להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic In vivo שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את התפקוד הפגוציטי של מיקרוגליה ברשתית in vivo. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום רפואת העיניים, כגון האם תרכובות מסוימות משנות את תפקוד המיקרוגליה הפגוציטי בסביבה פיזיולוגית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בציטומטריית זרימה, המאפשרת ניתוח כמותי מהיר ומדויק של פגוציטוזיס מיקרוגליה.

מי שיעזור לי להדגים את ההליך יהיה סוסומו סאקימוטו, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. התחל בהעמסת מחט ומזרק בגודל 33 עם 0.5 מיקרוליטר של תמיסת חלקיקים עם תווית פלואורסצנטית. לאחר מכן הניחו עכבר מורדם הצידה על חומר רך תחת מיקרוסקופ כירורגי ואשרו את רמת ההרגעה המתאימה על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להפעיל לחץ בזהירות סביב עפעף אחד, כך שכדור העין יצא מעט מהשקע. לאחר מכן תפסו את הראש בשתי אצבעות ממש מעל האוזן ובלסת של החיה, ומתחו בעדינות את העור במקביל לעפעפיים כדי לשמור על העין בולטת מעט מחוץ לארובה. הזרקות תוך זגוגיות הן מאתגרות, ואם לא יבוצעו כהלכה יובילו לתוצאות מוטות ומשתנות.

כדי להפחית טראומה לעין, החזק את החיה במצב יציב עם תנועת ראש מינימלית. כדי לנקב את גלגל העין, אחוז בעדינות בעכבר ביד אחת. לאחר מכן אתר את לימבוס הקרנית במקום שבו הקרנית והסקלרה מתחברות, הנראה כעיגול אפור בעכברים פיגמנטיים.

החזק את המזרק ביד השנייה, הכנס את המחט ללימבוס. לאחר מכן משוך מעט את המחט כדי להוציא נפח קטן של נוזל הזגוגית, ולחץ לאט על הבוכנה כדי להזריק את החלקיקים. לאחר שכל החרוזים נמסרו, יש למשוך לאט את המזרק כדי למנוע ריפלוקס של החומר המוזרק ולמרוח טיפות לחות כדי לשמור על לחות העין לאחר שהעין נסוגה בחזרה למקומה.

לאחר מכן הניחו את החיה על כרית חימום בכלוב משלה עם ניטור עד להתאוששות מלאה. שלוש שעות לאחר הזרקה תוך זגוגית, השתמש במלקחיים בזווית של 45 מעלות כדי ללחוץ בעדינות על העפעף כדי לחזק את גלגל העין. מקם את המלקחיים מאחורי גלגל העין ומשוך.

לאחר מכן העבירו את גלגל העין לאזור היבש של צלחת פטרי, המכילה נפח קטן של PBS עם סידן ומגנזיום תחת מיקרוסקופ מנתח. והשתמש בקצה אחד של מלקחיים עדינים במיוחד כדי לנקב את העין בלימבוס הקרנית. לאחר מכן, החזיקו את גלגל העין עם מלקחיים עדינים בזווית של 45 מעלות, השתמשו במספריים קפיציים כדי לחתוך סביב לימבוס הקרנית עד לחיתוך של כמחצית מההיקף.

העבירו את גלגל העין ל-PBS והשתמשו בזוג שני של מלקחיים עדינים בזווית של 45 מעלות כדי לקרוע את הקרנית והסקלרה. העדשה והרשתית ייצאו שלמים. יש לוודא שהעדשה והרשתית מופרדות ולהעביר את הרשתית למבחנה מפוליסטירן בנפח 5.4 מיליליטר, המכילה שני מיליליטר PBS עם סידן ומגנזיום.

כדי להשיג תרחיף תא בודד של תאי הרשתית, השתמש בערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות על פי הוראות היצרן והשהה מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של מאגר צביעה. לאחר מכן העבירו את הדגימה לבאר אחת של צלחת תחתית U של 96 בארות. לאחר הצנטריפוגה, הפוך את הצלחת כדי להשליך את הסופרנטנט ולחסום את קולטני ה-FC עם 25 מיקרוליטר של מאגר כתמים המכיל נוגדן CD16, CD32 לבאר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן סמנו את התאים עם הנוגדנים המעניינים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר מכן גלולה את התאים ולאחר מכן שטיפה של 200 מיקרוליטר של מאגר צביעה טרי לכל באר. כעת השעו את הכדורים ב-200 מיקרוליטר של מאגר כתמים וצבע כדאיות והעבירו את הדגימות לצינורות מיקרוטיטר של 1.2 מיליליטר.

לאחר מכן שטפו את הבארות עם 100 מיקרוליטר נוספים של מאגר מכתים וצבע כדאיות ואגרפו את השטיפות עם הדגימות המתאימות לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה. ניתן להשתמש בשיטה זו בעכברים בוגרים בני 10 עד 20 יום לאחר הלידה או וניתן להתאים אותה לבדיקת ההשפעה של תרכובות ו/או מניפולציה גנטית של פגוציטוזיס מיקרוגליאלית. לדוגמה, בניסוי זה לאחר אתגר תוך-צפקי עם מינונים משתנים של LPS, נקבע מינון של 1.42 מיליגרם לק"ג של LPS כגורם לעלייה מובהקת סטטיסטית באחוז המיקרוגליה הפגוציטית, בהשוואה לבקרות מאותגרות ברכב.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו מיון תאים ואחריו qPCR או ניתוח פרוטאומי, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי ההבדלים בין מיקרוגליה פגוציטית ולא פגוציטית ברשתית. בפיתוח טכניקה זו, אנו מצפים שנוכל כעת לאפשר למדעני ראייה ומוח להמשיך לחקור את התפקוד הפגוציטי של מיקרוגליה באתרו ובהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית.