון שתכונות אלו עלולות לעכב את תהליך שיבוט ה-RNA המנחה ולהפחית את יעילות מיקוד ה-RNA המדריך.

להרכיב מחדש אוליגוס RNA מנחה בריכוז סופי של 100 מיקרומולר במים טהורים במיוחד. צריכים להיות לפחות ארבעה אוליגואים נפרדים של RNA לכל אזור עניין. עבור כל אזור עניין רגולטורי, צור מאגר של כל האוליגו המתאים לאזור העניין.

בשפופרת אפנדורף, שלב חמישה מיקרוליטרים של כל אוליגו RNA מנחה משוחזר בודד עבור כל אזור. מערבבים היטב את הבריכה על ידי מערבולת, ואז מסירים מיקרוליטר אחד ומדללים את ה-1 עד 200 הזה במים טהורים במיוחד. בצע PCR קצר עם פריימרים של USICS כדי להצמיד אזורי הומולוגיה לאוליגו כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

כ-40 בסיסים יתווספו לכל אוליגו, ויניבו כ-100 תוצר זוגות בסיסים המכיל הומולוגיה מספקת לרוח הרפאים של USIC בשני הקצוות. לאחר מכן, הגדר את תגובות גיבסון אסיפה על קרח. השתמש ב-50 ננוגרם של הווקטור המעוכל ובשבעה ננוגרם של התוסף בתגובה של 20 מיקרוליטר.

כמו כן, הגדר תגובת גיבסון הרכבה וקטורית בלבד באמצעות 50 ננוגרם של הווקטור, והחלפת התוספת במים. דגירה על תגובות גיבסון אסמבל למשך 15 דקות ב-50 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן עצירה ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר העברת המוצרים המורכבים לקרח, יש לדלל אותם 1 עד 4 במים טהורים במיוחד על קרח.

לדוגמה, הוסף חמישה מיקרוליטר של מוצר הרכבה של גיבסון ל -15 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד. לאחר מכן, הפוך את מוצרי ההרכבה המדוללים של גיבסון. ליפול תאים מוכשרים בעלי יעילות גבוהה על קרח, וליצור 25 מיקרוליטר רהוט לכל טרנספורמציה.

אם רצוי מאגר מורכב המכוון למספר אתרים, נפל מספיק תאים לצינורות שונים כדי לבצע טרנספורמציות עצמאיות מרובות. צלחת 50 מיקרוליטר מהתאים שעברו טרנספורמציה, והניחו את הצלחות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למיני-הכנה של המאגרים המכוונים לאתרים בודדים, הניחו את התאים ישירות בשלושה עד חמישה מיליליטר של מרק LB המכיל אמפיצילין או קרבניצילין.

דגרו על התאים למשך הלילה עם טלטול ב-250 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס. עבור ספריות גדולות, השתמש במגרד צלחות כדי לאסוף את כל המושבות מכל צלחת בודדת להכנה מקסימית אחת. ניתן להקל על כך על ידי שפיכת כחמישה מיליליטר של LB עם האנטיביוטיקה המתאימה לתוך שפופרת פלקון של 15 מיליליטר, וגירוד המושבות לתוך הצינור.

יום לפני הטרנספקציה, צלחת את התאים בצלחת של 24 בארות, במפגש של 30 עד 50%. צלחת מספיק תאים כך שניתן לבצע טרנספקציות בשכפול, ולכלול בארות להעברה עם RNA מדריך בקרה. ודא שהתאים מפוזרים באופן שווה על פני הבאר, על ידי ניעור עדין של הצלחת לאחר ציפוי התאים.

יש לנער כל חמש דקות ב-15 הדקות הראשונות. למחרת, הכינו טרנספקציות לפי ההוראות של מגיב הטרנספקציה לבחירתכם. עבור תאי אישיקאווה, השתמש ב-550 ננוגרם של פלסמיד כולל עבור כל באר של צלחת של 24 בארות.

מדללים את הפלסמידים לריכוז סופי של 020 מיקרוגרם למיליליטר במדיה נטולת סרום. השתמש בשלושה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה עבור כל מיקרוגרם אחד של DNA, מערבול בעדינות ודגירה במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר. מוסיפים 25 מיקרוליטר מהתערובת הסופית לכל באר.

הכן נפח מספיק של מאגר ליזה עם 1% בטא-מרקפטואתנול. שאפו את המדיה באמצעות שואב ואקום. שטפו את התאים פעם אחת בנפח שווה של 1x PBS, ושאפו להסיר כמה שיותר PBS.

הוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת ה-BME של הליזיס לכל באר, באמצעות פיפטה רב-ערוצית. הזרימו את תמיסת הליזיס למעלה ולמטה שמונה עד עשר פעמים, והעבירו לצלחת באר עמוקה או צינורות אפנדורף של 1.7 מיליליטר על קרח. ניתן להפיק RNA באופן מיידי, או להקפיא ליזטים במינוס 80 מעלות צלזיוס לעיבוד עתידי.

עיצובי RNA מנחים מוצגים עבור שלושת אתרי הקישור של גורמי השעתוק ליד MMP17. אזור היעד הוא אתר הקישור ל-ER alpha כפי שהוגדר על ידי ChiP-seq, וארבעת ה-RNA המנחים אריחים על פני אזור זה. מוצג כאן תוצר ה-RNA המנחה הצפוי לאחר PCR קצר, תוך שימוש בפריימרים הפנימיים של USIC.

התגובה תוסיף 20 זוגות בסיסים של רצף לכל קצה של שבר ה-RNA המנחה של 59 זוגות הבסיסים, וכתוצאה מכך רצף של כ-100 זוגות בסיסים. מוצגות תוצאות PCR איכותיות מניסוי Enhancer-I ב-MMP17. אתרים הממוקדים על ידי Enhancer-I מסומנים במשושה שחור.

אתרים 1 ו-2 נחוצים לתגובה אסטרוגנית מלאה של MMP17, בעוד שאתר 3 אינו תורם. אתר 1 יכול לתרום ביטוי כלשהו בפני עצמו, אך הפעילות הגדולה ביותר נראית כאשר אתרים 1 ו-2 פעילים. לאחר אופטימיזציה לקו התאים המעניין, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמישה עד שבעה ימים, אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לתכנן RNA מנחה עבור Enhancer-I, ליצור ולהעביר מאגרים מורכבים של RNAs מנחים ולקצור תאים שעברו טרנספטציה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על סביבת תרבית רקמות סטרילית, ולהשתמש בחומרים נטולי RNase ו-DNase. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כמו ChiP-seq ו-RNA-seq, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון היכן בגנום Enhancer-I נקשר, וכיצד הוא משפיע על ביטוי הגנים העולמי.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור את ויסות הגנים המושרה על ידי אסטרוגן בלוקוסים אנדוגניים בגנום האנושי, במקום להשתמש במדווחים אפיזומליים. אל תשכח שעבודה במסגרות תרבית רקמות יונקים עלולה להיות מסוכנת, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי, בעת ביצוע הליך זה.