מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

המטרה הכוללת של שיטת מבנה-תפקוד זו היא לנתח ברמה המולקולרית את תפקידם של תחומי חלבון שונים, או מוטציות רלוונטיות למחלה, בתאי גזע עובריים נאיביים או מובחנים של עכברים. שיטה זו יכולה לעזור לחשוף כיצד שאריות או תחומים שונים של חלבון יכולים לתרום לתפקודו בהקשר תאי נתון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מיקוד יעיל מאוד של מבני הצלה לגנום של תאי גזע עובריים, או תאי ES, וחקירת תפקידם בסוגי תאים שונים.

כדי להשיג זאת, אנו משלבים שלוש טכנולוגיות יעילות ביותר. אלה כוללים בידוד משופר של תאי גזע עובריים של עכברים, הרכבת גורמי מיקוד מבוססי רקומבינציה ומיקוד תאי ES באמצעות חילופי קלטות בתיווך רקומבינציה, או RMC. תדגים חלק מהנהלים ג'ינקה ד'הונט, טכנאית מהמעבדה שלי.

חילופי קלטות בתיווך רקומבינציה, או RMCE, מאפשרים החלפה של מקטעי DNA בין וקטור למיקום גנומי. RMCE מנצל אתרי רקומבינציה ספציפיים להטרו שאינם מגיבים צולבים ואשר משובצים בלוקוס גנומי. בנוכחות פלסמיד תורם המכיל מקטע DNA המוקף באותם אתרים ספציפיים להטרו, הרקומבינאז יכניס את שבר ה-DNA הזה למיקום הגנומי התואם RMCE בגלל טרנסלוקציה כפולה בו זמנית.

רק עם רקומבינציה נכונה, הגן הכלוא ללא מקדם ניאומיצין באתר העגינה של רוזה 26, ישוחזר באמצעות מקדם PGK בווקטור המטרה הנכנס, מה שהופך את העמידות לתרופות. מערכת מלכודת עמידות ל-Neomycin זו מביאה ליעילות מיקוד גבוהה מאוד, לרוב קרוב ל-100%יום לפני בידוד הבלסטוציסט, הוסף 0.1% ג'לטין, ל-12 צלחות מתורבתות היטב. ולדגור אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

שאפו את תמיסת הג'לטין. לאחר מכן זרע רבע בקבוקון של פיברובלסטים עובריים של עכבר P2, או MEFs, למדיום MEF, ומחלק על פני צלחת 12 הבארות. דגרו את צלחות 12 הבארות של MEFs בשני מיליליטר של מדיום MEF ב-37 מעלות צלזיוס.

ולגדל את התאים לשכבה חד-שכבתית קונפלונטית. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוגרם למיליליטר זרעי מיטומיצין לבארות. ודגרו על התרביות במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, כדי לנטרל את התאים.

לאחר בחירת עכברי נוק-אאוט הטרוזיגוטיים המכילים קלטת RMCE בלוקוס רוזה 26 על פי פרוטוקול הטקסט, הגדירו הזדווגות לגידול עכברי נוק-אאוט הטרוזיגוטיים תואמי RMCE, עם עכברי נוק-אאוט הטרוזיגוטיים. למחרת בבוקר, בדקו אם יש פקקי הזדווגות על ידי הרמת הנקבה מבסיס הסיפור, ובדקו את פתח הנרתיק לאיתור גוש לבנבן. אם קשה לראות את הפקק, בעזרת בדיקה זוויתית, פרשו מעט את שפתי הפות, ואז הפרידו את הנקבות התקועות מהזכרים שלהן.

לאסוף בלסטוציסטים 3.5 ימים לאחר קיום יחסי מין, או DPC. לאחר המתת חסד של הנקבות ההרות, בצע חתך באמצע הגחון, והשתמש במספריים עדינים ומלקחיים כדי לנתח את הרחם ואת צינור הביצית. לאחר מכן, כופפו מחט בגודל 26 לזווית של 45 מעלות המחוברת למזרק של 1 מיליליטר מלא במדיום M2.

והכנס את המחט לקצה הרחם הקרוב ביותר לצינור הביצית. השתמש במלקחיים עדינים כדי להחזיק את המחט במקומה תוך כדי דחיפה של הבוכנה כדי לשטוף את הבלסטוציסטים מהרחם למכסה של צלחת של 10 סנטימטרים. הרחם יתנפח, אם השטיפה תצליח.

השתמש בפיפטה בפה כדי לאסוף את כל העוברים בטיפה של מדיום M2, ושטוף את העוברים פעמיים בטיפה של מדיום M2. מיד לאחר שטיפת העוברים, השתמש ב-PBS, כדי לשטוף את התאים המומתים של מיטומיצין-C פעמיים. לאחר מכן בעזרת פיפטה בפה, צלחת כל בלסטוציסט על באר נפרדת של MEFs שטופלו במיטומיצין-C, במדיום תאי SRES, בתוספת פלוריפוטנטי או 2I.

דגרו על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ו-5% פחמן דו חמצני. רענן את מדיום התא SREF כל יומיים-שלושה. בדוק כל בלסטוציסט במיקרוסקופ סטריאו בהגדלה פי 4, ובדוק אם יש בקיעה וניתוק לשכבת ה-MEF.

לאחר 10 עד 12 ימי תרבית, תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש בפיפטה P10 עם קצות חד פעמיים, כדי לבחור גידולי איציום בודדים. העבירו כל צמיחה לכ-10 מיקרוליטר של מדיום לצלחת של 96 בארות בצורת V, המכילה 30 מיקרוליטר לבאר PBS. בעזרת פיפטה רב ערוצית, הוסף 50 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין לכל באר.

ודגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שלוש דקות. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תאי ES המכיל FPS מודגר מראש, ופרק את גידולי האיציום לתאים בודדים על ידי פיפטינג 10 עד 15 פעמים. לאחר מכן העבירו את התאים המנותקים לפלטות MEF שטופלו במיטומיצין-C 96 היטב.

למחרת, שנה את המדיום המבוסס על SR. הרחב את תאי ה- ES בצורה דומה מצלחות של 24 ל -6 בארות. לאחר זיהוי וקטורי CDNA שניצלו על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו תגובת LR של 10 מיקרוליטר באמצעות 100 ננוגרם של וקטור CDNA הצלה, 150 ננוגרם של וקטור RMCEDV1 שנכרת מראש, ושני מיקרוליטרים של תערובת רקומבינאז, המכילה אינטגראז מקודד פאג'ים, כריתה וגורם מארח אינטגרציה חיידקית.

דגרו את התגובה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. כדי להפוך את הווקטורים המשולבים מחדש, הוסף 5 מיקרוליטר מכל תערובת, ל -40 מיקרוליטר של חיידקי E.Coli המסוגלים להלם חום, בצינור מכסה בורג של 2 מיליליטר. ודגרו את הדגימה על קרח למשך 20 דקות.

לאחר מכן דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הוסף מיליליטר אחד של מדיום LB לשפופרת, ודגר על התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. צלחת 50 מיקרוליטר על צלחות אגר עם אמפיצילין.

ולגדול ב-37 מעלות צלזיוס בן לילה. זהה מושבות עם וקטור המיקוד הנכון על ידי שימוש בקצה P200 כדי לבחור באופן אקראי חמש מושבות. מעבירים את הקצה למבחנה מזכוכית המכילה שניים עד חמישה מיליליטר של מדיום LB, וגדלים בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר חילוץ ה-DNA מכל מושבה, אמת את הדגימות על ידי עיכול של 0.5 עד שני מיקרוגרם של DNA, והפרד את הדגימות על ג'ל אגרוז 1%. התחל תרבית של תאי ES תואמי RMCE, והעביר אותם לפחות פעמיים על MEFs, במדיום תאי ES מבוסס FBS. לאחר מכן פצלו את תאי ה- ES על צלחת ג'לטינית בת שש בארות.

למחרת, השתמש ב-1.5 מיליליטר של מדיום תאי ES מבוסס FBS כדי לרענן את תאי ה-ES שהם כ-50% מתלכדים. שלב מיקרוגרם אחד של וקטור מיקוד RMCEDV1 שנכרת מראש, המכיל CDNA הצלה, ומיקרוגרם אחד של פלסמיד ביטוי FLIPe, ב-250 מיקרוליטר של מדיום DMEM טהור. הוסף שבעה מיקרוליטרים של מגיב טרנסבקציה מבוסס ליפופקטין ל-250 מיקרוליטר של מדיום DMEM טהור.

ודגרו את התמיסה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שלב את תמיסות ה- DNA והליפופקטין. ודוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

לאחר מכן פיפטה את תערובת הטרנסבקציה על תאי ה-ES הרעננים, ומערבבים בעדינות. יום אחד לאחר הטרנסבקציה, פיצלו את כל תאי ה-ES מהצינור לצלחת תרבית של 10 סנטימטרים, עם שכבה מתכנסת של DR4 MEFS, ו-10 מיליליטר של מדיום תאי ES מבוסס FPS. יומיים לאחר הטרנסבקציה, בחר שיבוטי תאי ES עם חילופי קלטות בתיווך FLIP-e הנכון, על ידי הוספת G418 למדיום.

כפי שמוצג כאן, הרג מסיבי של מושבות לא ממוקדות אמור להיות גלוי לאחר שלושה עד חמישה ימים. מושבות צריכות להופיע לאחר שבעה עד 10 ימים. בחר את המושבות הללו, ואז הרחב אותן ואמת את השיבוטים כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה.

כדי להבדיל תאי ES לגופים עובריים, או EBs, לאחר תרבית תאי ES נוק-אאוט עם מבני הצלה מונעי רוזה 26 על פי פרוטוקול הטקסט, אפשר ל-EBs להיווצר בכלים שאינם נצמדים למשך 30 יום. רענן את המדיום כל יומיים-שלושה על ידי העברת מתלה EB לצינור של 50 מיליליטר. ותנו ל-EBs להתיישב על ידי כוח הכבידה.

הסר את הסופרנטנט, הוסף מדיום טרי והעביר את תרחיף ה-EB לכלי בדרגת חיידקים. לנתח את תאי ה-ES וה-EBs על ידי אימונופלואורסצנציה ו-TEM, על פי פרוטוקול הטקסט. באמצעות שיטת פונקציית המבנה, נוצרו חמישה וקטורים מכוונים RMCEDV1 שנכרתו מראש ביעילות של 100% ומבני ההצלה הללו כוונו באמצעות RMCE, כדי P120 catenin לדפוק תאי ES, עם יעילות של 97% מורפולוגיה ציסטית EB יכולה לשמש כקריאה פנוטיפית לסינון מבני הצלה שונים.

כהוכחת רעיון, איזופורם 1A של קטנין P120 מונע R26 הציל את פנוטיפ הקטנין p120. כדי לבדוק אם עיגון ממברנה עצמאי של E-cadherin של P120 catenin איפשר היווצרות EB csytic, מוטיב המטרה של ממברנת k-ras, CAAX, התמזג לקצה הקרבוקסי של P120 catenin, והוכנס באמצעות RMCE, לתאי קטנין P120 נוק-אאוט תאי ES, לפני שנוצרו מהם EBs. עם זאת, מבנה זה משרת שלילי דומיננטי שאינו מאפשר קשירה וייצוב של E-cadherin.

וכתוצאה מכך, אינו מציל את פנוטיפ הנוק-אאוט p120 catenin. מעבר אפיתלי-מזנכימלי, או EMT, הוא תהליך התפתחותי חיוני המתרחש גם במהלך התמיינות תאי ES. כאשר באים לידי ביטוי ב-p120 catenin דופקים תאי ES, משפרי ה-EMT, ZEB1, ZEB2 או חילזון שיכולים לדכא ישירות גנים שונים של סמני אפיתל כמו E-cadherin, לא הצליחו לשחזר את היווצרות EB ציסטית.

לאחר השליטה, ניתן לבודד תאי ES תואמי RMCE תוך חודש אחד. ניתן ליצור וקטורי מיקוד תואמי RMCE תוך שבוע אחד, וניתן להשיג הצלה ממוקדת של תאי ES תוך חודש באמצעות טכניקה זו, אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש ב-RMCE לביצוע מחקרי תפקודי מבנה בתאי גזע עובריים נאיביים או מובחנים.