Name: ניטור היפו איתות לשביל פעילות באמצעות ביוסנסור משתיק קול (באמת) מבוסס-לוציפראז הגידול גדול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: חקור פעילות קינאז LATS במסלול Hippo באמצעות ביוסנסור מבוסס לוציפראז. שיטה זו מציעה רגישות גבוהה ויכולת עיבוד מקבילי של דגימות רבות למחקר בסיסי ותרגומי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ קנדי המכון לבריאות למחקר (CIHR #119325, 148629), את קנדי השד סרטן הקרן (CBCF) כדי XY. TA נתמך על ידי את המלגה לתואר שני של קנדה וניהר הבינלאומי אונטריו המלגה לתואר שני. HJJVR נתמך על ידי המלכה אליזבת השנייה במלגה ללימודי תואר שני במדע וטכנולוגיה.

1. חקירת מווסת בשם של היפו איתות באמצעות השרירים-BS
<ol><li>
ציפוי, תרביות תאים תאים
	<ol>
<li>הכנת תרבית תאים<ol>
<li>חמים 1 x PBS, DMEM המכיל 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 0.25% טריפסין-EDTA עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים במשך כ 30 דקות.</li>
			<li>ניקוי יסודי ארון אבטחה עם 70% אתנול.</li>
			<li>הצב תרביות רקמה מנות, פיפטות פסטר, פיפטות סרולוגית, טיפים פיפטה וחטף תרביות רקמה כנדרש.</li>
			<li>להוציא 1 x PBS, התקשורת, טריפסין-EDTA מהאמבטיה מים, לנקות אותם עם 70% אתנול, והציבו אותם בשכונה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>תחזוקה, ציפוי של התאים עבור תרביות תאים<ol>
<li>לבחור קו תא ביעילות גבוהה תרביות תאים (למשל, HEK293) עבור הניסוי. בדוק עבור הביטוי מרכיבים מסלול היפו בשורה זו התא על ידי תספיג כדי לוודא היפו איתות פעילה.</li>
			<li>לגדל תאים HEK293 DMEM ב- 10 ס מ פטרי באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2. נטר את התאים במיקרוסקופ כל יום. המעבר את התאים כפי שמתואר להלן, כאשר 80-90% confluency נצפית.</li>
			<li>לשטוף את התאים על ידי הוספת 5 מ של PBS 1 x לתוך צלחת, מתערבל בעדינות את הצלחת וכ רפה בעברית התקשורת לחלוטין.</li>
			<li>להוסיף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA לצלחת. מערבולת את הצלחת על מנת להבטיח טריפסין מכסה באופן שווה את התאים.</li>
			<li>דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב CO2 החממה במשך 5 דקות או עד כל התאים הם צמודי קרקע.</li>
			<li>להוסיף 4 מ"ל של מדיה (עם 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין) לנטרל את טריפסין, resuspend את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים, וכן לוותר על עשירית (0.5 מ"ל) של התאים חדשים לוחות 100 מ מ (עבור העברת יחס של 1:10) המכיל 9.5 מ ל התקשורת מלאה.</li>
			<li>עבור השרירים-BS תרביות תאים, לספור את התאים באמצעות תאי 2 x 105 hemocytometer וצלחת לתוך כל טוב של צלחת 12-ובכן 24 שעות לפני תרביות תאים. הערה: באמצעות מספרי הטלפון הנייד גבוה יותר עשוי להגביר את האות רקע זוהרים כמו היפופוטם איתות פעילות מוסדר על ידי תא confluency. באמצעות מספרי הטלפון הנייד נמוך עשוי להגביר את רגישות תא תרביות תאים ריאגנטים ולהגדיל תא מוות24.</li>
		</ol>
</li>
		<li>תרביות תאים של השרירים-BS לבד או יחד עם הגן המועמד<ol>
<li>Miniprep השרירים-BS פלסמידים (NLuc-YAP15-pcDNA3.1-Hygro ו- 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) טרי מן DH5a חיידקים תרבית נוזלית (הכרחי להשגת ביטוי נצמדתי-BS האופטימלי).</li>
			<li>h 1 לפני תרביות תאים, תשאף המדיום מהצלחת, להוסיף 500 µL של מדיום הגידול מלאה כל טוב של הלוחות 12-ובכן, לחזור התאים החממה. הערה: פרוטוקול הבאים מתאר שיטות תרביות תאים באמצעות תגובה כימית תקנים מבוסס פולימר זמינים מסחרית. ריאגנטים תרביות תאים אחרים יכול להיות גם מתאים תקנים; עם זאת, לא כבר בדקנו אותם.</li>
			<li>להפוך פתרונות A ו- B כפי שמתואר בטבלה 1. עבור N transfections, לבצע (N + 0.5) x premix פתרון B.</li>
			<li>מיד להוסיף תקנים מבוסס פולימר מדולל הכימית (פתרון B) ה-DNA (פתרון A). פיפטה מעלה מטה בעדינות לערבב.</li>
			<li>דגירה המדגם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לאפשר תקנים מתחמי לטופס.</li>
			<li>הוסף את הנפח הכולל (76 µL) של תרביות תאים מתחמי dropwise כל טוב של 12-ובכן לצלחת עם מתערבל עדין.</li>
			<li>דגירה התאים בין לילה (18 – 24 h) ב 37 º C. הערה: עבור תאים הרגישים ריאגנטים מבוסס פולימר תרביות תאים, זמן הדגירה יכול להיות מופחת על 5 שעות.</li>
			<li>יום אחרי תרביות תאים, מסיר את המדיה תרביות תאים המכיל קומפלקס ולהחליף אותו עם מדיה מלאה טריים. התרבות התאים ב 37 ° C ליום אחר לביצוע לוציפראז וזמינותו.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לוציפראז assay הערה: כתב לוציפראז Assay המערכת מזהה גחלילית ו Renilla יחד assay אחד משמש את מבחני לוציפראז. אם לא שימש Renilla בקרה פנימית, לבצע צעד אחד לוציפראז assay על-ידי הוספת LARII ללא הוספת ריאגנט לזיהוי של Renilla .<ol>
<li>הכנת lysates תא<ol>
<li>לדלל 5 מאגר פירוק פסיבי x (PLB) עם מים מזוקקים כדלקמן:</li>
			<li>הנפח הכולל של 1 x PLB נדרש = N x (50 μL של 5 x PLB) + 200 μL של dH2O = N x 250 μL 1 x PLB לכל טוב של הלוחות 12-טוב (N = מספר דוגמאות).</li>
			<li>האחות התקשורת לחלוטין. להוסיף 1 מ"ל של 1 x PBS כל טוב. מערבולת את הצלחת בעדינות כדי להסיר מנותק תאים צמיחה שיורית מדיה. האחות של PBS 1 x לחלוטין. ודא 1 שיורית x PBS שרידים לפני התוספת של 1 x PLB.</li>
			<li>להוסיף 250 μL 1 x PLB/טוב.</li>
			<li>מניחים את הצלחות תרבות על פלטפורמה נדנדה עם נדנדה עדין כדי להבטיח כיסוי מוחלט ואפילו של טפט התא עם 1 x PLB. רוק הלוחות התרבות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לאפשר לתאים lyse.</li>
			<li>להעביר את lysate אל צינור microcentrifuge 1.5 mL.</li>
		</ol>
</li>
		<li>מדידת האות זוהרים<ol>
<li>להוציא את LARII (20 μL לדוגמה) מ- 80 ° C, equilibrate אותו לטמפרטורת החדר.</li>
			<li>להתכונן ריאגנט לזיהוי Renilla N מבחני: להוסיף (N + 1) x 0.4 μL של 50 x המצע (N + 1) x 19.6 μL של המאגר שלו.</li>
			<li>Predispense 10 μL של כל תא lysate אל צינורות 1.5-mL.</li>
			<li>תוכנית של luminometer כדי לבצע עיכוב 2-s premeasurement, ואחריו נקודה מדידה 10-s עבור כל assay לוציפראז כפול. הערה: המדידות הראשון והשני להיות המייצגים את האות נצמדתי-BS, האות בקרה פנימית Renilla , בהתאמה. ניתן להשתמש בכל luminometer תואם לוציפראז יחידה או כפולה.</li>
			<li>להעביר בזהירות μL 20 של ריאגנט LARII לתוך שפופרת אחת, במהירות פיפטה לאורך 3 x כדי לערבב את הכל.</li>
			<li>מיד למקם את הצינור luminometer וליזום את הקריאה.</li>
			<li>להסיר את הצינור מדגם luminometer, מיד להוסיף 20 μL של ריאגנט Renilla ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה 3 x. מביאים את הדגימה luminometer וליזום את הקריאה הבאה. להקליט את המידות.</li>
			<li>למחוק את הצינור התגובה והמשך הדוגמה הבאה.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. מסך כדי לזהות היפו מסלול הרגולטורים באמצעות השרירים-BS
<ol><li>
תרבית תאים ו- transfections
	<ol>
<li>תרבות HEK293AD תאים כמתואר בסעיף 1.1. הערה: HEK293AD הוא חסיד יותר מאשר שורות תאים אחרים HEK293, מה שהופך אותו קו תא טוב עבור שימוש במסכים.</li>
		<li>ניתוק התאים כמתואר בסעיף 1.1.2. לספור, לוחית רישוי 2 x 106 תאים ב- 100 מ מ לוחות 24 שעות לפני תרביות תאים.</li>
		<li>h 1 לפני תרביות תאים, תשאף התקשורת מהצלחת והחלף אותם 5 מ של צמיחה מלאה טריים מדיה.</li>
		<li>להפוך פתרונות A ו- B כפי שמתואר בטבלה 2.</li>
		<li>מיד להוסיף תקנים מבוסס פולימר מדולל הכימית (פתרון B) ה-DNA (פתרון A). פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.</li>
		<li>דגירה המדגם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לאפשר תקנים מתחמי לטופס.<ol>
<li>להוסיף את הנפח הכולל (500 µL) של תרביות תאים מתחמי dropwise לתאים עם מתערבל עדין.</li>
			<li>דגירה התאים בן לילה ב 37 º C.</li>
			<li>למחרת, trypsinize ולספור את התאים. צלחת עונה 1 פרק 104 2 x 104 תאים לתוך כל טוב של צלחת 96-ובכן בהנפח הכולל של 100 µL של המדיה לכל טוב. דגירה ליום אחר.</li>
		</ol>
</li>
		<li>למחרת, להוסיף מולקולות סוכנים/קטן להסדרת מסלול היפו-ריכוז 10 מיקרומטר, כדי כל טוב, 1 – 4 h לפני ביצוע וזמינותו לוציפראז הסופי. הערה: עבור מולקולות קטנות ביותר/סוכנים, טיפול 4 h ב- 10 מיקרומטר אינו משפיע על התא הכדאיות. אם ריכוז נמוך, יורחב הטיפול לתקופה ארוכה יותר של זמן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לוציפראז assay
	<ol>
<li>
במבחנה לוציפראז assay<ol>
<li>האחות המדיה מן התאים לחלוטין. לשטוף את התאים עם µL 100 ל- PBS x 1 היטב בכל. מחוק לגמרי לגמרי.</li>
			<li>הוסף 20 µL 1 x PLB (להכין כשלב שמתואר 1.2.1.1) לתוך כל טוב של הלוחות 96-ובכן.</li>
			<li>מניחים את הצלחות תרבות על פלטפורמה נדנדה עם נדנדה עדין בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.</li>
			<li>העברת µL 20 של ריאגנט LARII לבאר כל ובזהירות פיפטה לאורך 3 x לערבב.</li>
			<li>מיד למקם את הצלחת luminometer לקריאת צלחת וליזום את הקריאה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>חיים תא לוציפראז assay<ol>
<li>מרוויחה 11 x D-luciferin המניות כדלקמן: להמיס 1.5 מ ג של אבקת D-luciferin ב 1 מ"ל של מדיה תרבות נורמליים.</li>
			<li>העברת 10 µL של 11 x D-luciferin לתוך כל טוב ומערבבים בעדינות עם התקשורת אשר כבר נמצאת הבאר.</li>
			<li>להחליף את התאים לתוך החממה למשך 10 דקות.</li>
			<li>הכנס את הצלחת luminometer וליזום את הקריאה. הערה: אם עוצמת האות אינה חזקה מספיק בריכוז זה של D-luciferin, ניתן להוסיף עוד 10 µL של המניה D-luciferin לתאים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+warts+encodes+a+homolog+of+human+myotonic+dystrophy+kinase+and+is+required+for+the+control+of+cell+shape+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation.</a> Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).</li>
<li>Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+tumor+suppressors+in+genetic+mosaics%3A+the+Drosophila+lats+gene+encodes+a+putative+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase.</a> Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).</li>
<li>Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+Pathway%3A+Immunity+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">The Hippo Pathway: Immunity and Cancer.</a> Cancers. 10 (4), 94(2018).</li>
<li>Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+normal+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in normal development and cancer.</a> Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).</li>
<li>van Rensburg, H. J. J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+the+Hippo+pathway+in+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis.</a> Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).</li>
<li>Yeung, B., Yu, J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+Hippo+pathway+in+lung+development+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis.</a> International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).</li>
<li>Zhao, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+chemotherapeutic+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance.</a> International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).</li>
<li>Yu, F. -X., Guan, K. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway%3A+regulators+and+regulations%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway: regulators and regulations.</a> Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).</li>
<li>Yang, X., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+size+control+in+development+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of size control in development and human diseases.</a> Cell Research. 21 (5), 715(2011).</li>
<li>Visser, S., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LATS+tumor+suppressor%3A+a+new+governor+of+cellular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis.</a> Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+YAP+oncoprotein+by+the+Hippo+pathway+is+involved+in+cell+contact+inhibition+and+tissue+growth+control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control.</a> Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).</li>
<li>Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+LATS1+is+a+negative+regulator+of+oncogene+YAP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).</li>
<li>Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+Luciferase+as+an+Optical+Probe+for+Detecting+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Interactions+in+Mammalian+Cells+Based+on+Protein+Splicing.+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein.</a> Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).</li>
<li>Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+oligomer+formation+of+amyloid-%CE%B2+peptide+using+a+split-luciferase+complementation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).</li>
<li>Decock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+by+a+highly+sensitive+split+luciferase+assay+of+the+regions+involved+in+APP+dimerization+and+its+impact+on+processing%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing.</a> FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).</li>
<li>Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillation+of+apoptosome+formation+through+assembly+of+truncated+Apaf-1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1.</a> European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).</li>
<li>Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid%2C+a+powerful+tool+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li>
<li>Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).</li>
<li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).</li>
<li>Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-luciferase+complementary+assay%3A+applications%2C+recent+developments%2C+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).</li>
<li>Hu, C. -D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li>
<li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).</li>
<li>Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+library+screening+for+developing+an+improved+split-firefly+luciferase+fragment-assisted+complementation+system+for+studying+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions.</a> Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+LATS+biosensor+screen+identifies+VEGFR+as+a+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis.</a> Nature Communications. 9 (1), 1061(2018).</li>
<li>Moroishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+YAP%2FTAZ-induced+feedback+mechanism+regulates+Hippo+pathway+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis.</a> Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ואילו השביל היפו משחק תפקידים חיוניים תהליכים ביולוגיים שונים, ומוביל dysregulation של הנתיב היפו סרטן6, איך מסלול היפו מוסדר בתגובה לגירויים שונים אינה מובנת לחלוטין. בנוסף, חלה לא כמותית ומערכת בזמן אמת כדי להעריך את הפעילות של רכיבי הליבה היפו. לאחרונה, אנחנו פיתח ואומת על ביוסנסור הרומן למדידת פעילות קינאז נצמדתי מסלול היפו24. ביוסנסור הזה יכול לשמש לא רק לניטור באופן כמותי ומדויק היפו איתות פעילות בתאים חיים, אלא גם עבור מסכי של שהתרופות המתוות מסלול היפו לטיפול בסרטן....

ההיפופוטם איתות לשביל זוהה לראשונה בדרוזופילה כרגולטור הרומן של צמיחת תאים ושל בעלי חיים בגודל1,2. מאז גילויו הראשונית, הרכבה ראיות בצורה משכנעת הראו כי מסלול היפו משחק תפקידים חיוניים לפיתוח (למשל, התפתחות עוברית מוקדמת, בקרת גודל האיבר, תלת-ממדית [תלת-ממד] מורפולוגיה), tumorigenesis ( למשל, התפתחות גידולים, גרורות, אנגיוגנזה, התחמקות המערכת החיסונית, אי יציבות גנומית, תגובת המתח, עמידות לתרופות), והומאוסטזיס רקמות (למשל, חידוש תאי גזע, בידול, התחדשות רקמות לאחר פציעה) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. היפו איתות לעתים קרובות הוא dysregulated שונים סרטן7,8,9,10,11,12. לכן, שחקרתי פונקציות של מסלול היפו סרטן ביולוגיה ו הרפוי ורפואה רגנרטיבית הפך אחד האזורים החמים ביותר בתחום המחקר הביו-רפואי.
באופן קצר, בשביל היפו, בעת הפעלת ועדות נגד הזרם (למשל, תא-תא מגע, מזין דחק (סטרס) מטריצה חוץ-תאית [ECM]), MST1/2 (MST; homologs בתרבית של היפו דרוזופילה ) סרין/תראונין (S/T) kinases phosphorylate/להפעיל מתאם חלבונים hMOB1 ואת WW45, כמו גם kinases LATS1/2 (באמת), אשר, לאחר מכן, phosphorylate activator תעתיק שיתוף הפה, paralog שלה, טאז-HX(H/R/K)XX(S/T) שנשמרת (H, היסטידין; R, ארגינין; K, ליזין; S, סרין; T, תראונין; X, כל חומצות אמינו) מוטיבים, כולל11,הפה-S127 ו TAZ-S8912. S127 phosphorylated הפה (הפה-pS127), טאז S89-phosphorylated (טאז-pS89) הם נפגמים בשל ubiquitination או לאגד חלבון cytoplasmic 14-3-3, תימנע אינטראקציה עם גורמי שעתוק TEAD1-4 בגרעין כדי transactivate במורד הנהר גנים המעורבים התפשטות תאים, אפופטוזיס (איור 1). למרות האינטרס מסלול היפו עצומה, קיימים כמה כלים למדידת היפו איתות ואלו היו מוגבלים מבחינה היסטורית כתבים של פלט תעתיק הפה/טאז/TEAD. אכן, עד ממש לאחרונה, היו אין כלים למדידת את הדינמיקה ואת הפעילות של ההיפופוטם איתות רכיבים באופן כמותי, בזמן אמת, תפוקה גבוהה, לא פולשנית גם במבחנה וגם בתוך vivo.
בהתחשב שלנו מתעוררים הבנה של התפקיד של אינטראקציות חלבון פיזיולוגיה, פתולוגיה, יש עניין רב בפיתוח של כלים שבהם ניתן להשתמש כדי ללמוד אינטראקציות אלה באופן כמותי, בזמן אמת13, 14,15,16. אכן, חלה התקדמות משמעותית בפיתוח של אסטרטגיות ביו-אנליטית, כולל שמרים 2-היברידית (Y2H)17, משטח פלזמון תהודה (SPR)18ו פורסטר תהודה אנרגיה העברה (סריג)19 מבחני, להערכת אינטראקציות חלבון חלבון. עם זאת, גישות אלה נושאים המגבלה של דרישת אופטימיזציה משמעותית כיוון הכתב, כך מבנים רבים חייבים להיבדק כדי למצוא יעיל. עוד, גישות אלה יש גם יחס אות לרעש נמוכה יחסית, כך אניני טעם איתות חיובי אמיתי עשויה להיות מאתגרת.
חלבון קומפלמנטציה מבחני פותחו כדי להתגבר על מגבלות אלה. הדור הראשון של חלבון קומפלמנטציה מבחני התבססה על פיצול פלורסצנטיות ססגוניות חלבונים, לא יכלו לפתור את המגבלות הנ ל20. קרינה פלואורסצנטית ססגוניות חלבונים מורכבים של תחום אחד בלבד, ולכן קשה לפצל אותם שני קטעים יציב נפרד עם זיקה נמוכה, רעש רקע21. לאחר מכן, גחלילית לוציפראז מזוהה בתור מועמד חדש לשימוש בפיתוח מבחני קומפלמנטציה חלבון פיצול. בגישה זו, גחלילית לוציפראז מחולק שני קטעים (N-מסוף ו- C-מסוף לוציפראז [NLuc, CLuc]) עם כל שבר דבוקה חלבון המטרה של עניין. אם NLuc ואת CLuc מועברים אל תוך הקרבה על האינטראקציה של החלבונים שני היעד, פעילות לוציפראז הוא מחדש, אור זוהרים נוצר בנוכחות סובסטרט luciferin ו- ATP22. בשנת 2001, על ידי ביצוע הקרנה קומבינטורית באמצעות ספריה המכילה שברי NLuc ו- CLuc באתרים שונים גזורה מחוברים חלבונים עם linkers שונים, Paulmurugan ו- Gambhir באוניברסיטת סטנפורד פיתחה של אופטימיזציה של פיצול-גחלילית לוציפראז קומפלמנטציה פרגמנט בסיוע מערכת עבור אינטראקציות חלבון-חלבון23. במערכת זו, נחתך גחלילית לוציפראז-חומצת אמינו (aa) 398 כדי ליצור NLuc ו CLuc, אשר מחוברים שני חלבונים עניין באמצעות מקשר (linker) גמיש של שמונה שאריות גליצין, שני סרין ומשקעים.
שימוש בגישה דומה, לאחרונה פיתחנו נצמדתי חדשה-תואר BS מאת פיוזינג NLuc ל-15 aa של הפה סביב אתר זרחון נצמדתי-S127 (YAP15), CLuc עם 14-3-3. החלבון הפה באורך מלא היה לא רגיל, כדי למנוע בלבול אותות על ידי שינויים post-translational של הפה (למשל, זרחון על אתרים אחרים, ubiquitination) על ידי הרגולטורים במעלה אחרים. נצמדתי-BS שהוצגו כאן לא-פולשנית לנטר היפו איתות פעילות הן חוץ גופית בתוך תאים חיים והן ויוו עכברים20,24 (איור 2). כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט למדידת נצמדתי קינאז הפעילות במבחנה באמצעות השרירים-BS. ראשית, אנו מראים איך נצמדתי-BS יכול לשמש כדי לחקור את השפעת חלבונים overexpressed בפעילות השרירים. לאחר מכן, אנו מראים איך החיישן יכול לשמש כדי לפקח על הפעילות של השביל היפופוטם לאחר הטיפול עם סוכנים להסדרת מסלול היפו. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות ולאפיין איתות המסלולים או גירויים ויסות פעילות קינאז השרירים.

<table><tbody><tr><td><חזק>טריפסין-EDTA&nbsp; </חזק></td><td>Life Technologies</td><td>2520056</td><td>0.25%</td></tr><tr><td><חזק>סרום בקר עוברי (FBS)</חזק></td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td><חזק>DMEM</חזק></td><td>סיגמא</td><td>D6429-500 מ"ל</td><td>DMEM עם גלוקוז גבוה&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent&nbsp; </חזק></td><td>Signagen</td><td>SL100688.5</td><td></td></tr><tr><td><חזק>5x מאגר ליזה פסיבי</חזק></td><td>Promega</td><td>E194A</td><td>30 מ"ל</td></tr><tr><td><חזק>Dual-Glo&reg; מערכת בדיקת לוציפראז</חזק></td><td>Promega</td><td>E2940</td><td>ערכת 100 מ"ל</td></tr><tr><td><חזק>20/20 לומינומטר</חזק></td><td>טרנר ביוסיסטמס</td><td>998-2036</td><td>לומינומטר קורא צינור יחיד</td></tr><tr><td><חזק>GloMax&reg; נווט עם מזרקים כפולים</חזק></td><td>Promega</td><td>GM2010</td><td>96-בארות קורא צלחות לומינומטר</td></tr></tbody></table>

ניטור היפו איתות לשביל פעילות באמצעות ביוסנסור משתיק קול (באמת) מבוסס-לוציפראז הגידול גדול

Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor

ההיפופוטם איתות הוא מווסת ההכפלה של גודל איבר ויש לו תפקידים חשובים לביולוגיה סרטן ופיתוח. בשל האתגרים הטכניים, זה נשאר קשה להעריך את הפעילות של מסלול איתות זה ומפרשים בתוך הקשר הביולוגי. הספרות הקיימת על מדכאי גדולים (באמת) מסתמך על שיטות הינן איכותיות, לא יכול בקלות להיות קנה המידה להמציא להקרנה. לאחרונה, פיתחנו ביוסנסור מבוססי ביולומינסנציה כדי לפקח על הפעילות קינאז של רכיב מרכזי נצמדתי-a של המפל קינאז היפו. כאן, אנו מתארים את נהלי איך הזה ביוסנסור נצמדתי (השרירים-BS) יכול לשמש כדי לאפיין היפו מסלול הרגולטורים. ראשית, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור חוקרים את השפעת מועמד חלבונים overexpressed (למשל, VEGFR2) על פעילות השרירים באמצעות השרירים-BS. לאחר מכן, אנו מראים איך נצמדתי-BS יכול לשמש עבור מסך מעכבי קינאז בקנה מידה קטן. פרוטוקול זה יתכן כבניין יכול להיות קנה המידה-up כדי לבצע במסכים גדולים יותר, אשר ללא ספק יזהה הרגולטורים הרומן של הנתיב היפו.

נצמדתי-BS היה cotransfected עם גנים שונים כדי להעריך את השפעתם על פעילות השרירים (איור 3). בניסוי זה, שימש Renilla בקרה פנימית. הביטוי ארעית של הפה-5SA, צורה פעילה המכונן של הפה, גורם להגברת רמות של מטרות תעתיק הפה עלייה עוקבות נצמדתי פעילות קינאז דרך מסלול משוב הוקמה25. MST, activator במעלה הזרם של השרירים בשביל היפו (איור 1), גם מגביר את עוצמת האות ביוסנסור. עם זאת, ביטוי VEGFR, אשר מפעילה PI3K/...

כאן אנו מציגים ביוסנסור מבוססי לוציפראז לכמת את פעילות קינאז מדכאי גדולים (באמת)-קינאז המרכזית בההיפופוטם איתות. ביוסנסור הזה יש יישומים שונים ומגוונים במחקר בסיסי והתרגום שמטרתה לחקור היפו מסלול הרגולטורים במבחנה וב -vivo.

The Hippo signaling pathway is a conserved regulator of organ size and has important roles in the development and cancer biology. Due to technical ...

המעבדה שלי כבר לומדת את התפקיד של מסלול היפו בסרטן השד והריאות, ולאחרונה, פיתחנו biosensor הרומן כדי לפקח על פעילות איתות היפופוטם. שיטה זו יכולה לשמש כדי לענות על שאלות מפתח על רשתות איתות סלולרי, כגון כיצד מסלול היפו מגיב לגורמים וכיצד הוא מקיים אינטראקציה עם מסלולי איתות אחרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא הרגישות הגדולה שלה וגם את המספר הגדול של הדגימות ניתן לעבד במהירות ובו זמנית.טכניקה זו יש יישומים מגוונים במחקר בסיסי ותרגום כדי לחקור את הרגולטורים של מסלול איתות היפו הן במבחנה והן במבחנה. בתור התחלה, מיני הכנה LATS-BS plasmids טרי מתרבות נוזלית חיידקים DH5-אלפא. שעה לפני ההטעה, שאפו את המדיום מהצלחת, והוסיפו 500 מיקרוליטרים של צמיחה בינונית לכל באר.נקודה חשובה אחת היא כי BIOSENSor LATS חייב להיות מוכן טרי על מנת לקבל ביטוי מקסימלי ופעילות. כמו כן, מומלץ תמיד להשתמש ברגולטור במעלה הזרם של מסלול היפו, כגון MSD, כבקרה חיובית בעת ביצוע בדיקות לוציפראז. לאחר מכן, להחזיר את התאים לאנקובטור.לאחר מכן, הכינו פתרון א', פתרון דנ"א ופתרון ב', רהט דואלי המבוסס על פולימר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, מיד להוסיף פתרון B לפתרון A, בעדינות pipette למעלה ולמטה לערבב. הדגירה את המדגם בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לאפשר קומפלקסים transfection להיווצר.לאחר מכן מוסיפים את הנפח הכולל של קומפלקסים transfection טיפה חכם לכל באר של הצלחת עם מערבולת עדינה. דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, הסר את המדיה המכילה את ההטרמפקציה והחלף אותה במדיה שלמה ורעננה.ואז לתרבת את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ליום אחד יותר. מדללים כמות מתאימה של חיץ תזה פסיבי פי 5 עם מים מזוקקים. לאחר מכן, שאף לחלוטין את התקשורת מהצלחת.מוסיפים מיליליטר אחד של PBS לכל באר, ומערבבים את הצלחת בעדינות כדי להסיר תאים מנותקים ומדיית צמיחה שיורית. ואז שאף PBS לחלוטין. לאחר מכן, להוסיף 250 microliters של 1xPLB לכל באר.מניחים את צלחת התרבות על פלטפורמת נדנדה במשך 15 דקות כדי להבטיח כיסוי שווה של monolayer התא עם PLB. לאחר מכן, להעביר את lysate לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. מוציאים את ה-LAR-2 מאחסון של 80 מעלות צלזיוס, ומאיים אותו לטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הכינו את רניה לכמות מתאימה של תדהמה. הוסף את הריג'נט לזיהוי רנילה למצע 50x ואת המאגר שלו. לאחר מכן, מחלקים 10 מיקרוליטרים של כל תא lysate לתוך צינורות 1.5 מיליליטר.לאחר מכן, תכנת מד זוהר לביצוע השהיה של שתי שניות לפני המדידה, ולאחר מכן תקופת מדידה של 10 שניות. בזהירות, להעביר 20 microliters של LAR-2 reagent לתוך צינור אחד, במהירות פיפטה למעלה ולמטה לערבב. לאחר מכן, מיד למקם את הצינור בלומינומטר וליזום את הקריאה.לאחר הקריאה, להסיר את הצינור מדגם מן הזוהר, להוסיף 20 microliters של רנילה reagent, ו pipette למעלה ולמטה לערבב. לאחר מכן, מניחים את הדגימה בלומינומטר ויוזם את הקריאה הבאה. ראשית, תאי מודעות של תרבות, ניתוק, ספירה וצלחת HEK293 כמתואר בפרוטוקול הטקסט.ואז, שעה לפני ההתהפוכים, שאפו את התקשורת מהצלחת והחליפו אותה בחמישה מיליליטר של מדיה חדשה ומלאה. לבסוף, הוסיפו פתרון B מדולל לפתרון א', ו-pipette למעלה ולמטה כדי לערבב. לאחר מכן, הדגירה את המדגם בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות לפני הוספת הנפח הכולל של קומפלקסים transfection לצלחת, תוך מערבולת בעדינות.דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, נסה וספיר את התאים. צלחת 10, 000 עד 20, 000 תאים לתוך כל באר של צלחת 96 באר בנפח כולל של 100 microliters של מדיה לגם.לאחר מכן, הדגירה את התאים ליום אחד נוסף. שעה עד ארבע שעות לפני ביצוע בדיקה luciferase, להוסיף סוכנים פוטנציאל ויסות מסלול היפו, בריכוז סופי של 10 micromolar לכל באר. לאחר מכן, שאפו את המדיה לחלוטין מהתאים ושטפו את התאים בכל באר עם 100 מיקרוליטרים של PBS.לאחר מכן, להוסיף 20 microliters של PLB לכל באר. מניחים את צלחת התרבות על פלטפורמת נדנדה במשך 15 דקות. לאחר מכן, להעביר 20 microliters של LAR-2 reagent לכל באר של הצלחת, ואת פיפטה למעלה ולמטה לערבב.מיד לאחר מכן, מניחים את הצלחת לתוך לומינומטר קריאת צלחת וליזום את הקריאה. בחלק הראשון של פרוטוקול זה, LATS-BS היה cotransfected עם גנים שונים כדי להעריך את השפעתם על פעילות LATS קינאז. בפרוטוקול השני, LATS-BS נותב לתוך HEK293-Ad, והתאים הועברו לתוך לוחות 96 בארות.40 שעות לאחר ההמרה, התאים טופלו עם מולקולות קטנות ידועות שונות של איתות היפו, ואחריו משגיח לוציפראז. כאשר מפרשים את התוצאות של בדיקות אלה, יש לציין כי חלבונים וטיפולים תרופתיים עשויים להפעיל מסלולי משוב המשפיעים על פעילות biosensor. ניסויים נוספים יהיו נחוצים כדי לאשר מערכת יחסים בין המועמד לבין מסלול איתות היפופוטם.בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו כמותית בזמן אמת PCR, או כתם מערבי, ניתן להשתמש כדי לענות על שאלות נוספות על פעילות LATS קינאז. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הסרטן לחקור את הדינמיקה והפעילות של מסלול איתות LATS kinase והיפו בתהליכים ביולוגיים וביוכימיים רבים. אל תשכח כי תרופות להקרנה יכול להיות מסוכן מאוד, אמצעי זהירות מתאימים תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.

monitoring-hippo-signaling-pathway-activity-using-luciferase-based

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

שיטה אמינה עבור השתלת בלוציפראז-מתויג האדם ממאיר עצב היקפי נדן תאים סרטניים לתוך עצב השת של עכברים immunodeficient מתואר. השימוש הדמיה פליטת אור להפגין הקמת התקין של שתלי וקריטריונים גידול של הפרדה אקראית של בעלי חיים לקבוצות המחקר נדונות גם.

Orthotopic Xenografting של האדם בלוציפראז-Tagged ממאירה היקפיים נדן בתאי העצב גידול של In vivo בדיקה של סוכני המועמד טיפולית

שעוני יממה לתפקד בתוך תאים בודדים, כלומר, הם תאים אוטונומיים. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת מודלי שעון תא אוטונומי באמצעות טכנולוגיה לא פולשנית, לוציפראז מבוסס זמן אמת פליטת אור. תאי Reporter מספקים מערכות צייתניות, פונקציונליות מודל ללימוד ביולוגית יממה.

ניטור מקצבי Cell-אוטונומי יממת שעון של ביטוי גנים באמצעות כתבי פליטת האור לוציפראז

אנו מציגים שיטת סינון מהירה וזולה לזיהוי רגולטורים תעתיק באמצעות transfections רובוטית תפוקה גבוהה וassay בלוציפראז כפול זוהר תוצרת בית. פרוטוקול זה במהירות מייצר נתונים פונקציונליים Side-by-צד ישיר לאלפי גנים והוא שינוי בקלות למקד כל גן של עניין.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לבצע siRNA ממוקד מסך "ubiquitome" לזהות היוביקוויטין רומן ורגולטורים כמו היוביקוויטין של התגובה התאית בתיווך HIF1A להיפוקסיה. זה יכול להיות מותאם לכל מסלול ביולוגי שבו חזקה לקריאה מהפעילות העיתונאית היא זמינה.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

הדמית פליטת אור היא כלי ידוע לאיתור גידולים וגרורים, אבל כימות של התמונות האלה לעתים קרובות דורש חישובים מורכבים ומכשירים בפרט. אנו מתארים את שיטת luminoscore הקלה לשימוש, מבוסס על תנאי רכישה מדויקים, אין צורך בחישובים, ומאפשר ניטל גידול ותגובה לטיפול כדי להיות במעקב במודלים של עכברים.

פליטת אור מבוסס שיטת כימות גידול עבור התקדמות גידול ניטור שפעות טיפול מודלים לימפומה העכבר

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע מהירה בעלות נמוכה לוציפרראז בחני בתפוקה בינונית באמצעות העברת אינסולין מקושרת של גאוסיה לוציפראז כפרוקסי עבור הפרשת אינסולין מתאי בטא. ניתן לבצע את האפשרות עם מרבית קוראי הצלחות והפיפטות רב ערוצית.

מדידת הפרשת אינסולין יחסית באמצעות מחליף שכונתיות לוציפראז

תאי גזע/מחולל קדמון מציגים דינמיקה של ביטויים שונים של רכיבי איתות מדרגה שמובילים לתוצאות שונות של אירועי הסלולר. ביטוי דינמי כזה יכול להתגלות על ידי ניטור בזמן אמת, לא על ידי ניתוח סטטי, באמצעות מערכת הדמיה ביולומינציה רגישה מאוד המאפשרת ויזואליזציה של שינויים מהירים בביטויי גנים.

בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

כדי לזהות והרגולטורים הרומן של גורמי שעתוק, פיתחנו גישה למסך מסודר או לספריות RNAi ויראלי באמצעות שימוש כפול-לוציפראז מבוסס מבוססת הכתב. גישה זו מציעה דרך מהירה וזולה יחסית להקרין מאות מועמדים בניסוי אחד.

זיהוי של שעתוק מקדם ווסת באמצעות הקרנת תפוקה בינונית של ספריות מסודר וכתבת המבוססת על כפול-לוציפראז

כאן אנו מתארים שיטת ניטור לא פולשנית הכוללת לוציפראז וביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק בקווים שונים של תאי סרטן השד. פרוטוקול זה מספק טכניקה לניטור היווצרות גידולים והתיישבות גרורתית בזמן אמת בעכברים.

ניטור צמיחת סרטן השד והיווצרות מושבה גרורתית בעכברים באמצעות Bioluminescence

אתגר מרכזי בפיתוח טיפולים חדשים לסרטן ריאות כולל מידול המיקרו-סביבה של הגידול כאשר מחלה אזורית מתקדמת למחלה גרורתית. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה להקמת מודל סינגני אורתוטופי של סרטן ריאות המאפשר מעקב in vivo אחר המחלה לאורך זמן.

שיטה זעיר פולשנית ליצירת מודל עכבר אורתוטופי סינגני של סרטן ריאות

חקור פעילות קינאז LATS במסלול Hippo באמצעות ביוסנסור מבוסס לוציפראז. שיטה זו מציעה רגישות גבוהה ויכולת עיבוד מקבילי של דגימות רבות למחקר בסיסי ותרגומי.

ניטור היפו איתות לשביל פעילות באמצעות ביוסנסור משתיק קול (באמת) מבוסס-לוציפראז הגידול גדול

גלה סרטונים נוספים