מודל של אפילפטוגנזה בתרבויות פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס של רינאל קליפת המוח

כאן, אנו מתארים את הכנת פרוסות אורגנוטיפיק קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס. תחת קיפוח הדרגתי ומבוקר של סרום, פרוסות אלה מתארות אירועים מתפתחים דמויי אפילפטיים ויכולים להיחשב מודל אקס ויוו של אפילפטוגנזה. מערכת זו מייצגת כלי מצוין לניטור הדינמיקה של פעילות ספונטנית, כמו גם להערכת ההתקדמות של תכונות נוירואינפלמטוריות לאורך כל מהלך אפילפטוגנזה.

אפילפסיה היא מחלה נוירולוגית נפוצה. פרוסות אורגנוטיפיות של קליפת המוח הריאנאלית-היפוקמפוס מתארות אירועים מתפתחים דמויי אפילפטיות הדומים לאפילפסיה של vivo ולכן יכולים לשמש כמודל אקס ויוו של אפילפטוגנזה. מערכת זו היא אכן כלי מצוין לניטור הדינמיקה וההתקדמות של אפילפטוגנזה, כמו גם לסינון מטרות טיפוליות פוטנציאליות לפתולוגיה זו של המוח.

מי שידגימו את ההליכים איתי יהיו התלמידים שלי פרנסיסקו מדה ומפאלדה קרבאליו. כדי לקצור את המוח מיום שלאחר הלידה שישה עד שבעה גור Sprague-Dawley, הראשון לשטוף את הראש שלוש פעמים בחמישה מיליליטר של GBSS. עובדים בארון biosafety, בחוזקה להכניס מלקחיים חדים לתוך ארובות העין להחזיק את הראש במקום ולהשתמש מספריים קצה דק לחתוך את הקרקפת לאורך קו האמצע מן הקדמי החוליות לאונות הקדמיות.

חותכים את הגולגולת באותו אופן ולאורך הסדק הרוחבי המוחי ומשתמשים במלקחיים ארוכים מעוגלים כדי להפריד את חתיכות הגולגולת. השתמש מרית כדי להשליך את נורות חוש הריח ולהעביר את הצד הגבי של המוח לתוך צלחת 60 מילימטר המכיל חמישה מיליליטר של GBSS קר. הכנס מלקחיים עדינים לתוך המוח הקטן והכנס את המרית לאורך קו האמצע כדי לפתוח בזהירות את חצי הכדור.

השתמש במלקחיים מעוגלים קצרים כדי להסיר בזהירות את הרקמה העודפת המכסה את ההיפוקמפוס מבלי לגעת במבנה ההיפוקמפוס, ולאחר מכן לחתוך מתחת לכל היפוקמפוס. מעבירים חצי כדור אחד בכל פעם בצד ההיפוקמפוס למעלה ומקבילים זה לזה על פיסת נייר סינון. מניחים את נייר המסנן על מסוק טישו עם ההמיספרות בניצב ללהב וחותכים את ההמיספרות ל -350 פרוסות מיקרון.

מעבירים את הרקמה הפרוסה לצלחת פטרי חדשה המכילה חמישה מיליליטר של GBSS קר ולהשתמש באלקטרודות קצה עגולות כדי להפריד בזהירות את הפרוסות השומרות רק על הדגימות עם קליפת המוח הנזלת וההיפוקמפוס שלמים מבחינה מבנית. אזורי DG ו- CA צריכים להיות מוגדרים בצורה מושלמת, כמו גם את אזורי קליפת המוח האנטורינלית וההירינלית. השתמש מרית ואלקטרודה קצה עגול למקם עד ארבע פרוסות שלמות על מוסיף בודדים במספר המתאים של בארות של צלחת שש באר המכיל 1.1 מיליליטר של מדיום תרבות לכל באר.

השתמשו בפיפט P20 להסרת כל מדיום ניתוח עודף מסביב לכל פרוסה. מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא. שנה את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים.

השתמש במלקחיים כדי להרים את ההוספה. שאפו את המדיום מהבאר המתאימה והניחו את ההכנסה בחזרה במקומה. השתמש פיפטה P1000 להוסיף מיליליטר אחד של טרי 37 מעלות צלזיוס בינוני לכל באר.

הכינו את מערך האלקטרופיזיולוגיה במעגל סגור. ודא שקצב הזרימה של תא סוג הממשק מוגדר לשני מיליליטר לדקה ופתח את שסתום פחמימות-שור. בדוק את מפלס המים במערכת והנח פיסת נייר סינון בתא הקלטת הממשק כדי לנקז כל מדיום עודף.

הנח פיסת נייר לניקוי עדשה מתחת למסגרת כדי לספק מדיום לפרוסה והפעל את בקר הטמפרטורה, המגברים והמיקרו מניפולטורים. השתמש במזרק כדי לטעון אלקטרודה זכוכית עם נוזל שדרתי מלאכותי מוכן טרי. מניחים את אלקטרודה זכוכית לתוך האלקטרודה המקבלת ולחכות הטמפרטורה בתא ממשק להתייצב ב 37 מעלות צלזיוס.

עובדים בארון biosafety, מניחים את הכנס בצלחת 60 מילימטר עם טיפה של בינוני. השתמש להב חד כדי לחתוך פרוסה מן הכנס ומניחים את הפרוסה בתא ממשק עם ההיפוקמפוס בפינה הימנית התחתונה, ולאחר מכן למקם את האלקטרודה המקבלת לשכבת תא פירמידלי CA3, ליזום את פרוטוקול הרכישה רציפה, ולהקליט את הפרוסה במשך 30 דקות. כדי לבצע את מבחני ספיגת היודיד פרופידיום, לעבוד בארון biosafety.

להרים את הכנס מן הבאר ולהוסיף יודיד propidium בינוני לריכוז הסופי של שני micromolar לכל באר. לאט להתסיס את הצלחת לפני הצבת הכנס בחזרה לתוך הבאר, דואג כי אין בועות מתחת לפרוסות. כאשר כל הפרוסות טופלו, להחזיר את הצלחת לאינקובטור תרבות התא.

עבור immunostaining של הפרוסות, בסוף הדגירה יודיד propidium, לשאוף את המדיום מתחתית כל באר ולהוסיף מיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde לחלק העליון והתחתון של כל הכנס. לאחר שעה בטמפרטורת החדר, לשטוף את הפרוסות פעמיים במשך 10 דקות ומיליליטר אחד של PBS לכל לשטוף ולהשתמש בעט הידרופובי לצייר שני מלבנים על שקופיות מיקרוסקופ. השתמש בלהב חד כדי לחתוך את הפרוסות מהתוספות ולמקם פרוסה אחת בכל מלבן.

הוסיפו תמיסת חסימת חדירות לכל פרוסה להדגרה של שלוש שעות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מוסיפים את הנוגדנים העיקריים של עניין לכל פרוסה עבור דגירה של ארבע מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת בבוקר, לשטוף את הפרוסות עם PBS-Tween שלוש פעמים במשך 10 דקות לכל לשטוף ולהדגיר את הפרוסות עם הנוגדנים המשניים המתאימים במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, לשטוף את הפרוסות כפי שהוכח ולהוסיף 50 microliters של פתרון Hoechst לכל פרוסה עבור דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה Hoechst, לשטוף את הפרוסות שוב ולהוסיף 50 microliters של הרכבה בינונית לכל אחד, ולאחר מכן מניחים כיסוי על הפרוסות ולאטום עם לק. לאחר מתן אפשרות למגלשות להתייבש במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר, דמיינו את ספיגת האימונוסטין וההתעודדות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.

פרוסות אורגנוטיפיות של קליפת המוח הריאנאלית-היפוקמפוס מתארות פעילות בין-כוכבית ואיטלית מעורבת בשבעה ימים במבחנה. ב 14 ימים במבחנה, פעילות ספונטנית מאופיינת הפרשות ictal, אשר להתפתח לפעילות ictal מכריע ב 21 ימים במבחנה עם אירועי ictal שנמשך יותר מדקה אחת. ספיגת יודיד Propidium ואימונוהיסטוכימיה נגד הסמן העצבי NeuN גילה כמה מוות עצבי בשבעה ימים פרוסות במבחנה כי הוא גדל במידה ניכרת ב 14 ימים במבחנה בכל אזורי ההיפוקמפוס.

בשבעה ימים במבחנה, microglia ramified עם ביטוי CD68 נמוך הם בשפע יותר מאשר Iba1 חיובי CD68 חיובי מגיב microglia. בעוד ב 14 ימים במבחנה, בכל האזורים של ההיפוקמפוס, Iba1 חיובי CD68 חיובי amoeboid M1 microglia יעלה microglia עם ביטוי CD68 נמוך. ב 14 ימים במבחנה, כמה איבא1 חיובי CD68 תאים חיוביים עם מראה השפעה היפר ניתן להצביע, מה שמרמז על האפשרות של פנוטיפ microglia אנטי דלקתיות M2.

בשבעה ימים במבחנה, הביטוי של CD3 הוא בקושי לזיהוי, בעוד ב 14 יום פרוסות במבחנה, חלבון חומצי פרפור גליה היפרטרופית חיובי CD3 אסטרוציטים חיוביים ניתן לראות, מה שמרמז על הפעלה מתקדמת של אסטרוציטים A1. הכינו פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס בזהירות רבה. הקפד להסיר את הרקמה העודפת מעל ההיפוקמפוס כפי שהוא יכול לסכן את שלמות הפרוסה במהלך ההחתכה.

גירעון מבני ישפיע לרעה על הכדאיות הפרוסה. בנוסף לגישות שהוכחו, ניתן להחיל על מערכת זו שפע של מבחנים כגון ניתוח כתמים מערביים, PCR בזמן אמת ו- ELISA כדי לענות על שאלות ספציפיות לגבי אפילפטוגנזה.