להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic

המטרה הכללית של הליך זה היא להעריך את התפקוד הפגוציטי של מיקרוגליה רטינאלית in vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום האופתלמולוגיה, כגון האם תרכובות מסוימות משנות את התפקוד הפגוציטי של המיקרוגליה בסביבה פיזיולוגית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השימוש בציטומטריה של זרימה, המאפשרת ניתוח כמותי מהיר ומדויק של פגוציטוזה של מיקרוגליה.

סוסומו סקימוטו, פוסט-דוקטור מהמעבדה שלי, יעזור לי להדגים את הפרוצדורה. התחילו במילוי מחט בכילוי 33 ומזרק עם 0.5 µl של תמיסת חלקיקים המסומנים פלואורסצנטית. לאחר מכן, הניחו עכבר הרדום על הצדו על חומר רך תחת מיקרוסקופ כירורגי, ואשרו את רמת הסדציה המתאימה באמצעות בדיקה של היעדר תגובה לצביטה בבוהן.

בשלב הבא, השתמשו בפינצטה כדי להפעיל לחץ בעדינות מסביב לעפעף אחד, כך שגלגל העין יבלוט מעט מהמ Orbita. לאחר מכן, אחזו בראש בעזרת שתי אצבעות מעל האוזן ובמלתרתו של בעל החיים, ומתוחו בעדינות את העור במקביל לעפעפיים כדי לשמור על העין בולטת מעט מהמ Orbita. הזרקות תוך-זגגיות (Intravitreal injections) הן מאתגרות, ואם אינן מבוצעות נכונה, הן יובילו לתוצאות מוטות ומשתנות.

כדי להפחית את הטראומה לעין, החזיקו את החיה בתנוחה יציבה עם תנועת ראש מינימלית. כדי לנקב את גלגל העין, אחזו בעכבר בעדינות ביד אחת. לאחר מכן, אתרו את הלימבוס של הקרנית (corneal limbus), המקום שבו הקרנית והסקלרה מתחברות, אשר נראה כמעגל אפור בעכברים עם פיגמנטציה.

החזיקו את המזרק ביד השנייה והחדירו את המחט ללימבוס. לאחר מכן, משכו את המחט מעט לאחור כדי להוציא נפח קטן של נוזל זגוגית, ולחצו באיטיות על הבוכנה כדי להזריק את החלקיקים. כאשר כל החרוזים הוזרקו, משכו את המזרק באיטיות כדי למנוע רפלוקס של החומר המוזרק, והשתמשו בטיפות לחות כדי לשמור על לחות העין לאחר שהעין חזרה למקומה.

לאחר מכן, הנח את החיה על פד חימום בכלוב נפרד תחת מעקב עד להחלמה מלאה. שלוש שעות לאחר הזרקה תוך-זגיתית (intravitreal), השתמש בפינצטה מזווית של 45 מעלות כדי ללחוץ בעדינות על העפעף לצורך בליטת גלגל העין (proptosis). מקם את הפינצטה מאחורי גלגל העין ומשוך.

לאחר מכן, העבירו את גלגל העין לאזור יבש בתוך צלחת פטרי, המכילה נפח קטן של PBS עם סידן ומגנזיום, תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמשו בקצה אחד של פינצטה עדינה מאוד כדי לבצע נקב בעין באזור הלימבוס של הקרנית. לאחר מכן, החזיקו את גלגל העין באמצעות פינצטה עדינה בזווית של 45 מעלות, והשתמשו במספרי קפיץ כדי לגזור מסביב ללימבוס של הקרנית עד שייחתך בערך חצי מההיקף.

העבירו את גלגל העין ל-PBS והשתמשו בזוג שני של פינצטות עדינות בזווית של 45 מעלות כדי להפריד בין הקרנית ללובן העין. העדשה והרשתית יצאו שלמות. ודאו שהעדשה והרשתית מופרדות והעבירו את הרשתית לשפורת מבחנה מפוליסטירן בנפח 5.4 milliliter, המכילה שני milliliters של PBS עם סידן ומגנזיום.

כדי לקבל תרחיף של תאים בודדים מתאי הרשתית, השתמש בערכה לפירוק רקמה עצבית בהתאם להוראות היצרן והשהה מחדש את התאים ב-200 microliters של תמיסת צביעה. לאחר מכן, העבר את הדגימה לבאר אחת בלוחית בעלת 96 בארות עם תחתית בצורת U. לאחר סרטיפוגציה, הפוך את הלוחית כדי להסיר את הנוזל העליון וחסום את קולטני ה-FC באמצעות 25 microliters של תמיסת צביעה המכילה נוגדן CD16, CD32 לכל באר, למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

בשלב הבא, סמנו את התאים באמצעות הנוגדנים הרלוונטיים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן, השקיעו את התאים ובצעו שטיפה ב-200 microliters של תמיסת צביעה טרייה לכל באר. כעת, השביו את המשקעים ב-200 microliters של תמיסת צביעה וצבע חיוניות, והעבירו את הדגימות לשפופרות מיקרוטיטר של 1.2 milliliter.

לאחר מכן, שטפו את הבארות עם 100 µL נוספים של תמיסת צביעה וצבע חיוניות, ואספו את השטיפות יחד עם הדגימות המתאימות לצורך ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה. ניתן להשתמש בשיטה זו בעכברים לאחר לידה בני 10 עד 20 ימים או בעכברים בוגרים, וניתן להתאימה לבדיקת ההשפעה של תרכובות ו/או מניפולציה גנטית של פגוציטוזה של מיקרוגליה. לדוגמה, בניסוי זה, לאחר אתגר תוך-peritoneal במינונים שונים של LPS, נקבע כי מינון של 1.42 mg/kg של LPS גורם לעלייה מובהקת סטטיסטית באחוז המיקרוגליה הפגוציטית, בהשוואה לביקורות שקיבלו vehicle.

ברגע שהטכניקה תשלט, ניתן להשלימה בתוך שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון מיון תאים ולאחריו qPCR או אנליזה פרוטאומיקה, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע להבדלים בין מיקרוגליה פגוציטית למיקרוגליה שאינה פגוציטית ברשתית. בפיתוח טכניקה זו, אנו מצפים שעתה נוכל לאפשר למדעני ראייה ומדעי העצב לחקור לעומק את התפקוד הפגוציטי של המיקרוגליה in situ ובתוך הקשר רלוונטי פיזיולוגית.