העברת נוגדנים למוח באמצעות אולטרסאונד סריקה ממוקדת

רק חלק קטן מהנוגדנים הטיפוליים נקלטים על ידי המוח. באמצעות השיטה שלנו, נוגדנים מועברים למוח על ידי פתיחה זמנית של מחסום הדם-מוח. טכניקה זו מאפשרת לנו להעביר נוגדנים למוח העכבר בצורה לא פולשנית.

כדי לבצע בקרת איכות של בועות המיקרו באמצעות מונה תאים, הסר את תמיסת המיקרו בועות מהמיזוג והשתמש במחט בגודל 19 כדי לנקב את המחיצה של בקבוקון תמיסת המיקרו בועות. השתמש במזרק מיליליטר אחד המצויד במחט 19 מד כדי לדלל 100 מיקרוליטר של בועות המיקרו בחמישה מיליליטר של תמיסת זרימה מסוננת ופיפטה 100 מיקרוליטר של תמיסת המיקרו בועות המדוללת ב -10 מיליליטר של תמיסת זרימה מסוננת בקובטה. נעל את הקובט במקומו על פלטפורמת דלפק התאים וודא כי צמצם של 30 מיקרון ישמש לרכישת הדגימה.

בתוכנה, טען את שיטת ההפעלה הסטנדרטית ובחר ערוך שיטת הפעלה וריכוז סטנדרטיים. הזן 5,000 פעמים לדילול ולחץ על החל ואישור. לחץ על ערוך מידע כדי לבחור שם קובץ מתאים. בחר תצוגה מקדימה וודא שריכוז דגימת המיקרו בועות נמוך מ-10%בחר התחל ואישור כדי להתחיל ברכישת הדגימה.

לאחר המדידה יש לשטוף את הצמצם של מונה התאים בתמיסת זרימה מסוננת. סוניקציה של תמיסת מיקרו בועות מדוללת למשך 30 שניות באמבט מים. מדוד את תמיסת המיקרו בועות הסוניקציה כפי שמודגם ולחץ על ערוך מידע כדי לתייג את הנתונים כריקים.

לאחר מדידת הריק, הפחיתו את הקריאה הסופית מהקריאה הראשונית כדי לא לכלול חלקיקים שאינם בועות מיקרו. כדי לתייג את החלקים בנוגדני IgG פלואורסצנטיים נגד עכברים, סמן מיליגרם אחד של נוגדן IgG של עכבר עם קמח Alexa 647 במאגר נתרן ביקרבונט 0.1 מולרי לפי הוראות היצרן למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה, טען את תמיסת הנוגדן המסומנת פלואורסצנטית על עמוד ספין וטהר את הנוגדן על ידי צנטריפוגה.

לאחר מכן השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את ריכוז החלבון. כדי להגדיר את מערכת האולטרסאונד הסריקה הממוקדת, הוסף שטח של חמישה מילימטרים לבולוס המים כדי למקם את מוקד האולטרסאונד תשעה מילימטרים מתחת לתחתית בולוס המים. מלאו את בולוס המים בכ-300 מיליליטר מים נטולי יונים והנחו את המערך הטבעתי לתוך בולוס המים המלא.

השתמש במראה דנטלית כדי לבדוק שאין בועות אוויר על פני השטח והפעל את תוכנת היישום. בתפריט צורת הגל, בחר הגדר מחזור עבודה של צורת גל והגדר את תדר חזרת הפולסים ל-10 הרץ, מחזור העבודה ל-10% את המיקוד ל-80 מילימטרים, את תדר המרכז למגה-הרץ אחד, את המשרעת ל-0.65 מגה-פסקל ואת האינדקס המכני ל-0.65. לחץ על הגדר כדי להגדיר את צורת הגל ולאחסן את צורת הגל בזיכרון.

לאחר בחירת תוכנית הטיפול, פתח את לשונית הסריקה בחלון בקר התנועה והזן ערכי התחלה, עצירה ותוספת לתנועה בממד X וערכי התחלה, עצירה ותוספת לתנועה בכיוון Y. להגדרת הפעולות לאתרי הטיפול, לחץ על event ופתח את חלון עריכת הסקריפט. בחר רשימת פעולות שיבוצעו בסדר שנבחר בכל אתר טיפול והגדר את סוג התנועה לרשת רסטר.

בכרטיסיה אירועים, בחר הוסף פעולות והעבר את המהלך באופן סינכרוני להפעיל ARB המתנה והפסקה של פעולות ARB להפעלת ARB ללוח ה- Script. לאחר מכן לחץ על פעולת ההמתנה ובחר זמן המתנה של 6, 000 אלפיות השנייה. כדי להכין בעל חיים לניתוח, לאחר אישור חוסר תגובה לצביטה בבוהן בעכבר מורדם, השתמש בטוש קבוע כדי לסמן את מרכז הראש, ואז הדביק ניילון נצמד לתחתית סירת משקל קטנה עם החתך התחתון ומלא את סירת השקילה בג'ל אולטרסאונד.

לטיפול אולטרסאונד ממוקד, הפוך את בקבוקון המיקרו בועות וטען בעדינות מיקרוליטר אחד של התמיסה לגרם ממשקל גופו של העכבר למזרק אינסולין בגודל 29. הוסף 100 מיקרוליטר של נוגדן עם תווית פלואורסצנטית למזרק והפוך בעדינות וגלגל את המזרק בין האגודל לאצבע המורה כדי לערבב את הנוגדן ואת בועות המיקרו בתוך המזרק. בזהירות ובאיטיות הזריקו 150 מיקרוליטר מתמיסת המיקרו בועות והנוגדנים לעכבר והגדירו טיימר לשתי דקות.

מרחו משחה עיניים, ואז הניחו את העכבר במחזיק הראש וקבעו את אפו במחזיק. הנח את סירת השקילה הקטנה המלאה בג'ל אולטרסאונד על גבי הראש והורד את בולוס המים עד שהיא יושבת על גבי ג'ל האולטרסאונד בתוך סירת השקילה. לאחר מכן השתמש בג'ויסטיק כדי ליישר חזותית את מיקוד המתמר במרכז הראש.

כאשר הטיימר נכבה, בלשונית התנועה של התוכנה, בחר אפס מקור ובחר סריקה מלאה. בסיום הטיפול יש למרוח משחת עיניים על עיני החיה ולהניח את העכבר בתא התאוששות מחומם. כאן מוצגות תוצאות מייצגות ממדידות דלפק התרבות של הגודל והריכוז שניתן להשיג כאשר בועות המיקרו מיוצרות כהלכה.

ניתן לדמיין בקלות את ספיגת הנוגדנים על ידי המוח בכל חלקי המוח או הרקמות באמצעות סורק אינפרא אדום או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של החלקים. כפי שמודגם בתמונות אלה, ניתן להשתמש בצביעה מייצגת של סמני מיקרוגליה כדי לקבוע אם מיקרוגליה הופכת לפגוציטית יותר לאחר מסירת הנוגדן. חשוב להקפיד על רווחתם ובטיחותם של בעלי החיים במיוחד בעת ביצוע הזרקות רטרו-אורביטליות והנחת המתמר מעל ראשי העכברים.

שיטה זו מאפשרת יישום של דפוסי סריקה שונים כדי להתמקד באזורים שונים במוח, כגון ההיפוקמפוס, קליפת המוח או חצאי מוח בודדים. השיטה הזו יכולה לשמש לפיתוח טיפולים ותרופות חדשים שחודרים את מחסום הדם-מוח ולחקור את המנגנון של היווצרות מחסום הדם-מוח ופתיחתו.