אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית
25 בפברואר 2022
כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.
מבנים אופטוגנטיים המועברים באופן ויראלי מאפשרים אפיון אלקטרופיזיולוגי מפורט של הפיזיולוגיה והפלסטיות של סינפסות ספציפיות בפרוסות מוח חריפות. היתרונות העיקריים של הפעלת סינפסות באופן אופטיגנטי הם היכולת לחקור מסלולים ארוכי טווח, והגירוי הסלקטיבי של אקסונים שאינם מופרדים אנטומית. מי שתדגים את ההליך תהיה ד"ר ליסה קינאוונה, עמיתת מחקר מהמעבדה שלנו.
כדי להתחיל, טען מזרק המילטון לתוך משאבת מזרק מיקרו-הזרקה המחוברת לזרוע ניידת המורכבת על מסגרת סטריאוטקסית. לאחר מכן מניחים אליקוט של חמישה מיקרוליטרים של הנגיף במיקרוצנטריפוגה. סובבו את הצינור למשך מספר שניות והכניסו שני מיקרוליטרים של ההכנה הנגיפית לתוך מכסה הצינור.
כדי למלא את המזרק בהכנה הנגיפית, צפו בקצה המחט במיקרוסקופ כירורגי. לאחר מכן מניחים ידנית את הבולוס של הנגיף בקצה המחט, ומושכים את בוכנה המזרק באמצעות פקדי המשאבה. הגדר את נפח הזרקת המשאבה ל-300 ננוליטר ואת קצב הזרימה ל-100 ננוליטר לדקה.
הפעל את המשאבה ואשר זרימה תקינה על ידי התבוננות בטיפת הנגיף בקצה המחט. סופגים את הנגיף על צמר גפן, ומנקים את המחט עם 70% אתנול. לאחר מכן, באמצעות ברגי הכוונון על המסגרת הסטריאוטקסית, נווט את קצה המחט אל הברגמה, ושים לב למדידות הסטריאוטקסיות שנצפו בשלושת סולמות ורנייה במסגרת.
להוסיף, או להחסיר מרחקים אלה מקואורדינטות bregma. צור חור בור במשטח הגולגולת באמצעות מקדחה זעירה המורכבת על הזרוע הסטריאוטקסית. מחדירים את המחט למוח בקואורדינטות הגבי שנקבעו מראש, ומחדירים נפח קבוע מראש של ההכנה הנגיפית.
לאחר עירוי, השאירו את המחט באתרה למשך 10 דקות כדי לאפשר את פיזור הבולוס. לאחר מכן הסר את המחט, והפעל את המשאבה כדי להבטיח שהמחט אינה חסומה. שבועיים לאחר ההזרקה הנגיפית, מרדימים את החולדה, מנתחים במהירות את כל המוח ומעבירים אותו לתמיסת חיתוך סוכרוז.
בעזרת כפית מתכת, הרימו את המוח, השליכו את התמיסה העודפת והניחו אותה על נייר סינון. באמצעות אזמל, להסיר את המוח הקטן, ולחתוך את המוח במישור קורונל בערך באמצע הדרך לאורכו. החצי האחורי הוא גוש הרקמה LEC.
החזירו את גוש הרקמה ואת המוח הנותר לתמיסת חיתוך סוכרוז. לאחר מכן, הניחו טיפה של דבק ציאנואקרילט על שלב הוויברטום, ופזרו אותו לשכבה דקה. לאחר מכן באמצעות כפית, בחר את בלוק הרקמה של LEC, והעבר אותו על מדבקת הדבק, כך שהחתך הקורונלי הקדמי נדבק.
התקן את הבמה לתוך תא רקמת ויברטום, ושפכו במהירות תמיסת חיתוך סוכרוז מספקת כדי להטביע את הרקמה. לאחר כיוון פני השטח הגחוניים של גוש הרקמה לכיוון הלהב, חותכים פרוסות בעובי 350 מיקרומטר מגחון לגב באמצעות מהירות התקדמות להב איטית. בדרך כלל, ניתן להשיג שבע פרוסות לכל חצי כדור.
מעבירים את הפרוסות לתא איסוף הפרוסות. לאחר מכן הניחו את תא האיסוף באמבט מים של 34 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני שתחזרו לטמפרטורת החדר. מניחים את שארית המוח בפרפורמלדהיד למשך 48 שעות.
לזיהוי תאי יעד, מקמו את הפרוסה בתא ההקלטה, ושתקו אותה באמצעות עוגן פרוסה. תחת הגדלה נמוכה, באמצעות תאורת אינפרא אדום, נווט לשכבת LEC חמש. לאחר מכן עברו למטרת טבילת המים בהגדלה גבוהה, וזהו את הנוירונים הפירמידליים.
סמן את המיקום של התא על הצג עם קלטת. לאחר מכן, כדי ליצור מהדק טלאי תא שלם, לייצר מיקרו-פיפטה זכוכית בורוסיליקט, ולמלא אותו עם פתרון הקלטה תוך תאית. הניחו את המיקרו-פיפטה המלאה במחזיק האלקטרודה והפעילו לחץ חיובי על ידי נשיפה חזקה לתוך פיה המחוברת ליציאה הצדדית של מחזיק האלקטרודה.
הרימו את מטרת המיקרוסקופ כך שייווצר מניסקוס והכניסו את האלקטרודה לתוך המניסקוס עד שניתן יהיה לראותה במיקרוסקופ. פתח את החלון בדיקת חותם וקבע אם עמידות הפיפטה היא שלושה עד חמישה מגה-אוהם. לאחר מכן גע בתא המזוהה עם קצה פיפטה, וכתוצאה מכך כניסה בקרום התא.
לאחר מכן, להחיל לחץ שלילי על ידי יניקה על השופר, הגדלת התנגדות פיפטה. המשיכו להפעיל לחץ שלילי בהדרגה עד שקרום התא נקרע, וכתוצאה מכך קיבול התא כולו חולף. כדי להיכנס לתצורת המהדק הנוכחית, השתמש בנורית LED מותקנת המכוונת לנתיב האור של המיקרוסקופ עם קוביות סינון ואופטיקה מתאימה, והחל פולסים של אור על הפרוסה דרך המטרה 40X.
ספק רכבות של פולסים קלים מרובים ב-5 הרץ, 10 הרץ ו-20 הרץ כדי לחקור את תכונות השחרור הקדם-סינפטי. כדי לאפשר לביוציטין למלא את הנוירון, יש להמתין לפחות 15 דקות לאחר הכניסה לתצורת התא כולו. במהדק מתח, עקוב אחר קיבוליות הממברנה והתנגדות הכניסה.
לאחר מכן משכו באיטיות את הפיפטה לאורך זווית הגישה הרחק מסומה של התא, תוך התבוננות בהיעלמות האיטית של טרנזיינטים קיבוליים וזרם ממברנה, מה שמעיד על איטום מחדש של קרום התא והיווצרות של טלאי חיצוני בקצה הפיפטה. מניחים את הפרוסה בפרפורמלדהיד בצלחת של 24 בארות ודוגרים למשך הלילה. באמצעות מדיום OCT, הצמידו גוש רקמה לדיסק הדגימה של קריוסטאט.
כדי להקפיא את הרקמה, מניחים איזופנטן במיכל מתאים ומטביעים את דיסק הדגימה, כדי להבטיח שהרקמה תהיה מעל רמת האיזופנטאן. לאחר מכן להוריד את המיכל של isopentane לתוך חנקן נוזלי, ולאפשר לרקמה להקפיא. לאחר שהרקמה קפואה לחלוטין, השאירו את בלוק הרקמה בתא הקריוסטאט במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר לטמפרטורת הבלוק להתאזן.
לאחר שיווי משקל, חותכים חתכים חתכים בעובי 40 מיקרומטר בקריוסטט, ומשתמשים במכחול עדין כדי להנחות את החלקים מהלהב. הדבק את החלקים הקפואים האלה לשקופית מיקרוסקופ זכוכית מצופה פולי-L-ליזין בטמפרטורת החדר על ידי נגיעה בשקופית לחלקים. לאחר הוספת 150 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה לכל שקופית, יש למרוח את הכיסוי ולהסיר את בועות האוויר על ידי לחיצה עדינה על החלקת הכיסוי.
כסו את השקופיות כדי להגן מפני הלבנת תמונות, ותנו להן להתייבש באוויר במשך 12 שעות. לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לבחון את המיקום של אתר ההזרקה הנגיפית. לצביעת ביוציטין, דגרו את הפרוסות ב-3% מי חמצן ב-PBS למשך 30 דקות כדי לחסום כל פעילות אנדוגנית של פרוקסידאז.
לאחר מכן שטפו את פרוסות המוח עם PBS עד שלא נראות בועות חמצן נוספות. לאחר מכן, דגרו את הפרוסות במשך שלוש שעות בתמיסת קומפלקס HRP 1%avidin-biotinylated ב-PBS המכילה 0.1% Triton X-100. לאחר שש שטיפות PBS, דגרו כל פרוסה בתמיסת DAB עד שהכתם הביוציטין של מבנים עצביים הופך גלוי.
עצור את התגובה על ידי העברת הפרוסות ב- PBS קר. לאחר מכן הרכיבו את הפרוסות על מגלשות מיקרוסקופ הזכוכית באמצעות מברשת. לאחר הסרת PBS עודף, הוסף מדיום הרכבה.
מכסים את הפרוסות באמצעות תלושי כיסוי, ומניחים להן להתייבש באוויר, כפי שהודגם קודם לכן. תא פירמידלי בריא אותר ותוקן. אם נדרש זיהוי תאים פוסט-סינפטיים, יש למקם תא המבטא את הסמן הפלואורסצנטי באמצעות אופטיקה של שדה רחב.
פולסים של אור יחיד של שתי אלפיות השנייה גרמו לפוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים פשוטים בצורת גל. פלסטיות לטווח קצר של הסינפסה נבחנת על ידי הפעלת 5, 10 ו -20 הרץ רכבות של גירוי קל. תוך כדי חקירת פלסטיות ארוכת טווח, הוספת קרבכול אגוניסט כולינרגי ל-aCSF במחזור במשך 10 דקות גרמה לדיכאון ארוך טווח שעדיין ניכר 40 דקות לאחר הסרת הליגנד.
אורך אתר ההזרקה נבדק באופן היסטולוגי. הכתב הפלואורסצנטי mCherry היה מקומי לשכבות העמוקות יותר של קליפת המוח הפרה-לימבית והאינפרה-לימבית. יתר על כן, צביעת תא מלא בביוציטין אישרה את מיקומו ואת המורפולוגיה שלו.
השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם התמרה מדויקת של אזור המוח afferent, אשר ניתן לאמת לאחר הוק, ודיסקציה מהירה של המוח בעת הכנת פרוסות חריפות. הליך זה משולב בקלות עם תיוג פלואורסצנטי של סוג תא בודד, כגון תת-מחלקה מסוימת של interneuron. כדי לעשות זאת, נשתמש בחיה מהונדסת שמבטאת רקומבינאז בסוג התא המסוים הזה.
מבנים אופטוגנטיים המועברים באופן ויראלי אפשרו התקדמות מהירה בתחומי המערכות ומדעי המוח המעגליים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול מפורט לטרנסדוקציה ויראלית של אזורי מוח ספציפיים באמצעות קונסטרוקטים אופטוגנטיים, המאפשרים אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסות בחתכים אקוטיים של מוח מכרסמים. השיטה מקלה על חקירת מסלולים ארוכים ומגרה באופן סלקטיבי אקסונים שאינם מופרדים אנטומית, ובכך מעמיקה את הבנתנו לגבי פיזיולוגיה ופלסטיות סינפטית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- אופטוגנטיקה
רקע
- העברה ויראלית של מבנים אופטוגנטיים מאפשרת שליטה מדויקת בפעילות נוירונלית.
- שיטה זו מאפשרת גירוי סלקטיבי של קשרים סינפטיים ספציפיים.
- ניצול של אופטוגנטיקה משפר את חקר הפיזיולוגיה הסינפטית בפרוסות מוח טריות.
- נדונות פרוצדורות מפורטות לחיתוך מוח ולביצוע patch clamping לנוירונים.
מטרת המחקר
- ביסוס פרוטוקול לבחינת התכונות האלקטרופיזיולוגיות של סינפסות ספציפיות.
- הדגמת היתרונות של שימוש בכלים אופטוגנטיים במחקר נוירונלי.
- מתן מתודולוגיה ברורה להכנת פרוסות מוח אקוטיות ולביצוע הקלטות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- המחקר משתמש בחתכי מוח אקוטיים ממכרסמים כפלטפורמה העיקרית.
- קונסטרוקטים אופטוגנטיים מועברים באופן ויראלי לאזורי מוח ספציפיים להפעלה ממוקדת של סינפסות.
- שלבי הפרוצדורה המרכזיים כוללים הזרקה ויראלית, חיתוך המוח וביצוע whole cell patch clamping של נוירונים.
- לוחות הזמנים כוללים תקופה של שבועיים לביטוי ויראלי לפני הכנת החתכים.
- הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מבוצעות כדי להעריך תכונות סינפטיות לאחר הארה.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת גירוי סלקטיבי של סינפסות, דבר המקל על ניתוח מפורט של תכונות אלקטרופיזיולוגיות.
- ניתן למדוד באופן ישיר שינויים בעירור ובתגובות סינפטיות.
- הפרוטוקול קובע גישות יעילות לחקר מנגנונים סינפטיים ופלסטיות עצבית.
- מוצגות תובנות מרכזיות לגבי התפקוד של מסלולים סינפטיים ספציפיים.
מסקנות
- מחקר זה מספק מסגרת חסונה לחקירת התנהגות סינפטית באמצעות שיטות אופטוגנטיות.
- הגישה משפרת את ההבנה של מנגנונים נוירונליים והשלכותיהם על תפקוד מעגלים עצביים.
- יישומים עתידיים עשויים לקדם את הידע על פלסטיות סינפטית במודלים שונים של מצבים נוירולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
חקירה אופטוגנטית של מסלולים סינפטיים מוגדרים מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית מדויקת בשלב התיקוף המוקדם של מטרות במדעי המוח. באמצעות בידוד של קשרים ספציפיים ארוכי טווח, גישה זו מפחיתה עמימות ביולוגית במחקרי מודולציה של מסלולים. היא תומכת בביטחון ניבוי לגבי מעורבות המטרה והנחות טיפוליות מבוססות מעגלים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מסלולים בעלי רלוונטיות טיפולית, כגון השליחותים מקליפת הפרונטליים-פרפריאלית המדיאלית לקליפת האנטורינלית הלטרלית.
- ערך מדעי: מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד קלטים אפרנטיים ספציפיים לצורך תיקוף סיבתי של המטרה.
- ערך מדעי: תומך בביטחון ניבוי באמצעות מדידה ספציפית למסלול של תמסורה סינפטית ופלסטיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת פרוסות מוח מאושרות להערכה אלקטרופיזיולוגית הדירה של תפקוד סינפטי.
- ערך מדעי: מאפשר מדידה כמותית של תגובות פוסט-סינפטיות להפעלה פרה-סינפטית מבוקרת.
- ערך מדעי: תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות גירוי אופטוגנטי עם פרמטרים מוגדרים של פולסי אור.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על שלמות מעגלים רלוונטיים למחלה לצורך התאמה של ביומרקרים תרגומיים במודלים נוירו-פסיכיאטריים.
- ערך מדעי: מספק רצף מגילוי מנגנונים סינפטיים ועד לתיקוף פרה-קליני של מודולטורים של מעגלים.
- ערך מדעי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים על ידי אישור מעורבות המטרה במסלולים עצביים מוגדרים.
שילוב בצינור עיבוד ובזרימת עבודה
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של ביולוגיה גילויית על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת השערות לגבי קשרים סינפטיים ספציפיים ארוכי טווח לפני מאמצים לזיהוי מובילים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובחקירה סיבתית של מעגלים פרה-פרונטליים-אנטוריינליים המעורבים בהפרעות קוגניטיביות.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות הכנה סטנדרטית של פרוסות ופוטנציאליים פוסט-סינפטיים שמעוררו אופטוגנטית שניתן לכימות.
- אנליטיקה: מייצרת תוצרי קריאה אלקטרופיזיולוגיים, כולל פוטנציאליים פוסט-סינפטיים מעוררים ומדדי פלסטיות לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין בחינת מנגנונים סינפטיים לרציפות פרה-קלינית ברמת המעגל במודלים של תפקוד לקוי של קליפת המוח.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר לאפיון סינפטי ספציפי למסלולים ברחבי רשתות מוחיות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזויי בתיקוף של מטרה באמצעות חקירה סינפטית ספציפית לתאים ומסלולים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה והס reproducibility באמצעות טרגוטינג ויראלי, שימור פרוסות ופרוטוקולי גירוי מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: שיפור קבלת החלטות של go/no-go על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במחקרי מודולטורים של מעגלים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מטרות מותאם סיכון בהסתמך על מעורבות מאושרת במסלולים פוליסינפטיים מוגדרים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנוירו-וירולוגיה, ניתוח סטריאוטקסי ואלקטרופיזיולוגיה.
- תלוי במיקרוטומים, במערכות patch-clamp ובמערכות גירוי בלייזר/LED.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים עבור הטיטר הוויראלי, קואורדינטות ההזרקה ואיכות הפרוסות.
- כולל שיקולי התאמה בעת המעבר בין זני מכרסמים או אזורי מוח שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות בביטוי הוויראלי ושמירה על חיוניות הפרוסות במהלך ההקלטה.
