טיהור טובולין עם שינויים מבוקרים לאחר טרנסלציה ואיזוטיפים ממקורות מוגבלים על ידי מחזורי פידול-דפולימריזציה

שיטה זו מאפשרת לייצר טובולין טהור בעל יכולת הרכבה עם שינויים מוגדרים לאחר התרגום בכמויות המספיקות לביצוע סטים שלמים של ניסויים במבחנה. פרוטוקול זה המבוסס על מחזורים של פילמור טובולין ודה-פילמור קל לביצוע בכל מעבדה לביולוגיה של התא. זה מאפשר לייצר כמויות טובות של טובולין עם מעט מאוד זמן מעשי.

כדי לטהר טובולין מתרביות תרחיף, תשעה ימים לפני הכנת הטובולין, החיו והגבירו את סוג התא הרצוי לקבלת שש מנות משולבות של 15 סנטימטרים. שמונה ימים לפני הכנת הטובולין, הוסיפו ליטר אחד של מדיום מחומם מראש לכל בקבוק ספינר לכל מנה מתחת לארון תרבית תאים והניחו את הספינרים על שולחן ערבוב בתוך חממת תרבית התאים. השאירו את מכסי הספינר הרוחביים פתוחים מעט כדי לאפשר למדיום להתאזן לאטמוספירה של החממה.

למחרת, השתמש בתאים מהכלים המשולבים כדי לחסן את בקבוקי הספינר. החזירו את בקבוקי הספינר לחממה למשך שבוע כשהשסתומים הרוחביים פתוחים מעט. כדי לקצור את התאים, העבירו את התרביות מבקבוקי הספינר לבקבוקי צנטריפוגה של ליטר אחד ואספו תאים על ידי צנטריפוגה.

השעו מחדש כל כדור ב-10 מיליליטר PBS קר כקרח, ואגד את התאים המרחפים בצינור של 50 מיליליטר לצנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס. עבור כדור תאים של 10 מיליליטר, הוסף 10 מיליליטר של מאגר ליזה לגלולה, והפוך את הצינור מספר פעמים כדי להשעות מחדש את התאים. כדי לטהר טובולין מתרביות תאים דבקות, יש להחיות ולהגביר את סוג התא הרצוי כדי לקבל 10 מנות קונגלונטות של 15 סנטימטר ביום הכנת הטובולין.

כדי לקצור את התאים הדבקים, לטפל בשלוש מנות בכל פעם, הטה את כלי התרבית כדי להסיר את המדיום בזמן שאדם שני שוטף בעדינות את התאים עם שבעה מיליליטר של PBS-EDTA. לאחר השטיפה, האדם השני צריך לטפל בתאים עם חמישה מיליליטר של PBS-EDTA לכל צלחת לפני שאדם שלישי ישתמש במרים תאים כדי לדחוף בעדינות את התאים לקצה אחד של המנה. לאחר ניתוק התאים, אסוף את התאים מכל שלושת הכלים לצינור של 50 מיליליטר על קרח ושטוף כל צלחת בשני מיליליטר נוספים של PBS-EDTA כדי לאסוף את התאים הנותרים.

לאחר איסוף התאים על ידי צנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט כדי לקבוע את נפח גלולת התא. הוסף את מאגר הליזה, השהה מחדש את התאים והעביר אותם לצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר. סוניקציה של התאים למשך כ-45 פולסים.

לליזה של מוח עכבר, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר מורשה למוח בודד שנקצר מעכבר בוגר והשתמש בבלנדר טישו כדי לליז את הרקמה. לאחר השגת הליזאט ב-1/100 מנפחו לנפח שווה של 2X Laemmli buffer ומרתיחים את התמיסה למשך חמש דקות. אחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לכימות

אסוף דגימה בדרך זו בכל שלב של הכנת הטובולין. כדי להבהיר את הליזאט, צנטריפוגה את הדגימה והשתמש במחט ארוכה כדי להעביר בזהירות את הסופרנטנט השקוף לצינור חדש, תוך הקפדה על הימנעות מהשכבה הצפה העליונה. לאחר הבהרת הליזאט, חיוני להסיר את החומר הצף בסופרנטנט, אחרת זה עלול להשפיע לרעה על יעילות טיהור הטובולין.

כדי לפלמר טובולין מהליזאט המובהר, מערבבים את כל נפח הסופרנטנט עם נפח 1/200 של 0.2 GTP מולרי וחצי נפח של גליצרול חם בשפופרת בגודל מתאים. פיפטה בעדינות את התערובת, הקפד להימנע מהכנסת בועות אוויר. אוטמים את הצינורות בעזרת פרפילם ומניחים אותם באמבט מים של 30 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש. כדי לבצע דה-פולימריזציה של המיקרו-צינורות הקיימים בגלולה השנייה, השעו מחדש את הגלולה ב-BRB 80 קר כקרח למשך חמש דקות על קרח. פיפטה את הדגימה תחילה עם פיפטה P1000, ואז עם פיפטה P200, כל חמש דקות למשך 20 דקות על קרח.

ברגע שהדגימה הומוגנית, צנטריפוגה אותה והעבירו את הסופרנטנט שהתקבל לצינור חדש. כדי להסיר חלבונים הקשורים למיקרו-צינוריות מהטובולין, ערבבו את כל הנפח של סופרנטנט שלוש עם נפח שווה של צינור טוחנת אחד שחומם מראש, אותו נפח של גליצרול שחומם מראש ונפח 1/100 של 0.2 GTP מולארי. דגרו את התערובת למשך 20 דקות בחום של 30 מעלות צלזיוס לפני הצנטריפוגה.

העבירו את הסופרנטנט המכיל חלבון הקשור למיקרו-צינוריות ארבע לצינור חדש, הגלולה מכילה מיקרו-צינורות מפולימרים. לאחר ביצוע פילמור ודה-פילמור שלישי, ניתן לכמת את כמות הטובולין שנקטף על ידי ניתוח דפי SDS. ניתן לאשר את הצלחת תהליך הטיהור בדף SDS מוכתם של Coomassie.

תפוקה נמוכה מהצפוי של הטובולין המטוהר יכולה לנבוע מפילמור טובולין לא יעיל כפי שמעידה כמות נמוכה יותר של טובולין בשברי הגלולה השני, הרביעי והשישי וכמות גבוהה יותר בשברי הסופרנטנט השני, הרביעי והשישי. כדי לכמת את הטובולין המטוהר, ניתן להריץ את הדגימות ליד כמויות ידועות של אלבומין בסרום בקר. צפיפות כמותית של רצועות החלבון מאפשרת לחשב את כמות הטובולין המטוהר.

ניתן לאשר את מצב השינוי של הטובולין על ידי ניתוח כתמים חיסוניים של הדגימות. הפרוטוקול שלנו מאפשר בידוד של טובולין עם שינויים מבוקרים לאחר התרגום. בעזרת טובולין זה, אנו יכולים לערוך ניסויי בנייה מחדש במבחנה המאפשרים לנו לקבוע את ההשפעה של שינויים בטובולין על תכונות מיקרו-צינוריות, כמו גם על האינטראקציות שלהם עם חלבונים הקשורים למיקרו-צינורות.