Name: ייצור, תחזוקה ואפיון של אורגנואידים במעי ובמעי הגס שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: למד שיטות מתקדמות לייצור ותחזוקה של אורגנואידים במעי ובמעי הגס שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. פרוטוקולים אלה משפרים שכפוליות, קנה מידה ויעילות במחקר ביולוגיית תאי גזע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+gastrointestinal+tract%3A+twenty+years+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress.</a> Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).</li>
<li>van Klinken, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC5B+is+the+prominent+mucin+in+human+gallbladder+and+is+also+expressed+in+a+subset+of+colonic+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells.</a> American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 871-878 (1998).</li>
<li>Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Muc5b+mucin+gene%3A+cDNA+and+genomic+structures%2C+chromosomal+localization+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression.</a> Biochemical Journal. 363, Pt 3 589-598 (2002).</li>
<li>Lau, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hedgehog+signaling+promotes+development+of+mouse+and+human+enteric+neural+crest+cells%2C+based+on+single-cell+transcriptome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses.</a> Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li>
<li>Munera, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+colonic+organoids+via+transient+activation+of+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).</li>
<li>Higuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+fibroblasts+have+specialized%2C+diverse+transcriptional+phenotypes%3A+a+comprehensive+gene+expression+analysis+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts.</a> PLoS One. 10 (6), 0129241(2015).</li>
<li>Yahagi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-specific+expression+of+Hox+genes+along+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Congenital+Anomalies%22%5BJournal%5D)">Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract.</a> Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).</li>
<li>Sarvestani, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+organoids+derived+from+patients+with+ulcerative+colitis+recapitulate+colitic+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity.</a> Nature Communications. 12 (1), 262(2021).</li>
<li>Holloway, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+intestinal+organoids+with+endogenous+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).</li>
<li>Britanova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+is+a+postmitotic+determinant+for+upper-layer+neuron+specification+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex.</a> Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).</li>
<li>Jaitner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+determines+miRNA+expression+and+long-term+memory+in+the+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system.</a> Elife. 5, 17361(2016).</li>
<li>Teo, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+and+BMP4+synergistically+promote+formation+of+definitive+endoderm+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).</li>
<li>Fordham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+expanded+fetal+intestinal+progenitors+contributes+to+colon+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).</li>
<li>Tamminen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+commitment+and+maturation+of+human+pluripotent+stem+cells+is+independent+of+exogenous+FGF4+and+R-spondin1%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1.</a> PloS One. 10 (7), 0134551(2015).</li>
<li>Crespo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+colorectal+cancer+and+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing.</a> Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).</li>
<li>Lees, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids+to+study+and+modify+epithelial+cell+protection+against+Salmonella+and+other+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).</li>
<li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).</li>
<li>Jung, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-2+induces+the+in+vitro+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids.</a> Nature Communications. 9 (1), 3039(2018).</li>
<li>Woo, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+a+Wnt-telomere+feedback+loop+restores+intestinal+stem+cell+function+in+a+human+organotypic+model+of+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+APC+mutagenesis+and+familial+adenomatous+polyposis+using+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells.</a> PLoS One. 13 (7), 0200657(2018).</li>
<li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroendocrine+cells+couple+nutrient+sensing+to+nutrient+absorption+by+regulating+ion+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport.</a> Nature Communications. 11 (1), 4791(2020).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+structure-function+study+of+neurogenin3+disease-causing+alleles+during+human+pancreas+and+intestinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development.</a> Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).</li>
<li>Kumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineage-specific+transcription+factor+CDX2+navigates+dynamic+chromatin+to+control+distinct+stages+of+intestine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development.</a> Development. 146 (5), (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>תמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) 1%</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>צינור קורנינג 15 מ"ל</td><td>בז</td><td>21008-918</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>30% סוכרוז</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td><td>מיוצר ב-PBS.</td></tr><tr><td>5% סרום חמור רגיל</td><td>מעבדת ג'קסון למחקר חיסוני</td><td>017-000-121</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>צינור קורנינג 50 מ"ל</td><td>בז</td><td>21008-951</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>אקוטאז</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>A1110501</td><td>פתרון ניתוק תאים; מכסים 5 מ"ל של Accutase לתוך צינורות של 10 מ"ל בסך הכל 20 צינורות ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות; C עד 6 חודשים. מניחים ב-4 מעלות; C למשך הלילה לפני השימוש.</td></tr><tr><td>אקטיב א</td><td>מערכות הנחיית תאים</td><td>GFH6-100x10</td><td>להרכיב מחדש את האבקה הליופילית ב-100 ומיקרו; גרם/מ"ל ב-PBS סטרילי המכיל 0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA). Aliquot 38 & L של Activin A לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה מקוררים מראש ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות; C (תוקף הצינורות פג 12 חודשים מיום קבלתם).</td></tr><tr><td>אקטיווין יום 1 בינוני (RPMI 1640)</td><td>קורנינג</td><td>MT10041CV</td><td>השתמש בחומצות אמינו לא חיוניות (NEAA, Corning 11140050) ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יום בסיסי 1 בינוני: 500 מ"ל RPMI 1640 ו-500 מ"ל NEAA. בעת הכנת Activin Day 1 medium, הוסף 13 מ"ל של יום בסיסי 1 בינוני, 13 ומיקרו; l של Activin A (100 ומיקרו; גרם/מ"ל), ו-2 ומיקרו; l של BMP4 (100 ומיקרו; גרם/מ"ל). מדיום הבסיס יציב עד 3 שבועות אך יש להשתמש בו מיד לאחר הוספת גורמי גדילה.</td></tr><tr><td>אקטיב יום 2 בינוני (RPMI 1640, 0.2% נפח/נפח FBS)</td><td>שיקלון</td><td>SH30070.03T</td><td>השתמש בחומצות אמינו לא חיוניות (Corning 11140050) ואחסן בטמפרטורה של 4&0 מעלות צלזיוס. יום בסיסי 2 בינוני: 500 מ"ל RPMI 1640, 500 מ"ל NEAA ו-1 מ"ל של 0.2% סרום. בעת הכנת Activin Day 2 בינוני, יש להוסיף 12.5 מ"ל של יום 2 בינוני בסיסי ו-12.5 ומיקרו; ליטר אקטיבין A (100 ומיקרו; גרם/מ"ל). מדיום הבסיס יציב עד 3 שבועות אך יש להשתמש בו מיד לאחר הוספת גורמי גדילה.</td></tr><tr><td>Activin יום 3 בינוני (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)</td><td>שיקלון</td><td>SH30070.03T</td><td>השתמש בחומצות אמינו לא חיוניות (Corning 11140050) ואחסן בטמפרטורה של 4&0 מעלות צלזיוס. יום בסיסי 3 בינוני: 500 מ"ל RPMI 1640, 500 מ"ל NEAA ו-10 מ"ל של סרום 2%. בעת הכנת Activin Day 3 medium, הוסיפו 12.5 מ"ל של יום 3 בסיסי ו-12.5 ומיקרו; ליטר אקטיבין A (100 ומיקרו; גרם/מ"ל). מדיום הבסיס יציב עד 3 שבועות אך יש להשתמש בו מיד לאחר הוספת גורמי גדילה.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 חמור נגד עזים</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>A11055</td><td>דילול 1:500 (נוגדן משני)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 חמור נגד ארנב</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>א21206</td><td>דילול 1:500 (נוגדן משני)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 חמור נגד עכבר</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>א10036</td><td>דילול 1:500 (נוגדן משני)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 חמור נגד עכבר</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>A31571</td><td>דילול 1:500 (נוגדן משני)</td></tr><tr><td>תבנית בסיס</td><td>פישר</td><td>22-363-552</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>מדיום מעיים בסיסי (DMEM מתקדם)</td><td>ג'יבקו</td><td>12491015</td><td>&nbsp; בעת הכנת מדיום מעיים בסיסי, יש להוסיף 500 מ"ל של DMEM, 500 מ"ל של N2 (Gibco 17-502-048), 500 מ"ל של B27 (Gibco), 500 מ"ל של L-גלוטמין כדי לקבל 2 מ"ל L-גלוטמין (Corning A2916801), 5 מ"ל של 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין (Gibco 15-140-122), ו-7.5 מ"ל של&nbsp; 1 מיליון HEPES כדי לקבל 15 מ"מ HEPES.&nbsp; מדיום הבסיס יציב עד 3 שבועות אך יש להשתמש בו מיד לאחר הוספת גורמי גדילה.</td></tr><tr><td>Biorad CFX96 מערכת מגע לגילוי PCR בזמן אמת</td><td>ביורד</td><td>לא ישים</td><td>ניתן להשתמש במערכות qRT-PCR אחרות.</td></tr><tr><td>פתרון לשחזור תאים</td><td>קורנינג</td><td>354253</td><td>פתרון משפיל ECM</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>רפרוסל</td><td>4000410</td><td>להקים מחדש על ידי הוספת 2.15 מ"ל של DMSO ב-10 מ"מ. הכן 50 ומיקרו; L aliquots ומאחסנים ב-20 &deg;C.&nbsp; יש לאחסן את האבקה בטמפרטורה של 4 מעלות; C, מוגן מפני אור.</td></tr><tr><td>מדיום דפוס CTRL HIO</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td><td>מעיים בינוניים בסיסיים ו-100 ננוגרם/מ"ל EGF.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9542</td><td>דילול 1:100 (נוגדן משני)</td></tr><tr><td>DE חד-שכבתי</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td><td>חד-שכבתי נוצר בשלבים קודמים (סעיף 4.4).</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>ג'יבקו</td><td>17105041</td><td>יש להשעות מחדש את האבקה הליופילית ב-DMEM מתקדם (Gibco MT15090CV) לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל. סנן את התמיסה לעיקור על ידי שאיבת אבק באמצעות צינור עיקור מסנן Millipore. הכינו 10 מ"ל (1 מ"ג/מ"ל) ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות; C עד 6 חודשים. מניחים ב-4 מעלות; C למשך הלילה לפני השימוש.</td></tr><tr><td>EGF</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>236-EG-01M</td><td>בעת הכנת 100 ננוגרם/מ"ל EGF להרכיב מחדש 500 ומיקרו; גרם/מ"ל ב-PBS סטרילי. לאחר מכן, הוסף 2 מ"ל של PBS סטרילי ל-1 מ"ג EGF ועשה 500 ומיקרו; תמיסת EGF של גרם/מ"ל. Aliquot 100 &micro; L של EGF ב -20 צינורות.</td></tr><tr><td>פישרברנד 6 ס"מ צלחות פטרי עם מכסה שקוף</td><td>פישר</td><td>FB0875713A</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>מרים תאים פישרברנד</td><td>פישר</td><td>08-100-240</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>בקבוקוני הברגה מזכוכית שקופה של פישרברנד Class B עם סגירות מחוברות</td><td>פישר</td><td>03-338ב</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>פיפטת פסטר זכוכית בורוסיליקט חד פעמית</td><td>פישר</td><td>13-678-2D0</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>Fluoromount G מדיום הרכבה לשקופיות</td><td>VWR</td><td>100241-874</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>ג'יבקו DMEM מתקדם</td><td>ג'יבקו</td><td>12-491-023</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>עז אנטי-E-Cadherin</td><td>מו"פ מערכות D</td><td>AF648</td><td>דילול 1:400 (נוגדן ראשוני)</td></tr><tr><td>עיזים נגד SOX17</td><td>מו"פ מערכות D</td><td>AF1924</td><td>דילול 1:500 (נוגדן ראשוני)</td></tr><tr><td>מדיום דפוס HCOs</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td><td>מדיום מעיים בסיסי, 100 ננוגרם/מ"ל EGF ו-100 ננוגרם/מ"ל BMP2. בעת הכנת BMP2, הוסף 1 מ"ל של 4 מ"מ HCl 0.1% BSA סטרילי לבקבוקוני BMP2 (100 ומיקרו; ז). Aliquot 25 &micro; L של תמיסת BMP4 ב-4 צינורות.&nbsp; מדיום הבסיס יציב עד 3 שבועות אך יש להשתמש בו מיד לאחר הוספת גורמי גדילה.</td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z359629</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC)</td><td>מתקן תאי גזע פלוריפוטנטיים</td><td>לא ישים</td><td>תאים שנזרעו בצלחת מצופה מטריג'ל עם 24 בארות (Thermo Scientific 73520-906).</td></tr><tr><td>תמיסת פרפורמלדהיד 4% קרה כקרח (PFA)</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>מי מלח פוספט קר כקרח (PBS)</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td><td>ה-pH חייב להיות 7.4.</td></tr><tr><td>עט מחסום הידרופובי ImmEdge</td><td>מעבדות וקטור</td><td>101098-065</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs)</td><td>מתקן תאי גזע פלוריפוטנטיים (המרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי)</td><td>לא ישים</td><td>ניתן להשתמש בקווי hESC או iPSC אחרים, אך יש לבצע אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור כל קו תאים.</td></tr><tr><td>מיקרוטום לייקה</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>LSM 880</td><td></td><td></td><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td></tr><tr><td>מטריצת קרום מרתף Matrigel</td><td>קורנינג</td><td>354234</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>מטריצה מוסמכת hESC של Matrigel</td><td>קורנינג</td><td>354277</td><td>הכינו 4 x מטריג'ל aliquots המתאימים לנפחים המספיקים להכנת מספיק מטריג'ל מדולל ל-4 x 6 בארות.</td></tr><tr><td>מדיום אינדוקציה באמצע המעי האחורי (RPMI 1640)</td><td>קורנינג</td><td>MT10041CV</td><td>חומצות אמינו לא חיוניות (Corning 11140050), 2% נפח/נפח FBS (Hyclone SH30070.03T), 3 ומיקרו; M CHIR99021 ו-500 ננוגרם/מ"ל FGF4. מדיום הבסיס יציב עד 3 שבועות אך יש להשתמש בו מיד לאחר הוספת גורמי גדילה.</td></tr><tr><td>ספרואידים באמצע המעי האחורי</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>MilliporeSigma Steriflip יחידות מסנן ואקום חד פעמיות סטריליות</td><td>מיליפורסיגמא</td><td>SCGP00525</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>עכבר נגד CDX2</td><td>ביוג'נקס</td><td>MU392-UC</td><td>דילול 1:300 (נוגדן ראשוני)</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-FOXA2</td><td>אבנובה/נובוס</td><td>H00003170-M01</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>מדיום גידול מלא mTeSR1</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>85870</td><td>הוסף 100 מ"ל של תוסף mTeSR (85870) למדיום mTeSR אחד של 400 מ"ל (85870) ומנה לתוך צינורות של 50 מ"ל תוך הימנעות מזיהום. יש לאחסן בטמפרטורה של 4&00 מעלות; C עד השימוש.</td></tr><tr><td>הפתרון הקליר של מוריי (הידוע גם בשם BABB)</td><td>של מוריי</td><td>לא ישים</td><td>1:2 בנזיל בנזואט ובנזיל אלכוהול.</td></tr><tr><td>מדיום דפוס NOG HIO</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td><td>מדיום מעיים בסיסי, 100 ננוגרם/מ"ל EGF ו-100 ננוגרם/מ"ל NOGGIN (דיספציה 25 ומיקרו; גרם של NOGGIN ב-250 ומיקרו; l PBS סטרילי עם 0.1% BSA).</td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA</td><td>טאקארה</td><td>740955.25</td><td>ניתן להשתמש בערכות בידוד RNA אחרות.</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות פני השטח של דלתא Nunclon 24 בארות (Nunc)</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>73521-004</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות פני השטח של Nunclon דלתא 24 בארות מצופות במטריג'ל</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>73521-004</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות פני השטח של דלתא Nunclon 6 בארות (Nunc)</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>73520-906</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות משטח דלתא Nunclon 6 בארות מצופות ב&nbsp; מטריגל.</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>73520-906</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>מצע צמיחה עבור HIOs, CTRL HIO ו-HCOs</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td><td>מדיום מעיים בסיסי ו-100 ננוגרם/מ"ל EGF (ריכוז סופי)</td></tr><tr><td>חוצץ פוספט מלוח, 0.5% טריטון X (PBS-T)</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>פריימרים</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות בע"מ (IDT)</td><td>לא ישים</td><td>הפריימרים מופיעים בטבלה 2 בפרוטוקול.</td></tr><tr><td>ארנב נגד CDX2</td><td>סמל תא</td><td>EPR22764Y</td><td>דילול 1:100 (נוגדן ראשוני)</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-SATB2</td><td>סמל תא</td><td>EP281</td><td>דילול 1:100 (נוגדן ראשוני)</td></tr><tr><td>חלבון BMP-4 אנושי רקומביננטי</td><td>מו"פ מערכות D</td><td>314 -BP-010</td><td>להרכיב מחדש את האבקה הליופילית ב-100 ומיקרו; גרם/מ"ל ב-4 מ"מ HCl סטרילי המכיל 0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA). הוסף תמיסת HCl של 4.17 מ"ל ל-45.83 מ"ל מים מולקולריים בסך הכל 50 מ"ל של 1 M HCl. לאחר מכן הוסף 200 ומיקרו; L של 1 M HCl עד 49.8 מ"ל של מים בדרגה מולקולרית בסך הכל 50 מ"ל של 4 מ"מ HCl. לאחר מכן, הוסף 0.05 גרם BSA ל-50 מ"ל של 4 מ"מ HCl וסנן כדי להפוך לסטרילי. Aliquot סטרילי 4 מ"מ HCl 0.1% BSA עד 33 צינור מיקרו-צנטריפוגה בסך הכל ומאחסנים ב-20 מעלות צלזיוס. הוסף 100 &micro; l של 4 מ"מ HCl סטרילי 0.1% BSA לבקבוקוני BMP4 (10 ומיקרו; ז) לייצר תמיסת BMP4 ב-100 ומיקרו; גרם/מ"ל.</td></tr><tr><td>חלבון FGF-4 אנושי רקומביננטי</td><td>מו"פ מערכות D</td><td>235-F4-01M</td><td>להקים מחדש ב-100 ומיקרו; גרם/מ"ל ב-PBS סטרילי המכיל 0.1% אלבומין בסרום בקר. הוסף 0.05 גרם BSA ב-50 מ"ל PBS כדי ליצור 0.1% BSA. סינון 0.22 ומיקרו; M BSA כדי לעקר את ה-BSA. Aliquot 10 מ"ל של 0.1% BSA ב-5 צינורות. הוסף 1 מ"ג FGF-4 ב-10 מ"ל של 0.1% BSA סטרילי. Aliquot 250 &micro; L לתוך 40 צינורות מיקרו-צנטריפוגה מקוררים מראש ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>מעכב ROCK Y-27632</td><td>טוקריס</td><td>1254</td><td>הריכוז הסופי הוא 10 מ"מ (10 ממול/ליטר). השעו מחדש ב-DMSO ב-10 מ"מ ועיקרו מסנן. הוסף 3 מ"ל PBS סטרילי לכל בקבוקון. Aliqout 100 ומיקרו; L של מעכב ROCK ב-30 צינורות ומאחסנים ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>ערכת סינתזה של SuperScript VILO cDNA</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>11-754-250</td><td>לא ישים</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ SuperFrost Plus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תרכובת Tissue Tek O.C.T</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>לא ישים</td></tr></tbody></table>

ייצור, תחזוקה ואפיון של אורגנואידים במעי ובמעי הגס שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Generation, Maintenance, and Characterization of Human Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal and Colonic Organoids

היצירה המוצלחת של ספרואידים בשלב האינדוקציה האמצעית/אחורית מעידה על דפוס מוצלח. בצע צביעת IF עבור CDX2 על ספרואידים צפים ועל החד-שכבתי כדי לאשר שהדפוס נכון. למרות שצביעה בשלב האנדודרם הסופי (DE) יכולה להצביע על היעילות של אינדוקציה DE, יצירת ספרואידים אינה אפשרית ללא אינדוקציה יעילה של DE. כדי לבדוק את היעילות של אינדוקציה DE, בצע צביעת IF ו/או RT-qPCR עבור FOXA2 ו-SOX17.
לאחר שלב הדפוס, הביטוי של גורמי HOX הוא האינדיקטור הטוב ביותר לדפוס מוצלח. גורמי HOX באים לידי ביטוי בעיקר במזנכימה של המעי...

Intestinal regional specification describes a process through which unique morphology and function are imparted to defined areas of the developing ...

הפרוטוקול הבא מתאר דור של אורגנואידים במעי האנושי ובמעי הגס מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. טכניקה זו תאפשר למשתמש לחקור מסלולים המעורבים בדפוסי מעיים. טכניקה זו מאפשרת למשתמש לייצר אורגנואידים איזוגניים ספציפיים לאזור. פרוטוקול זה יכול לספק תובנה לגבי הגורמים המווסתים את הקמתם ותחזוקתם של דפוסי מעיים.[קריין] התחל בהנחת מטריצה חוץ-תאית או צלחת 24 בארות מצופה ECM בתוך ארון בטיחות ביולוגית למשך 30 דקות כדי לאפשר לה להגיע לטמפרטורת החדר. הנח את תמיסת ניתוק התאים הבינונית השלמה mTeSR1 ו-DMEM מתקדם בתוך אמבט חרוזים של 37 מעלות צלזיוס ואפשר להם להתחמם למשך 30 דקות. הכן את מדיום הציפוי בצינור חרוטי של 50 מיליליטר על ידי הוספת 13 מיליליטר של mTeSR1 ו-13 מיקרוליטר של 10 מיליליטר Y-27632 חלבון קינאז הקשור ל-Rho או מעכב ROCK. כדי לאסוף תאים מצלחת שש הבארות, שאפו את המדיום משלוש לארבע בארות ושטפו פעם אחת עם שני מיליליטר DMEM מתקדם לכל באר. שאפו את ה-DEM המתקדם, והוציאו מיליליטר אחד של תמיסת דיסוציאציה של התאים לכל באר. דגרו את הצלחת למשך חמש עד שבע דקות בתוך אינקובטור של 5% פחמן דו חמצני, 37 מעלות צלזיוס. נתק כל גושי תאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ארבע עד חמש פעמים באמצעות פיפטה של חמישה מיליליטר להכנת תרחיף התא. הוסף שני מיליליטר של DMEM מתקדם לכל באר. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה ארבע עד חמש פעמים והעבירו לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. סובב את התאים בחום של 300 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את המדיום מהצינור מבלי לשאוב את כדור התא. ולהוסיף שישה מיליליטר מהמדיום המוכן של מעכב mTeSR1 בתוספת ROCK. השעו בעדינות את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש עד ארבע פעמים. לאחר מכן העבירו את המתלה לשאר המדיום מעכב mTeSR1 ו-ROCK בתוך צינור ה-50 מיליליטר. השעו מחדש במרץ ארבע עד חמש פעמים וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. שאפו את ה-ECM מלוח 24 הבארות ממש לפני ציפוי התאים. השעו את התאים שוב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש, והוציאו 0.5 מיליליטר מתרחיף התאים בכל באר. נדנד בעדינות את הצלחת שלוש פעמים בכיוון השעון, שלוש פעמים נגד כיוון השעון, שלוש פעמים קדימה ואחורה, ושלוש פעמים מצד לצד כדי לפזר את התאים באופן שווה. מעבירים את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, ודוגרים למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, שאפו את המדיום המושקע. הוסף 0.5 מיליליטר לבאר של mTeSR1, ודגר שוב למשך 24 שעות באותם תנאים. הכן את המדיום השלם של Activin ביום הראשון על ידי דילול של 100 מיקרוגרם למיליליטר תמיסת מלאי Activin A, ו-100 מיקרוגרם למיליליטר BMP4 למדיום Activin ביום הראשון בצינור חרוטי. מחממים את המדיום באמבט חרוזים של 37 מעלות צלזיוס. שאפו את מדיום ה-mTeSR1 מצלחת 24 הבארות והוסיפו 0.5 מיליליטר של Activin יום אחד לכל באר. מניחים את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, ודוגרים למשך 24 שעות. בדוק את התאים לאחר 24 שעות. הכן את המדיום השלם של Activin ביום השני על ידי דילול תמיסת מלאי של 100 מיקרוגרם למיליליטר Activin A למדיום Activin יום שני בצינור חרוטי, והנח את הצינור באמבט חרוזים של 37 מעלות צלזיוס. הסר את צלחת הבידול של 24 בארות מחממת הפחמן הדו חמצני, והסר את המדיום המושקע. יש להוציא 0.5 מיליליטר של Activin מחומם מראש ביום השני לבאר, ולהחזיר את הצלחת לתוך חממת הפחמן הדו חמצני למשך 24 שעות. הכן את המדיום השלם של Activin ביום השלישי על ידי דילול תמיסת מלאי של 100 מיקרוגרם למיליליטר Activin A למדיום Activin יום שלישי בצינור חרוטי, והנח את הצינור באמבט חרוזים של 37 מעלות צלזיוס. הסר את המדיום המושקע, והוציאו 0.5 מיליליטר של Activin יום שלישי בינוני לכל באר. כדי להתחיל בבידול של אנדודרם סופי לספרואידים באמצע המעי האחורי, הוסף 25 מיליליטר של מדיום אינדוקציה באמצע המעי האחורי עם FGF4 בצינור חרוטי של 50 מיליליטר, והנח אותו באמבט חרוזים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כדי להכין את מדיום האינדוקציה השלם באמצע המעי האחורי, הוסף 7.5 מיקרוליטר CHIR99021 לאחר שהמדיום חם. הסר את המדיום המושקע, חלק 0.5 מיליליטר של מדיום אינדוקציה באמצע המעי האחורי לבאר, ודגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. לאחר שעיבוי התאים בתוך השכבה החד-שכבתית התרחש למחרת, החלף את המדיום המושקע במדיום אינדוקציה טרי באמצע המעי האחורי והנח את הצלחת בחזרה לדגירה למשך 24 שעות. כדי להימנע מהשלכת הספרואידים הצפים בזמן החלפת המדיום, העבירו את המדיום הישן לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-300 גרם למשך דקה אחת. השעו מחדש את הספרואידים ב -12.5 מיליליטר של מדיום אינדוקציה טרי באמצע המעי האחורי, הוסיפו 0.5 מיליליטר לבאר לאותה צלחת של 24 בארות, ודגרו למשך 24 שעות בחממה. ביום הרביעי של השראת המעי האחורי, קצרו ספרואידים צפים מבארות הצלחת על ידי איסוף המדיום לתוך צינור של 15 מיליליטר, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-300 גרם למשך דקה אחת. היעילות של אינדוקציה אנדודרמית סופית הוערכה על ידי ביצוע צביעה אימונופלואורסצנטית עבור FOXA2 ו-SOX17. הביטוי של mRNA של גורם HOX הקדמי HOXD3 נמצא כגבוה ביותר באורגנואידים במעי אנושי שטופלו בנוגין, פחות בגורם גדילת אפיתל או HIO שטופלו ב-EGF, והנמוך ביותר באורגנואידים אנושיים במעי הגס או HCOs שטופלו ב-BMP. לעומת זאת, ביטויי mRNA של HOXA13 ו-HOXD13 נמצאו נמוכים ב-HIO וגבוהים ב-HCOs. צביעה אימונופלואורסצנטית בוצעה עבור SATB2, CDX2 ו-CDH1 כדי לקבוע אם אפיתל ה-HCO היה מעוצב כראוי.

generation-maintenance-characterization-human-pluripotent-stem-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים שיטה להקמת אנטרואידים אנושיים מקריפטות מעי דק וקולונואידים מקריפטות המעי הגס שנאספו הן מרקמות כירורגיות והן מביופסיות. במאמר מתודולוגי זה, אנו מציגים את אופני התרבות החיוניים לצמיחה ותחזוקה מוצלחת של אנטרואידים וקולונואידים אנושיים.

הקמתו של ארגון Human אפיתל Enteroids וColonoids מרקמות שלמות וביופסיה

פרוטוקול זה מתאר את המדידה של מחסום האפיתל חדירות בטיפול תרופתי בזמן אמת הבאים בהאדם organoids מעיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחיות התא מיקרוסקופ.

בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים

פרוטוקול זה מאפשר התמיינות של תאים פלוריפוטנטיים אנושיים לאורגנואידי מעיים. הפרוטוקול מחקה התפתחות אנושית תקינה על ידי התמיינות תאים לאוכלוסייה של אנדודרם סופי, אנדודרם של המעי האחורי ולאחר מכן אפיתל מעיים. זה הופך את הפרוטוקול למתאים לחקר התפתחות מעיים כמו גם יישומי מידול מחלות.

יצירת אורגנואידי מעיים שמקורם ב-hiPSC עבור יישומים התפתחותיים ומידול מחלות

אורגנואידים במעיים שמקורם בביופסיה וטכנולוגיות של איברים על שבבים משולבים בפלטפורמה מיקרופיזיולוגית כדי לשחזר את פונקציונליות המעי הספציפית לאזור.

שילוב של אורגנואידים אנושיים וטכנולוגיית איברים על שבב כדי ליצור מודל של פונקציונליות ספציפית לאזורי מעיים

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד קריפטים של מעי דק מורין ואורגנואידים תלת-ממדיים של תרבית מעיים מהקריפטים. בנוסף, אנו מתארים שיטה ליצירת אורגנואידים מתא גזע יחיד במעי בהיעדר נישה תאית תת-אפיתלית.

תרבית תלת-ממדית של אורגנואידים מקריפטים של מעי מורין ותא גזע יחיד למחקר אורגנואידים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במעיים של חולדות ומשתמשים בהם במספר יישומים במורד הזרם. חולדות הן לעתים קרובות מודל פרה-קליני מועדף, ומערכת אורגנואיד המעי החזקה ממלאת את הצורך במערכת חוץ גופית שתלווה מחקרי vivo .

יצירה ומניפולציה של אורגנואידים במעיים של חולדות

אורגנואידים הפכו לכלים רבי ערך למידול מחלות. המטריצה החוץ תאית (ECM) מנחה את גורל התא במהלך יצירת אורגנואידים, ושימוש במערכת הדומה לרקמה הטבעית יכול לשפר את דיוק המודל. מחקר זה משווה את הדור של אורגנואידי מעיים אנושיים המושרים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע אנושיים ב- ECM שמקורו בבעלי חיים ובהידרוג'לים נטולי קסנו.

מחקר השוואתי של מטריצות קרום מרתף לתחזוקת תאי גזע אנושיים ויצירת אורגנואידים במעי

יש לעצב אורגנואידים במעי האנושי כדי לסכם טוב יותר את המבנה והתפקוד של המעי האנושי הילידי. כאן, אנו מציגים שיטה אחת לשילוב מערכת עצבים מעי במבנים אלה.

עצבנות של אורגנואידים במעי האנושי

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במעי אפיקליים מתרביות אורגנואידים סטנדרטיות משובצות מטריצה. הוא גם מתאר את השילוב הבא של EdU בתאים המתרבים באופן פעיל ואת הכימות האוטומטי למחצה של תאים חיוביים ל-EdU.

יצירת אורגנואידים במעי אפיקלי החוצה והערכת קצב התפשטות האורגנואידים באמצעות תיוג EdU

אנו מציגים שלושה פרוטוקולי רומן ויעילים יותר להבחנה תא גזע מושר אנושי לתוך cardiomyocytes, תאי אנדותל, ותאי שריר חלק ו שיטת הצגה המשפר את engraftment של תאים מושתלים על ידי שילוב הזרקת תא עם משלוח ציטוקינים בתיווך תיקון.

תאי גזע פלוריפוטנטיים נגזרים תאי לב לתיקון שריר לב

למד שיטות מתקדמות לייצור ותחזוקה של אורגנואידים במעי ובמעי הגס שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. פרוטוקולים אלה משפרים שכפוליות, קנה מידה ויעילות במחקר ביולוגיית תאי גזע.

ייצור, תחזוקה ואפיון של אורגנואידים במעי ובמעי הגס שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

גלה סרטונים נוספים