Name: אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: חקור תכונות אלקטרופיזיולוגיות של סינפסות ספציפיות באמצעות שיטות אופטוגנטיות בפרוסות מוח אקוטיות ממכרסמים. פרוטוקול זה מאפשר חקירת מסלולים מרחביים ופלסטיות סינפטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענק Wellcome 206401/Z/17/Z. ברצוננו להודות לזפאר בשיר על חונכותו המקצועית ולד"ר קלייר בות' על הסיוע הטכני וההערות על כתב היד.

<ol><li>Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+memory%3A+an+evaluation+of+the+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li>
<li>Poorthuis, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+modulation+of+the+prefrontal+cortex+by+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors.</a> Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).</li>
<li>Scala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+4+of+mouse+neocortex+differs+in+cell+types+and+circuit+organization+between+sensory+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas.</a> Nature Communications. 10 (1), 4174(2019).</li>
<li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20(2015).</li>
<li>Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection-specific+neuromodulation+of+medial+prefrontal+cortex+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons.</a> Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).</li>
<li>Whitaker, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+modulation+of+intrinsic+excitability+in+rat+prelimbic+cortex+neuronal+ensembles+and+non-ensembles+after+operant+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning.</a> Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).</li>
<li>Skrede, K. K., Westgaard, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transverse+hippocampal+slice%3A+a+well-defined+cortical+structure+maintained+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro.</a> Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).</li>
<li>van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+memory%3A+an+interactive+overview+of+the+parahippocampal-hippocampal+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).</li>
<li>Cruikshank, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamic+control+of+layer+1+circuits+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex.</a> Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+patch-clamp+recordings+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).</li>
<li>Booker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+acute+brain+slices+from+the+dorsal+pole+of+the+hippocampus+from+adult+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).</li>
<li>Anderson, W. W., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capabilities+of+the+WinLTP+data+acquisition+program+extending+beyond+basic+LTP+experimental+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).</li>
<li>Basu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+hippocampal+activity%2C+plasticity%2C+and+memory+by+entorhinal+cortex+long-range+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition.</a> Science. 351 (6269), (2016).</li>
<li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li>
<li>Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+prefrontal+cortex+induced+by+coordinated+synaptic+transmission+arising+from+reuniens%2Frhomboid+nuclei+and+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus.</a> Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li>
<li>Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+biocytin-filled+and+processed+sections+for+neurochemical+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).</li>
<li>Jones, B. F., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cingulate+cortex+projections+to+the+parahippocampal+region+and+hippocampal+formation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat.</a> Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).</li>
<li>Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediodorsal+and+ventromedial+thalamus+engage+distinct+L1+circuits+in+the+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex.</a> Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition%2C+excitation+and+bistable+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).</li>
<li>Mattis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals%3A+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li>
<li>Marshel, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+layer-specific+critical+dynamics+triggering+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception.</a> Science. 365 (6453), (2019).</li>
<li>Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotypes+1%2C+8%2C+and+9+share+conserved+mechanisms+for+anterograde+and+retrograde+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport.</a> Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), 76310(2013).</li>
<li>Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+labeling+of+inhibitory+and+excitatory+cortical+neurons+by+endogenous+tropism+of+adeno-associated+virus+and+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors.</a> Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).</li>
<li>Dimidschstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+strategy+for+targeting+and+manipulating+interneurons+across+vertebrate+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).</li>
<li>Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+tracing+success+depends+critically+on+helper+virus+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6(2020).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+7th+edn%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22Paxinos+and+Franklin%27s+the+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%2C+Compact.+5th+edn%22">Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn</a>. , Academic Press. (2019).</li>
<li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li>
<li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li>
<li>Xia, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+and+Thalamic+Interaction+with+Amygdala-to-Accumbens+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).</li>
<li>Anisimova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spike-timing-dependent+plasticity+rewards+synchrony+rather+than+causality%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality.</a> BioRxiv. , (2021).</li>
<li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus+coeruleus+and+dopaminergic+consolidation+of+everyday+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory.</a> Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה לחקור הקרנות סינפטיות ארוכות טווח ספציפיות ביותר באמצעות שילוב של ניתוחים סטריאוטקסיים כדי לספק AAVs המקודדים מבנים אופטוגנטיים, ואלקטרופיזיולוגיה בפרוסות מוח חריפות (איור 1). יחד טכניקות אלה מציעות כלים לאפיון הפיזיולוגיה והפלסטיות של מעגלים מוחיים בדיוק גבוה במסלולים ארוכי טווח ומפוזרים אנטומית שלא היו נגישים בעבר באמצעות גירוי חשמלי מסורתי, לא ספציפי. שילוב עם סמנים מולקולריים ספציפיים לתא מאפשר אפיון של הקרנות מאזור מוח אחד לאוכלוסיות תאים מוגדרות שונות באזו...

הבנת הפיזיולוגיה של הסינפסות וכיצד הן עוברות שינויים פלסטיים היא בסיסית להבנת האופן שבו רשתות מוחיות מתפקדות במוח בריא1, וכיצד הן מתפקדות בהפרעות מוחיות. השימוש בפרוסות מוח חריפות של ex vivo מאפשר הקלטה של הפעילות החשמלית של סינפסות מנוירונים בודדים עם יחס אות לרעש גבוה באמצעות הקלטות של מהדק טלאי שלם. שליטה בפוטנציאל הממברנה ומניפולציה פרמקולוגית פשוטה מאפשרת בידוד של תת-סוגים של קולטנים. ניתן לבצע הקלטות אלה בספציפיות מעודנת כדי לזהות את הנוירון הפוסט-סינפטי, כולל מיקום למינרי ותת-אזורי2, מורפולוגיה תאית3, נוכחות של סמנים מולקולריים4, התחזיות האפקטיביות שלו5, או אפילו אם הוא היה פעיל לאחרונה6.
עם זאת, השגת ספציפיות של תשומות קדם-סינפטיות היא, עם זאת, קצת יותר מאתגרת. השיטה הקונבנציונלית השתמשה באלקטרודות גירוי כדי לעורר את האקסונים הפועלים בלמינה מסוימת. דוגמה לכך היא בהיפוקמפוס, שם גירוי מקומי בשכבה רדיאטום מפעיל סינפסות שמקרינות מ-CA3 לתת-השדה CA17. במקרה זה, הספציפיות הקדם-סינפטית מושגת כאשר קלט CA3 מייצג את הקלט המעורר היחיד הממוקם בתוך רדיאטום שכבה אשר מקרין לתאים פירמידליים CA18. רמה גבוהה זו של ספציפיות קלט הניתנת להשגה עם הפעלה קדם-סינפטית חשמלית קונבנציונלית של אקסונים CA3-CA1 היא, עם זאת, יוצא מן הכלל אשר בא לידי ביטוי במחקר אינטנסיבי כי סינפסה זו היה נתון. באזורים אחרים במוח, אקסונים ממסלולים רבים מתקיימים יחד באותה למינה, לדוגמה, בשכבה 1 של ניאוקורטקס9, ובכך הופכים גירוי קדם-סינפטי ספציפי לקלט לבלתי אפשרי עם אלקטרודות מגרה קונבנציונליות. זה בעייתי מכיוון שלקלטים סינפטיים שונים עשויות להיות תכונות פיזיולוגיות שונות; לכן, הגירוי המשותף שלהם עלול להוביל לאפיון שגוי של הפיזיולוגיה הסינפטית.
הופעתה של האופטוגנטיקה, הקידוד הגנטי של חלבוני ממברנה רגישים לאור (אופסינים) כגון channelrhodopsin-2 (ChR2), אפשרה הרחבה עצומה של אפשרויות לחקר תחזיות סינפטיות מבודדות בין אזורי מוח10,11. כאן אנו מתארים פתרון הניתן להכללה ובעלות נמוכה לחקר פיזיולוגיה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות. המבנים האופטוגנטיים מועברים באופן ספציפי מאוד באמצעות וקטורים נגיפיים המאפשרים שליטה מדויקת ביותר באזור העניין הקדם-סינפטי. הקרנות אפרנט יבטאו את הערוץ המופעל על ידי האור ויאפשרו הפעלה של סיבים אלה באזור מטרה. לפיכך, ניתן לחקור מסלולים ארוכי טווח, מפוזרים אנטומית, שלא ניתן להפעילם באופן עצמאי על ידי גירוי חשמלי מסורתי, לא ספציפי.
אנו מתארים, כמסלול לדוגמה, התמרה של קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית (mPFC) עם וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) המקודדים אופסינים של תעלת קטיון מעוררת. לאחר מכן אנו מתארים את ההכנה של פרוסות חריפות מקליפת המוח האנטורינלית הלטרלית (LEC), הקלטות של מהדקי טלאי מנוירונים פירמידליים של LEC בשכבה 5, והפעלה מעוררת אור של תחזיות mPFC-LEC גלוטמטרגיות (איור 1). אנו מתארים גם את ההערכה ההיסטולוגית של אתר ההזרקה כדי לאשר את המיקום של האזור הקדם-סינפטי של עניין וזיהוי של מורפולוגיה של תאים פוסט-סינפטיים.

<table><tbody><tr><td>צינור 0.2 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>12134102</td><td></td></tr><tr><td>10 ומיקרו; L פיפטה</td><td>גילסון</td><td>FD10001</td><td></td></tr><tr><td>24 באר צלחת</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>3 כיווני שסתום לואר</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-30600-02</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diaminobenzidine (DAB) מצע</td><td>וקטור מעבדות</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>40x אובייקטיבי</td><td>אולימפוס</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>4-אמינופירידין</td><td>, שלום ביו</td><td>HB1073</td><td></td></tr><tr><td>4x אובייקטיבי</td><td>אולימפוס</td><td>PLN4X/0.1</td><td></td></tr><tr><td>AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry</td><td>Addgene</td><td>35512</td><td>טיטר ויראלי: 3.3x1013 GC/ml</td></tr><tr><td>עדשה אכרומטית</td><td>Edmund Optics</td><td>49363</td><td>מתמקדת בספקטרום הראייה ובמיקרו-צנטריפוגה ספסל קרוב ל-IR</td></tr><tr><td></td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1005*</td><td></td></tr><tr><td>ביוציטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>G150F-6</td><td></td></tr><tr><td>בר</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה - Qimaging Retiga אלקטרו</td><td>פוטומטריה</td><td>01-ELECTRO-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>קרבכול</td><td>Tocris</td><td>2810</td><td></td></tr><tr><td>כלורהקסידין קרצוף כירורגי</td><td>Vetasept</td><td>XHG008</td><td></td></tr><tr><td>קוצץ</td><td>Andis</td><td>22445</td><td>AGC סופר 2 מהירויות להב ניתק קוצץ</td></tr><tr><td>קולימציה עדשת מעבה</td><td>ThorLabs</td><td>ACL2520-A</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>10011913</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>דבק ציאנואקרילט</td><td>Rapid Electronics Ltd</td><td>84-4557</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר לרכישת נתונים</td><td>National Instruments</td><td>USB-6341 BNC</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>מראה דיכרואית 500 ננומטר ארוך</td> מעבר <td>אדמונד אופטיקה</td><td>69899</td><td></td></tr><tr><td>מראה דיכרואית 600 ננומטר מעבר ארוך</td><td>Edmund Optics</td><td>69901</td><td></td></tr><tr><td>קוביית מראה דיכרואית</td><td>ThorLabs</td><td>CM1-DCH/M</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Millpore</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק אלקטרודות עם יציאת צד</td><td>HEKA</td><td>895150</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פליטה</td><td>Chroma</td><td>59022m</td><td></td></tr><tr><td>מסנן עירור</td><td>Chroma</td><td>ET570/20x</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל עיניים</td><td>Dechra</td><td>Lubrithal</td><td></td></tr><tr><td>מברשת צבע עדין</td><td>מעבדה מדעית מספקת</td><td>BRU2052</td><td></td></tr><tr>מכשירים <td>מדויקים בעולם</td><td>גיליוטינה</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מי חמצן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>30% (w/w)</td></tr> <tr><td>איזופלורן</td><td>הנרי שיין</td><td>988-3245</td><td></td></tr><tr><td>איזופנטן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>k-גלוקונאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>קוביית מסנן פלואורסצנטי קינמטי</td><td>ThorLabs</td><td>DFM1T1</td><td></td></tr><tr><td>דרייבר LED</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>משחת לידוקאין</td><td>טבע</td><td>80007150</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה מיקרו</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>75-1887</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרואלקטרודות</td><td>מכשירי סאטר</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>מזרק מיקרו-הזרקה</td><td>המילטון</td><td>7634-01/00</td><td></td></tr><tr><td>מחט מזרק מיקרו-הזרקה</td><td>המילטון</td><td>7803-05</td><td>מפרט מותאם אישית: מד 33, אורך 15 מ"מ, סגנון נקודה 4 - 12& מעלות;</td></tr><tr><td>משאבת מזרק מיקרו-הזרקה</td><td>מכשירים מדויקים בעולם</td><td>UMP3T-1</td><td></td></tr><tr><td>רכוב כחול LED</td><td>ThorLabs</td><td>M470L5</td><td></td></tr><tr><td>רכוב ירוק LED</td><td>ThorLabs</td><td>M565L3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NIR LED</td><td>OSRAM</td><td></td> <td>SFH4550משמש להדמיית IR שבורה של אופטיקה של פרוסה, ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות (DIC) היא שיטה נפוצה נוספת</td></tr><tr><td>מדיום OCT VWR</td><td>International</td><td>RAYLLAMB/OCT</td><td>מדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלית</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>מגבר מהדק תיקון</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>700A</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>World Precision Instruments</td><td>Ministar</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ מצופות פולי-L-ליזין</td><td>פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>23-769-310</td><td></td></tr><tr><td>תא הקלטה</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>להב אזמל</td><td>סוואן מורטון</td> <td>#24</td><td></td></tr><tr><td>עוגן פרוסה</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>SHD-26-GH/15</td><td></td></tr><tr><td>מסגרת סטריאוטקסית</td><td>קופף</td><td>דגם 902</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק סטריאוטקסי למקדחה מיקרו</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>75-1874</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ כירורגי</td><td>קארל זייס</td><td>OPMI 1 FR pro</td><td></td></tr><tr><td>תפר</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק להקלטה תוך תאית פתרון</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>171-0020</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxin citrate</td><td>Hello Bio</td><td>HB1035</td><td></td></tr><tr><td>העברת פיפטות</td><td>פישר סיינטיפיק בע"מ</td><td>10458842</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף</td><td>Leica</td><td>DM6 B</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade הרכבה בינונית עם DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>ערכת VECTASTAIN ABC-HRP מעבדות</td><td>וקטור</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Instruments</td><td>7000smz-2</td><td></td></tr><tr><td>WinLTP</td><td>https://www.winltp.com/</td> <td>גרסה 2.32</td><td>תוכנת רכישת נתונים</td></tr> <tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td><td></td>חיתוך סוכרוז</tr><tr><td>PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוך-תאית?</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

חקר התכונות הפיזיולוגיות של סינפסות מסוימות במוח, וכיצד הן עוברות שינויים פלסטיים, הוא אתגר מרכזי במדעי המוח המודרניים. טכניקות אלקטרופיזיולוגיות מסורתיות במבחנה משתמשות בגירוי חשמלי כדי לעורר תמסורת סינפטית. החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא האופי הלא ספציפי שלה; כל האקסונים באזור האלקטרודה המגרה יופעלו, מה שמקשה על ייחוס אפקט לחיבור אפרנטי מסוים. ניתן להתגבר על בעיה זו על ידי החלפת גירוי חשמלי בגירוי מבוסס אופטוגנטיקה. אנו מתארים שיטה לשילוב אופטוגנטיקה עם הקלטות מהדקי טלאים במבחנה . זהו כלי רב עוצמה לחקר ההעברה הסינפטית הבסיסית והפלסטיות הסינפטית של קשרים סינפטיים מדויקים המוגדרים אנטומית, והוא ישים כמעט לכל מסלול במוח. כאן אנו מתארים את ההכנה והטיפול בווקטור נגיפי המקודד חלבון channelrhodopsin להזרקה כירורגית לאזור טרום-סינפטי בעל עניין (קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית) במוח המכרסם ויצירת פרוסות חריפות של אזורי מטרה במורד הזרם (קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית). כמו כן מוצג הליך מפורט לשילוב הקלטות מהדקי טלאים עם הפעלה סינפטית על ידי גירוי אור כדי לחקור פלסטיות סינפטית לטווח קצר וארוך. אנו דנים בדוגמאות לניסויים שמשיגים ספציפיות של מסלולים ותאים על ידי שילוב של אופטוגנטיקה ותיוג תאים תלויי Cre. לבסוף, אישור היסטולוגי של האזור הקדם-סינפטי של העניין מתואר יחד עם תיוג ביוציטין של התא הפוסט-סינפטי, כדי לאפשר זיהוי נוסף של המיקום המדויק וסוג התא.

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד לחקור פיזיולוגיה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות באמצעות העברה נגיפית של מבנים אופטוגנטיים. ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות רבה לחקר כמעט כל קשר ארוך טווח במוח. לדוגמה, אנו מתארים את ההזרקה של AAVs המקודדים אופסין לתוך mPFC של חולדה, הכנת פרוסות חריפות מ-LEC, הקלטות של מהדקי טלאים מנוירונים פירמידליים של LEC בשכבה 5, והפעלה מעוררת אור של מסופי mPFC ב-LEC (איור 1).
תא פירמידלי בריא אותר ותוקנה (לדוגמה, איור 3A)....

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

מבנים אופטוגנטיים המועברים באופן ויראלי מאפשרים אפיון אלקטרופיזיולוגי מפורט של הפיזיולוגיה והפלסטיות של סינפסות ספציפיות בפרוסות מוח חריפות. היתרונות העיקריים של הפעלת סינפסות באופן אופטיגנטי הם היכולת לחקור מסלולים ארוכי טווח, והגירוי הסלקטיבי של אקסונים שאינם מופרדים אנטומית. מי שתדגים את ההליך תהיה ד"ר ליסה קינאוונה, עמיתת מחקר מהמעבדה שלנו.כדי להתחיל, טען מזרק המילטון לתוך משאבת מזרק מיקרו-הזרקה המחוברת לזרוע ניידת המורכבת על מסגרת סטריאוטקסית. לאחר מכן מניחים אליקוט של חמישה מיקרוליטרים של הנגיף במיקרוצנטריפוגה. סובבו את הצינור למשך מספר שניות והכניסו שני מיקרוליטרים של ההכנה הנגיפית לתוך מכסה הצינור.כדי למלא את המזרק בהכנה הנגיפית, צפו בקצה המחט במיקרוסקופ כירורגי. לאחר מכן מניחים ידנית את הבולוס של הנגיף בקצה המחט, ומושכים את בוכנה המזרק באמצעות פקדי המשאבה. הגדר את נפח הזרקת המשאבה ל-300 ננוליטר ואת קצב הזרימה ל-100 ננוליטר לדקה.הפעל את המשאבה ואשר זרימה תקינה על ידי התבוננות בטיפת הנגיף בקצה המחט. סופגים את הנגיף על צמר גפן, ומנקים את המחט עם 70% אתנול. לאחר מכן, באמצעות ברגי הכוונון על המסגרת הסטריאוטקסית, נווט את קצה המחט אל הברגמה, ושים לב למדידות הסטריאוטקסיות שנצפו בשלושת סולמות ורנייה במסגרת.להוסיף, או להחסיר מרחקים אלה מקואורדינטות bregma. צור חור בור במשטח הגולגולת באמצעות מקדחה זעירה המורכבת על הזרוע הסטריאוטקסית. מחדירים את המחט למוח בקואורדינטות הגבי שנקבעו מראש, ומחדירים נפח קבוע מראש של ההכנה הנגיפית.לאחר עירוי, השאירו את המחט באתרה למשך 10 דקות כדי לאפשר את פיזור הבולוס. לאחר מכן הסר את המחט, והפעל את המשאבה כדי להבטיח שהמחט אינה חסומה. שבועיים לאחר ההזרקה הנגיפית, מרדימים את החולדה, מנתחים במהירות את כל המוח ומעבירים אותו לתמיסת חיתוך סוכרוז.בעזרת כפית מתכת, הרימו את המוח, השליכו את התמיסה העודפת והניחו אותה על נייר סינון. באמצעות אזמל, להסיר את המוח הקטן, ולחתוך את המוח במישור קורונל בערך באמצע הדרך לאורכו. החצי האחורי הוא גוש הרקמה LEC.החזירו את גוש הרקמה ואת המוח הנותר לתמיסת חיתוך סוכרוז. לאחר מכן, הניחו טיפה של דבק ציאנואקרילט על שלב הוויברטום, ופזרו אותו לשכבה דקה. לאחר מכן באמצעות כפית, בחר את בלוק הרקמה של LEC, והעבר אותו על מדבקת הדבק, כך שהחתך הקורונלי הקדמי נדבק.התקן את הבמה לתוך תא רקמת ויברטום, ושפכו במהירות תמיסת חיתוך סוכרוז מספקת כדי להטביע את הרקמה. לאחר כיוון פני השטח הגחוניים של גוש הרקמה לכיוון הלהב, חותכים פרוסות בעובי 350 מיקרומטר מגחון לגב באמצעות מהירות התקדמות להב איטית. בדרך כלל, ניתן להשיג שבע פרוסות לכל חצי כדור.מעבירים את הפרוסות לתא איסוף הפרוסות. לאחר מכן הניחו את תא האיסוף באמבט מים של 34 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני שתחזרו לטמפרטורת החדר. מניחים את שארית המוח בפרפורמלדהיד למשך 48 שעות.לזיהוי תאי יעד, מקמו את הפרוסה בתא ההקלטה, ושתקו אותה באמצעות עוגן פרוסה. תחת הגדלה נמוכה, באמצעות תאורת אינפרא אדום, נווט לשכבת LEC חמש. לאחר מכן עברו למטרת טבילת המים בהגדלה גבוהה, וזהו את הנוירונים הפירמידליים.סמן את המיקום של התא על הצג עם קלטת. לאחר מכן, כדי ליצור מהדק טלאי תא שלם, לייצר מיקרו-פיפטה זכוכית בורוסיליקט, ולמלא אותו עם פתרון הקלטה תוך תאית. הניחו את המיקרו-פיפטה המלאה במחזיק האלקטרודה והפעילו לחץ חיובי על ידי נשיפה חזקה לתוך פיה המחוברת ליציאה הצדדית של מחזיק האלקטרודה.הרימו את מטרת המיקרוסקופ כך שייווצר מניסקוס והכניסו את האלקטרודה לתוך המניסקוס עד שניתן יהיה לראותה במיקרוסקופ. פתח את החלון בדיקת חותם וקבע אם עמידות הפיפטה היא שלושה עד חמישה מגה-אוהם. לאחר מכן גע בתא המזוהה עם קצה פיפטה, וכתוצאה מכך כניסה בקרום התא.לאחר מכן, להחיל לחץ שלילי על ידי יניקה על השופר, הגדלת התנגדות פיפטה. המשיכו להפעיל לחץ שלילי בהדרגה עד שקרום התא נקרע, וכתוצאה מכך קיבול התא כולו חולף. כדי להיכנס לתצורת המהדק הנוכחית, השתמש בנורית LED מותקנת המכוונת לנתיב האור של המיקרוסקופ עם קוביות סינון ואופטיקה מתאימה, והחל פולסים של אור על הפרוסה דרך המטרה 40X.ספק רכבות של פולסים קלים מרובים ב-5 הרץ, 10 הרץ ו-20 הרץ כדי לחקור את תכונות השחרור הקדם-סינפטי. כדי לאפשר לביוציטין למלא את הנוירון, יש להמתין לפחות 15 דקות לאחר הכניסה לתצורת התא כולו. במהדק מתח, עקוב אחר קיבוליות הממברנה והתנגדות הכניסה.לאחר מכן משכו באיטיות את הפיפטה לאורך זווית הגישה הרחק מסומה של התא, תוך התבוננות בהיעלמות האיטית של טרנזיינטים קיבוליים וזרם ממברנה, מה שמעיד על איטום מחדש של קרום התא והיווצרות של טלאי חיצוני בקצה הפיפטה. מניחים את הפרוסה בפרפורמלדהיד בצלחת של 24 בארות ודוגרים למשך הלילה. באמצעות מדיום OCT, הצמידו גוש רקמה לדיסק הדגימה של קריוסטאט.כדי להקפיא את הרקמה, מניחים איזופנטן במיכל מתאים ומטביעים את דיסק הדגימה, כדי להבטיח שהרקמה תהיה מעל רמת האיזופנטאן. לאחר מכן להוריד את המיכל של isopentane לתוך חנקן נוזלי, ולאפשר לרקמה להקפיא. לאחר שהרקמה קפואה לחלוטין, השאירו את בלוק הרקמה בתא הקריוסטאט במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר לטמפרטורת הבלוק להתאזן.לאחר שיווי משקל, חותכים חתכים חתכים בעובי 40 מיקרומטר בקריוסטט, ומשתמשים במכחול עדין כדי להנחות את החלקים מהלהב. הדבק את החלקים הקפואים האלה לשקופית מיקרוסקופ זכוכית מצופה פולי-L-ליזין בטמפרטורת החדר על ידי נגיעה בשקופית לחלקים. לאחר הוספת 150 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה לכל שקופית, יש למרוח את הכיסוי ולהסיר את בועות האוויר על ידי לחיצה עדינה על החלקת הכיסוי.כסו את השקופיות כדי להגן מפני הלבנת תמונות, ותנו להן להתייבש באוויר במשך 12 שעות. לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לבחון את המיקום של אתר ההזרקה הנגיפית. לצביעת ביוציטין, דגרו את הפרוסות ב-3% מי חמצן ב-PBS למשך 30 דקות כדי לחסום כל פעילות אנדוגנית של פרוקסידאז.לאחר מכן שטפו את פרוסות המוח עם PBS עד שלא נראות בועות חמצן נוספות. לאחר מכן, דגרו את הפרוסות במשך שלוש שעות בתמיסת קומפלקס HRP 1%avidin-biotinylated ב-PBS המכילה 0.1% Triton X-100. לאחר שש שטיפות PBS, דגרו כל פרוסה בתמיסת DAB עד שהכתם הביוציטין של מבנים עצביים הופך גלוי.עצור את התגובה על ידי העברת הפרוסות ב- PBS קר. לאחר מכן הרכיבו את הפרוסות על מגלשות מיקרוסקופ הזכוכית באמצעות מברשת. לאחר הסרת PBS עודף, הוסף מדיום הרכבה.מכסים את הפרוסות באמצעות תלושי כיסוי, ומניחים להן להתייבש באוויר, כפי שהודגם קודם לכן. תא פירמידלי בריא אותר ותוקן. אם נדרש זיהוי תאים פוסט-סינפטיים, יש למקם תא המבטא את הסמן הפלואורסצנטי באמצעות אופטיקה של שדה רחב.פולסים של אור יחיד של שתי אלפיות השנייה גרמו לפוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים פשוטים בצורת גל. פלסטיות לטווח קצר של הסינפסה נבחנת על ידי הפעלת 5, 10 ו -20 הרץ רכבות של גירוי קל. תוך כדי חקירת פלסטיות ארוכת טווח, הוספת קרבכול אגוניסט כולינרגי ל-aCSF במחזור במשך 10 דקות גרמה לדיכאון ארוך טווח שעדיין ניכר 40 דקות לאחר הסרת הליגנד.אורך אתר ההזרקה נבדק באופן היסטולוגי. הכתב הפלואורסצנטי mCherry היה מקומי לשכבות העמוקות יותר של קליפת המוח הפרה-לימבית והאינפרה-לימבית. יתר על כן, צביעת תא מלא בביוציטין אישרה את מיקומו ואת המורפולוגיה שלו.השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם התמרה מדויקת של אזור המוח afferent, אשר ניתן לאמת לאחר הוק, ודיסקציה מהירה של המוח בעת הכנת פרוסות חריפות. הליך זה משולב בקלות עם תיוג פלואורסצנטי של סוג תא בודד, כגון תת-מחלקה מסוימת של interneuron. כדי לעשות זאת, נשתמש בחיה מהונדסת שמבטאת רקומבינאז בסוג התא המסוים הזה.מבנים אופטוגנטיים המועברים באופן ויראלי אפשרו התקדמות מהירה בתחומי המערכות ומדעי המוח המעגליים.

ex-vivo-optogenetic-interrogation-long-range-synaptic-transmission

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים את ההליך לחקר יעילות סינפטית בקליפת המוח האנטורינלית הצידית (LEC) על-ידי גירוי אופטוגנטי של אקסונים של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (mPFC) ורישום התגובות של נוירונים פירמידליים ב-LEC. שיטה זו משלבת הקלטות מהדק טלאי עם הפעלה סינפטית על ידי גירוי אור כדי לחקור פלסטיות סינפטית.

גירוי אופטוגנטי ורישום אלקטרופיזיולוגי של אירועים סינפטיים בפרוסות מוח של חולדות

שינויים מולקולריים חוויה תלויה בתאי עצב חיוניים ליכולתו של המוח להסתגל בתגובה לאתגרים התנהגותיים.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

אנו מתארים שיטה לאפיון הטופוגרפיה התפקודית והתכונות הסינפטיות של מעגלי המוח הקדמי באמצעות גישה אופטוגנטית לגירוי אוכלוסיות עצביות במבחנה.

Photostimulation לייזר לסריקת של מעגלים מוח קדמי ממוקדים Optogenetically

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר באמצעות מיקרוסקופ פוטונים שני פוטונים in vivo בקו טרנסגני Thy1-GFP. גישה זו משולבת עם הזרקת נגיף הקשור לאדנו המבטא mCherry לתוך ההיפוקמפוס הגבי. טכניקות אלו מאפשרות ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

גישות optogenetic נמצאים בשימוש נרחב כדי לתפעל פעילות עצבית ולהעריך את ההשלכות על תפקוד המוח. הנה, טכניקה מתוארת שעם ביטוי in vivo של המפעיל האופטי Channelrhodopsin, המאפשר ניתוח vivo לשעבר של נכסים הסינפטי של ארוכי טווח ספציפי קשרים עצביים מקומיים מעגלים הקשורות פחד.

Ex Vivo optogenetic Dissection של מעגלי פחד פרוסות המוח

פרוטוקול זה מתאר ערכה של שיטות לזיהוי הקישוריות הפונקציונלית הספציפית של כניסות לטווח ארוך מאזורי מוח רחוקים באמצעות הגירוי בתוך המוח בפרוסות מvivo לשעבר.

בזריקות Vivo גרם סטריאוטקאית לגירוי מגנטי של תשומות לטווח ארוך בפרוסות המוח של העכבר

שיטה זו מתארת הכנה כרונית המאפשרת גישה אופטית להיפוקמפוס של עכברים חיים. הכנה זו יכולה לשמש לביצוע הדמיה אופטית לאורך של הפלסטיות הקונסטרוקטיבית העצבית ופעילות-מעורר פלסטיות הסלולר במשך תקופה של מספר שבועות.

אורך שני-פוטון הדמיה של CA1 היפוקמאל בעכברים חיים

הפרוטוקול הנוכחי מדגים שיטה פשוטה להתחקות אחר תחזיות גלוטמט אזור טגמנטלי גחוני (VTA) להיפוקמפוס. פוטוטימולציה של נוירונים גלוטמט VTA שולב עם הקלטת CA1 כדי להדגים כיצד מסופי גלוטמט VTA לווסת CA1 קצב ירי פירמידלי putative ב vivo.

מעקב אנטומי ותפקודי משולב של מסופי גלוטמט באזור הגונטם הגחמני בהיפוקמפוס

פיתחנו גישה פשוטה וחסכונית לייצור אלקטרודות וערכנו הקלטות של אותות באזורים מרובים בעכברים הנעים בחופשיות. שימוש באופטוגנטיקה, לצד אלקטרופיזיולוגיה רב-אזורית ורישום אותות סידן, איפשר גילוי של פעילויות עצביות באזורים שונים במודל הצתת ההתקפים.

שיטה משולבת ליצירת אופטרודים אלקטרופיזיולוגיים גמישים ונוחים להקלטה רב-אזורית in vivo

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים לרישום מיקרו-אלקטרוקורטיקוגרפיה בצפיפות גבוהה (μEcoG) בחולדות ועכברים, כולל שיטות כירורגיות, השתלה והקלטה. הקלטות μECoG מבוצעות בשילוב עם הקלטת פוליטרודה למינרית בקליפת המוח השמיעתית של החולדה או עם מניפולציה אופטוגנטית של פעילות עצבית בקליפת המוח הסומטוסנסורית של העכבר.

חקירות רב-ממדיות של עיבוד קליפת המוח על ידי שילוב פוליטרודים למינאריים ואופטוגנטיקה עם מיקרו אלקטרוקורטיקוגרפיה במכרסמים

פרוטוקול זה מתאר שיטה כירורגית דו-שלבית ליצירת חלון גולגולתי גדול, ניתן לסגירה מחדש, ששומר על הדורה בעכברים. טכניקה זו מאפשרת הקלטות אלקטרופיזיולוגיות כרוניות ורב-מודליות מרשתות מוח עמוקות מפוזרות, כגון רשת מצב ברירת המחדל, במשך מספר שבועות.

פרוטוקול ניתוחי לחלון גולגולתי גדול וניתן לסגירה מחדש המאפשר הקלטות אלקטרופיזיולוגיות לאורך זמן ורב-מודליות של רשת מצב ברירת מחדל של העכבר

חקור תכונות אלקטרופיזיולוגיות של סינפסות ספציפיות באמצעות שיטות אופטוגנטיות בפרוסות מוח אקוטיות ממכרסמים. פרוטוקול זה מאפשר חקירת מסלולים מרחביים ופלסטיות סינפטית.

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית (וידאו) | JoVE Journal

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

גלה סרטונים נוספים