הזרקה תוך-ואטראלית וכמות של פרמטרי זיהום במודל עכבר של אנדופתלמיטיס חיידקי

הפרוטוקול שלנו מאפשר החדרה לשחזור של מיקרואורגניזם וסוכנים טיפוליים לתוך עין העכבר כדי ללמוד את הפתוגנזה של זיהום תוך עיני ויעילות טיפול חדשני. הטכניקה שלנו מאפשרת ליצור זיהומים תוך עיניים במודל עכבר ומאפשרת כימות מיקרואורגניזמים, תגובות חיסוניות מארחות, ביטויי גנים הקשורים לזיהום ופתוגן, ויעילות טיפול חדשנית. הדמיה של אתר ההזרקה, זווית המחט והמסירה הם קריטיים לביצוע מוצלח של טכניקה זו וקציר עיניים תקין חיוני לכמות את פרמטרי הזיהום.

במתקן ביוספטי רמה 2, להוסיף חמישה מיליליטר של מרק BHI לצינור כובע הצמד 10 מיליליטר ולהשתמש בלולאה סטרילית להעביר מושבה אחת B.cereus מתרבות צלחת auger לחמישה מיליליטר של מרק. לאחר מערבולת קצרה, הדגירה את המדגם באינקובטור מסתובב 37 מעלות צלזיוס ב 200 מהפכות לדקה במשך 18 שעות. בסוף הדגירה, לדלל את התרבות למושבה 200 יחידות להרכיב לכל ריכוז microliter ב 10 מיליליטר של BHI טרי, ולאחר מערבולת, להוסיף מיליליטר אחד של התרבות מדולל טרי צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר על קרח.

להזרקה תוך-ואטראלית, הפעל את המיקרו-מיינר ופתח את שסתום הגז על מיכל האוויר הדחוס המחובר למיקרו-מיינר. לחץ על מצב במיקרו-מיינר עד שהמסך מציג את איזון. הקש על איזון והצב את עכבר המחשב על שולחן ההפעלה.

חבר את מחזיק פיפטה נירוסטה אל הצינור המחובר לפלט המילוי על המזרק והברג בחוזקה את מחבר מחזיק הפיפלט סביב מחט קצה פיפטה נימית מזכוכית משופעת כדי לאפשר החדרת מחט נימי לקצה השני של מחזיק הפיפלט. הפעל את המיקרוסקופ העיני והגדר את עוצמת האור ל- 50%מקם את המיקרוסקופ מעל אתר ההליך והתאם את המיקרוסקופ למוקד הרצוי. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה, מניחים את העכבר הרדמה בצד שמאל שלה על התחתונים הרפואיים עם האף הצביע ימינה.

אתר את העין הימנית דרך המטרה מיקרוסקופ עיניים ולמקום את המלקחיים של מלקחיים פעולה הפוכה משני צדי העין כדי לחשוף את אתר ההזרקה. שמאל לחץ על העכבר מחובר microinjector כדי למלא את המחט נימי מוכן עם פתרון חיידקים מדולל, ואבטחת הראש ביד שמאל, למקם את קצה המחט, צד משופע למעלה, על הלימבוס של העין. עם המחט בזווית של 45 מעלות, לנקב את העין, דואג כי רק 0.5 מילימטרים של קצה חד של המחט מוכנס.

לאחר קצה המחט הוכנס, להשתמש ביד שמאל כדי ללחוץ ימינה על משטח העכבר כדי להזריק 0.5 microliters של פתרון B.cereus. כדי למנוע דליפה, להשאיר את קצה המחט בתוך עין העכבר במשך שתיים עד שלוש שניות לפני הסרת, ואז לשחרר את המטחנים ואת העין יחזור לתוך השקע בפני עצמו. מעבירים את העכבר לכלוב התאוששות על משטח התחממות עם ניטור עד לשיקום מלא.

בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, להוסיף 400 microliters של PBS בתוספת מעכב פרוטאז אחד שכותרתו, צינור קציר autoclaved לכל עין על קרח ולהמקם מלקחיים קצה עדין פתוח משני צדי העין הנגועה. לדחוף את הטיפים כלפי מטה לכיוון הראש כדי להניע את העין. ברגע המלקחיים הם מאחורי כדור העין, לסחוט את המלקחיים יחד ולמשוך את המלקחיים מהראש כדי לנתק את גלגל העין.

ואז מיד למקם את גלגל העין לתוך צינור קציר שכותרתו כראוי. בתוך 60 דקות של איסוף מדגם, למקם את צינורות קציר סגור לתוך homogenizer רקמות הומוגניזציה הדגימות במשך שתיים, דקה אחת homogenization תקופות עם תקופה של 30 השני של מנוחה בין. לאחר הומוגניזציה, מניחים את הדגימות על קרח ולהשתמש 20 aliquots microliter של הומוגנטי כדי לדלל באופן סדרתי את הדגימות ב 180 microliters של PBS לדילול, עד גורם של פעם אחת 10 לשמונה שלילי הוא הגיע.

לאחר מכן, סמן כל שורה של צלחת BHI מרובעת מחוממת מראש עם ריכוז הדילול המתאים, ועם הצלחת מוטה בזווית של 45 מעלות, להוסיף 10 microliters של כל דילול לתוך שורות בודדות בחלק העליון של הצלחת. תן לכל מדגם לרוץ עד שהוא כמעט מגיע לתחתית הצלחת לפני הנחת הצלחת שטוח. כאשר הדגימות נספגו לתוך אגר, להעביר את הצלחת ל 37 מעלות צלזיוס אינקובטור.

מושבות צריכות להתחיל להיות גלויות לאחר שמונה שעות של דגירה. לייצוג מדויק של הריכוז המדגם, ספור את השורה שיש בה בין 10 ל-100 מושבות. הבנייה של קצה מחט זכוכית משופעת היא קריטית להעברת החיידקים לתוך vitreous באמצע העין של העכבר.

בתמונות אלה, Bacillus cereus גדל על צלחת אגר דם בצינורות תרבות מרק מוצגים. כפי שמודגם בגרף זה של ספירת חיידקים בין עינית מחמש עיני עכבר שונות ב 10 שעות לאחר ההדבקה בין 1 פעמים 10 לחמישית ו 1 פעמים 10 למושבה השביעית להרכיב יחידות של חיידקים בדרך כלל ניתן לשחזר מעין נגועה אחת. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא להזריק את הנפח המתאים של חיידקים לתוך עין העכבר.

בעקבות הליך זה, אנו יכולים לחקור דלקת על ידי היסטולוגיה, מתווכים דלקתיים על ידי ELISA, וביטוי גנים על ידי רצף RNA תפוקה גבוהה כדי להקל על הבנה טובה יותר של הפתוגנזה של מחלה זו.