ניתוח פנוטיפ שלד של מודל עכבר מחיקה מותנית Stat3

מודלים של עכברים מהונדסים גנטית הם כלים רבי עוצמה לחקר המנגנונים של מחלות אנושיות in vivo. ניתוח פנוטיפ השלד של עכברים הוא הבסיס לחקר השלד. חלקיק זה מתאר כמה טכניקות אופייניות לניתוח פנוטיפ השלד, שעשויות להיות מעניינות עבור אלה החדשים בחקר רקמות השלד.

כשאתם מנסים את החלקיק הזה, זכרו שניסויים בבעלי חיים לוקחים זמן, אז אספו כמה שיותר דגימות באיכות גבוהה במהלך כל ניסוי, גם אם אינכם זקוקים להן בטווח הקצר. התחל בהנחת עכבר שעבר המתת חסד בשכיבה ונקע בעדינות את מפרקי הירך הדו-צדדיים ביד. השתמש במספריים עיניים כדי לחתוך אנכית את העור מהשוק הדיסטלי ולאחר מכן להסיר את כל העור מהגפה האחורית.

חתכו את הרצועה המפרקית של מפרק הירך הימני ומפרק הברך בעזרת מספריים כדי להפריד את הגפה האחורית. לאחר מכן חותכים את העצם בשני הקצוות כדי לטבול את העצם במלואה ב-4% PFA. חותכים את הטרוכנטר ואת צומת הפיבולה.

טבלו את הגפה האחורית ב-4% PFA, תוך שמירה על הגפה האחורית הימנית לחיתוך פרפין. חותכים את הרצועות המפרקים של מפרקי הירך והברך השמאלית בעזרת מספריים ומסירים בעדינות את הרקמה הרכה. הפרד את השוקה ועצם הירך וטבול אותם בנפרד באתנול 75%.

שמור את עצם הירך לסריקת מיקרו CT ואת השוקה לתיוג כפול אדום של קלצין ואליזארין. להכנת חלקי הפרפין, שטפו בעדינות את הגפה האחורית הימנית הקבועה שלוש פעמים עם PBS למשך 10 דקות לכל שטיפה. לאחר מכן הסירו את האבדן ב-15% EDTA עם מסיר אבדן קולי למשך שלושה עד ארבעה שבועות עד שניתן לכופף את העצמות, ולהחליף את נוזל הסרת האבדן כל יומיים.

לאחר הסרת האבדן יש לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS ולטבול אותן באתנול 75% בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. ביום השני, טבלו דגימות ברצף ב-95% אתנול, 100% אתנול וקסילן למשך שעה כל אחת. טבלו את הדגימות בחצי קסילן וחצי פרפין למשך 30 דקות, ואז בפרפין בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

כדי להטמיע את הדגימה, טבלו אותה בפרפין, והניחו את עצם הירך והשוקה בזווית של 90 מעלות. כאשר הפרפין התקרר במלואו, הסר את הדגימות ממיכל ההטבעה. מספרו ואחסנו אותם בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

אופים את חלקי הפרפין בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז מורחים אותם בשעווה על ידי טבילתם בקסילן למשך 10 דקות. טבלו את החלקים שלוש פעמים עם קסילן טרי בכל פעם. החזר את החלקים על ידי טבילתם ברצף ב-100% אתנול, 95% אתנול, 70% אתנול ומים מזוקקים למשך חמש דקות כל אחד.

הכינו את תמיסת הצביעה באמצעות ערכת הצביעה TRAP וחממו אותה ל-37 מעלות צלזיוס. הוסף 50 עד 100 מיקרוליטר של תמיסת מכתים לכל חלק ודגר אותם בתא לח של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות. בדוק את מצב הצביעה של האוסטיאוקלסטים תחת מיקרוסקופ אור כל חמש דקות עד שניתן לראות אוסטאוקלסטים רב-גרעיניים אדומים.

ואז סיים את התגובה במים. יש לצבוע את החלקים בתמיסת המטוקסילין למשך 30 שניות וליצור צבע כחול יציב על ידי טבילתם בתמיסת אמוניה 1% למשך דקה אחת. לאחר מכן שטפו אותם במי ברז שזורמים לאט.

הרכיבו את החלקים באמצעות החלקות כיסוי עם בלסם ניטרלי וייבשו אותם למשך הלילה. צלם שלושה עד חמישה שדות ראייה במיקרוסקופ ונתח את ההיקף הטרבקולרי עם תמונה J.השתמש בכלי הקו הישר כדי למדוד את אורך סרגל קנה המידה כ-L1. לאחר מכן השתמש בכלי הקו המפולח כדי למדוד את אורך ההיקף הטרבקולרי כ-L2. חשב את האורך הפיזי וספור את מספר התאים החיוביים של TRAP עם יותר משלושה גרעינים. לאחר הקיבוע, יש לשטוף בעדינות את השוקה שלוש פעמים עם PBS ולטבול את הדגימות ברצף ב-95% אתנול, 100% אתנול וקסילן למשך חמש דקות כל אחת.

טבלו את הדגימות באצטון למשך 12 שעות וחצי אצטון וחצי שרף למשך שעתיים, ובשרף טהור בתנור ייבוש למשך הלילה. הוסף שרף טהור למיכל הטמעת סיליקה ג'ל מתאים והנח את הדגימות במיכל תוך הימנעות מבועות. פילמרו את השרף בתנור ייבוש בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

חותכים את הדגימות לחלקים בעובי חמישה מיקרומטר ברציפות עם מיקרוטום סיבובי ומאחסנים את שאר הדגימות עם חומר ייבוש בטמפרטורת החדר. הדביקו את החלקים בפינצטה בטיפה של 75% אתנול והרכיבו אותם עם החלקות כיסוי באמצעות בלסם ניטרלי. לכוד את תווית הקרינה האדומה והירוקה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

עכברי מחיקת Stat3 ספציפיים לאוסטאוקלסטים נוצרו כדי לחקור את ההשפעה של מחיקת Stat3 על התמיינות אוסטאוקלסטים. שחזור עצם הירך וניתוח כמותי על ידי מיקרו CT הצביעו על כך שמסת העצם של עכברי Stat3 Ctsk גדלה בהשוואה לעכברים מסוג בר. מורפולוגיה היסטו של עצם הירך מטיפוס בר ועכברי Stat3 Ctsk נבדקה באמצעות צביעת H ו-E.

פעילות אוסטאוקלסטוגנית זוהתה באמצעות צביעת TRAP. אוסטאוקלסטים הם תאים חיוביים גדולים ל-TRAP עם גרעינים מרובים. מספר האוסטיאוקלסטים החיוביים ל-TRAP היה נמוך יותר בעכברי Stat3 Ctsk, בהשוואה לעכברים מסוג בר, מה שמצביע על כך שמחסור ב-Stat3 פגע ביצירת אוסטאוקלסטים.

אוסטאוגנזה נמדדה עם תיוג כפול של קלצאין ואדום אליזרין. האזור שבין הקלצאין לפלואורסצנציה האדומה של האליזרין מייצג עצם שזה עתה נוצרה. ה-Stat3 שנמחק באוסטיאוקלסטים לא השפיע על אנבוליזם העצם.

קטעי פרפין קשת שבהם הסחוס מאוחר יותר היה סימטרי וזה הראה שנעשה כאן שימוש בקו ברור בצורת M. לצורך המחקרים, נכלול מאפיינים נוספים של מערכת השלד, כגון תכונות מכניות.