זיהוי נוגדנים מנטרלים SARS-CoV-2 באמצעות הדמיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה של זיהום פסאודווירוס

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר שיטה מהירה ויעילה למדידת נוגדנים מנטרלים נגד חלבון ספייק SARS-CoV-2 על ידי הערכת היכולת של דגימות סרום הבראה לעכב זיהום על ידי חלבון פלורסנט ירוק משופר שכותרתו וירוס סטומטיטיס פסאודוטיפ עם גליקופרוטאין ספייק.

שיטה זו מספקת דרך לענות על אחת השאלות החשובות יותר בנוגע לחיסוני SARS-coronavirus-2 בפיתוח. האם החיסון מסוגל לעורר תגובת נוגדנים מנטרלת? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה יכול להיעשות במתקן בלימה רמה 2.

זה גם יחסית מהיר וזול, מה שהופך אותו מתאים לניתוח דגימות רבות בבת אחת. כדי להדגים את הליך החומצה המנטרלת, יש לנו את ריקרדו מריוס, טכנאי בכיר במעבדה ואת טיילור ג'יימיסון, סטודנטית לדוקטורט. התחל על ידי פולחן תאי Vero E6 ב- DMEM בתוספת 10% FBS ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.

כדי לעבור את התאים, תחילה לשטוף אותם על ידי הוספת 10 מיליליטר של PBS בעדינות נדנדה המנה ארבע עד חמש פעמים. לאחר שאיפה PBS, להוסיף שלושה מיליליטר של טריפסין EDTA ולטלטל את המנה כדי להבטיח כי פני השטח כולו מכוסה לפני הדגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר שהתאים התנתקו, בטל את ה- trypsin על-ידי הוספת שבעה מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS, ולאחר מכן תנתק מחדש את התאים על-ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים.

הסר את טריפסין על ידי צנטריפוגה ושאף את supernatant מבלי להפריע גלולה התא לפני שימוש חוזר את התאים ב 10 מיליליטר של DMEM טרי. לאחר הספירה, להוסיף בערך פעם אחת 10 לתאים השביעיים לכל צלחת 15 ס"מ ולדגירה את התרבות במשך יום עד יומיים עד התאים הם 100% confluent. כדי להכין את VSV ספייק EGFP פסאודווירוס עבור titering, להדביק את התאים ב 0.01 ריבוי של זיהום עם וירוס המלאי מדולל ב 12 מיליליטר של DMEM ללא סרום.

לאחר הוספת הנגיף, לדגור על התאים במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עם נדנדה מדי פעם. בסוף הדגירה, להחליף את inoculum עם DMEM טרי בתוספת 2%FBS ו 20 ערימות מילימולר, ולאחר מכן לדגור על התאים ב 34 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. למחרת, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לדמיין את ביטוי ה- EGFP של התאים הנגועים.

לאחר אפקט ציטופתי נרחב ניתוק התא נצפים, לאסוף את התרבות supernatant ולהסיר את הפסולת על ידי צנטריפוגה. כדי למנוע מחזורי הפשרת הקפאה מרובים, aliquot supernatant לפני אחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לקבוע את titer הנגיפי, צלחת תאי Vero E6 בשש לוחות באר בצפיפות זריעה של שש פעמים 10 לתאים החמישיים לבאר ודגורה בן לילה.

למחרת, הקים סדרת דילול סדרתית פי עשרה של המניה הנגיפית על ידי הוספת 900 מיקרוליטרים של צינורות מיקרו-צנטריפוגות בינוניים עד שבעה והוספת 100 מיקרוליטרים של מלאי ויראלי לצינור הראשון. לאחר מערבולת קצרה, להעביר 100 microliters של וירוס מדולל לכל צינור עוקב, מערבולת בין כל צינור. לאחר מכן החליפו את הסופר-נט בכל באר של צלחת התרבות Vero E6 ב-500 מיקרוליטרים של ה-10 עד מינוס שניה עד 10 ב- מינוס דילול ויראלי שביעי.

לאחר דגירה של 45 דקות באינקובטור תרבית התאים עם נדנדה עדינה כל 15 דקות, החלף את האינקולום בתמיסת כיסוי ודגר את התאים ב 34 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 48 שעות. בסוף הדגירה, כדי לדמיין את הלוחות על ידי כתמים סגול קריסטל, לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS לפני הוספת שני מיליליטר של 0.1% סגול קריסטל לכל באר. מניחים את הצלחת על רוקר במשך כ -20 דקות בטמפרטורת החדר לפני שטיפת כל באר בעדינות פעמיים עם PBS.

לאחר הכביסה האחרונה, לאפשר את הצלחות לאוורר יבש לפחות שעה אחת לפני השימוש בנוסחה כפי שצוין כדי לחשב את titer של הנגיף בכל באר להרכיב יחידות פלאק למיליליטר. כדי צלחת תאים לבדיקת נטרול, להשתמש pipette רב ערוצי להוסיף 100 microliters של תאי Vero E6 לכל באר של צלחת 96 באר בצפיפות של פעמיים 10 עד התא החמישי למיליליטר, ולדגירה את הצלחת במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת, חום להמתת דגימות סרום המטופל להיבדק באמבט מים 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

לאחר מכן להגדיר סדרת דילול פי עשרה של דגימות הסרום של המטופל בצלחת תרבית 96 רקמות היטב ריקה על ידי הוספת שמונה microliters של הסרום ל 72 microliters של DMEM ללא סרום עם אנטיביוטיקה בכל באר של שורה A.ואז להוסיף 40 microliters של DMEM ללא סרום לכל באר של שורות B ל- G ו 80 microliters לכל באר של שורה H.Using 12 צינור רב ערוצי היטב, מערבבים את הדגימות בשורה A, ולאחר מכן מעבירים 40 מיקרוליטרים של המדגם מכל באר של שורה A לכל באר של שורה B.לאחר ערבוב, חזור על הדילול עבור כל שורת הבא של הבא עד שורה F.Next, להוסיף 40 microliters של VSV ספייק EGFP ב 0.05 ריבוי של זיהום לכל באר בשורות A עד G, ומערבבים על ידי צנרת ארבע עד חמש פעמים לפני הדגירה של הצלחת במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. בסוף הדגירה, שאפו בזהירות את supernatant מכל באר של צלחת התרבות Vero E6 ולהעביר 60 microliters של תערובת וירוס נוגדנים מכל באר של צלחת דילול מדגם לבאר המתאימה של צלחת תרבית התא. כאשר כל הדגימות הועברו, למקם את צלחת תרבית התא ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת עם נדנדה כל 20 דקות.

לאחר השלמת הדגירה, להוסיף 140 microliters של פתרון כיסוי carboxymethylcellose לכל באר של צלחת תרבית התא ולהעביר את הצלחת 34 מעלות צלזיוס 5% אינקובטור פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות, צלם את הלוחות על תמונה פלואורסצנטית אוטומטית באורך גל של 488 ננומטר, והשתמש בתכונת הספירה האוטומטית של התמונה כדי לכמת את מוקדי ה- EGFP הבודדים. בדוגמה מייצגת זו, נוגדן נטרול מסחרי נגד קולטן ספייק SARS-coronavirus-2 שימש כבקרה חיובית, לצד IgG כשליטה שלילית.

עיכוב האחוזים חושב בהתבסס על מספר מוקדי ה- EGFP שזוהו באמצעות הדמיה פלואורסצנטית. נטרול פסאודווירוס על ידי דגימות חולים הבראה שנאספו כשלושה חודשים לאחר ההדבקה ב-SARS-coronavirus-2 הראה כי חולים מאושפזים הראו יכולת נטרול מוגברת בהשוואה לאלה שלא נזקקו לאשפוז. הליך זה יכול לשמש גם כדי להעריך אחרים COVID-19 מניעה וסוכנים טיפוליים שמטרתם לחסום זיהום ויראלי.