ייצור, תחזוקה ואפיון של אורגנואידים במעי ובמעי הגס שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

הפרוטוקול הבא מתאר דור של אורגנואידים במעי האנושי ובמעי הגס מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. טכניקה זו תאפשר למשתמש לחקור מסלולים המעורבים בדפוסי מעיים. טכניקה זו מאפשרת למשתמש לייצר אורגנואידים איזוגניים ספציפיים לאזור. פרוטוקול זה יכול לספק תובנה לגבי הגורמים המווסתים את הקמתם ותחזוקתם של דפוסי מעיים.

[קריין] התחל בהנחת מטריצה חוץ-תאית או צלחת 24 בארות מצופה ECM בתוך ארון בטיחות ביולוגית למשך 30 דקות כדי לאפשר לה להגיע לטמפרטורת החדר. הנח את תמיסת ניתוק התאים הבינונית השלמה mTeSR1 ו-DMEM מתקדם בתוך אמבט חרוזים של 37 מעלות צלזיוס ואפשר להם להתחמם למשך 30 דקות. הכן את מדיום הציפוי בצינור חרוטי של 50 מיליליטר על ידי הוספת 13 מיליליטר של mTeSR1 ו-13 מיקרוליטר של 10 מיליליטר Y-27632 חלבון קינאז הקשור ל-Rho או מעכב ROCK. כדי לאסוף תאים מצלחת שש הבארות, שאפו את המדיום משלוש לארבע בארות ושטפו פעם אחת עם שני מיליליטר DMEM מתקדם לכל באר. שאפו את ה-DEM המתקדם, והוציאו מיליליטר אחד של תמיסת דיסוציאציה של התאים לכל באר. דגרו את הצלחת למשך חמש עד שבע דקות בתוך אינקובטור של 5% פחמן דו חמצני, 37 מעלות צלזיוס. נתק כל גושי תאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ארבע עד חמש פעמים באמצעות פיפטה של חמישה מיליליטר להכנת תרחיף התא. הוסף שני מיליליטר של DMEM מתקדם לכל באר. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה ארבע עד חמש פעמים והעבירו לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. סובב את התאים בחום של 300 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את המדיום מהצינור מבלי לשאוב את כדור התא. ולהוסיף שישה מיליליטר מהמדיום המוכן של מעכב mTeSR1 בתוספת ROCK. השעו בעדינות את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש עד ארבע פעמים. לאחר מכן העבירו את המתלה לשאר המדיום מעכב mTeSR1 ו-ROCK בתוך צינור ה-50 מיליליטר. השעו מחדש במרץ ארבע עד חמש פעמים וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. שאפו את ה-ECM מלוח 24 הבארות ממש לפני ציפוי התאים. השעו את התאים שוב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש, והוציאו 0.5 מיליליטר מתרחיף התאים בכל באר. נדנד בעדינות את הצלחת שלוש פעמים בכיוון השעון, שלוש פעמים נגד כיוון השעון, שלוש פעמים קדימה ואחורה, ושלוש פעמים מצד לצד כדי לפזר את התאים באופן שווה. מעבירים את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, ודוגרים למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, שאפו את המדיום המושקע. הוסף 0.5 מיליליטר לבאר של mTeSR1, ודגר שוב למשך 24 שעות באותם תנאים. הכן את המדיום השלם של Activin ביום הראשון על ידי דילול של 100 מיקרוגרם למיליליטר תמיסת מלאי Activin A, ו-100 מיקרוגרם למיליליטר BMP4 למדיום Activin ביום הראשון בצינור חרוטי. מחממים את המדיום באמבט חרוזים של 37 מעלות צלזיוס. שאפו את מדיום ה-mTeSR1 מצלחת 24 הבארות והוסיפו 0.5 מיליליטר של Activin יום אחד לכל באר. מניחים את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, ודוגרים למשך 24 שעות. בדוק את התאים לאחר 24 שעות. הכן את המדיום השלם של Activin ביום השני על ידי דילול תמיסת מלאי של 100 מיקרוגרם למיליליטר Activin A למדיום Activin יום שני בצינור חרוטי, והנח את הצינור באמבט חרוזים של 37 מעלות צלזיוס. הסר את צלחת הבידול של 24 בארות מחממת הפחמן הדו חמצני, והסר את המדיום המושקע. יש להוציא 0.5 מיליליטר של Activin מחומם מראש ביום השני לבאר, ולהחזיר את הצלחת לתוך חממת הפחמן הדו חמצני למשך 24 שעות. הכן את המדיום השלם של Activin ביום השלישי על ידי דילול תמיסת מלאי של 100 מיקרוגרם למיליליטר Activin A למדיום Activin יום שלישי בצינור חרוטי, והנח את הצינור באמבט חרוזים של 37 מעלות צלזיוס. הסר את המדיום המושקע, והוציאו 0.5 מיליליטר של Activin יום שלישי בינוני לכל באר. כדי להתחיל בבידול של אנדודרם סופי לספרואידים באמצע המעי האחורי, הוסף 25 מיליליטר של מדיום אינדוקציה באמצע המעי האחורי עם FGF4 בצינור חרוטי של 50 מיליליטר, והנח אותו באמבט חרוזים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כדי להכין את מדיום האינדוקציה השלם באמצע המעי האחורי, הוסף 7.5 מיקרוליטר CHIR99021 לאחר שהמדיום חם. הסר את המדיום המושקע, חלק 0.5 מיליליטר של מדיום אינדוקציה באמצע המעי האחורי לבאר, ודגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. לאחר שעיבוי התאים בתוך השכבה החד-שכבתית התרחש למחרת, החלף את המדיום המושקע במדיום אינדוקציה טרי באמצע המעי האחורי והנח את הצלחת בחזרה לדגירה למשך 24 שעות. כדי להימנע מהשלכת הספרואידים הצפים בזמן החלפת המדיום, העבירו את המדיום הישן לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-300 גרם למשך דקה אחת. השעו מחדש את הספרואידים ב -12.5 מיליליטר של מדיום אינדוקציה טרי באמצע המעי האחורי, הוסיפו 0.5 מיליליטר לבאר לאותה צלחת של 24 בארות, ודגרו למשך 24 שעות בחממה. ביום הרביעי של השראת המעי האחורי, קצרו ספרואידים צפים מבארות הצלחת על ידי איסוף המדיום לתוך צינור של 15 מיליליטר, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-300 גרם למשך דקה אחת. היעילות של אינדוקציה אנדודרמית סופית הוערכה על ידי ביצוע צביעה אימונופלואורסצנטית עבור FOXA2 ו-SOX17. הביטוי של mRNA של גורם HOX הקדמי HOXD3 נמצא כגבוה ביותר באורגנואידים במעי אנושי שטופלו בנוגין, פחות בגורם גדילת אפיתל או HIO שטופלו ב-EGF, והנמוך ביותר באורגנואידים אנושיים במעי הגס או HCOs שטופלו ב-BMP. לעומת זאת, ביטויי mRNA של HOXA13 ו-HOXD13 נמצאו נמוכים ב-HIO וגבוהים ב-HCOs. צביעה אימונופלואורסצנטית בוצעה עבור SATB2, CDX2 ו-CDH1 כדי לקבוע אם אפיתל ה-HCO היה מעוצב כראוי.