שני פוטונים סימולטני

כל ההליכים הניסיוניים המתוארים להלן אושרו על ידי הוועדה לאתיקה המקומית במכון ננסקי לביולוגיה ניסויית, האקדמיה הפולנית למדעים. סרטון זה מציג הליך קרניוטומיה המאפשר דימות כרוני של נוירונים בקורטקס רטרוספליני של עכבר באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo בשורת transgenic של one-G of feet. גישה זו משולבת עם הזרקה של נגיף אדנו-אסוציאטיבי, AAV, המבטא mCherry להיפוקמפוס הדורסלי.

שילוב של טכניקות אלו מאפשר ניטור ארוך טווח של תלות מפותחת ופלסטיות מבנית בקליפת המוח הרטרוספלינלית (retrosplenial cortex). במאמר זה, אנו מציעים את השתלת החלון הגולגולתי מעל הקליפת הרטרוספלינלית כאזור עניין אפשרי למיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo. כדי להמחיש את השינויים המורפולוגיים במבנים עצביים, אנו משתמשים בעכברי thy1-GFP, שבהם מבוטא חלבון GFP פלורסצנטי בכ-10 אחוזים מהנוירונים במוח.

חדשנות נוספת שאנו מציעים היא הזרקה של AAV, המבטא חלבון פלואורסצנטי mCherry תחת פרומוטור ספציפי לנוירונים, אל תוך מבנים עמוקים יותר במוח, כגון ההיפוקמפוס, במטרה לה可דמיזציה של השליחות מהמבנה אל קליפת המוח הרטרוספלינלית. סטריליזו את כל הכלים, כלי הזכוכית לנוזלים ומקלוני הצמר באוטוקלאב. השתמשו בכפפות חד-פעמיות.

נקה את שולחן הניתוח, את המסגרת הסטריאוטקטית ואת כל האזור שסביבם בעזרת 70% ethanol. השתמש בפד כירורגי סטרילי כדי ליצור מרחב סטרילי עבור כל הציוד שעבר עיקור. חתוך ספוג ג'ל לחתיכות קטנות והשרה אותן בתמיסת סליין סטרילית.

הכנס את בעל החיים לתא ההשראה וכוון את רמת האיסופלורן ל-5% ואת זרימת החמצן לשני ליטרים לדקה. הליך זה אמור להימשך כ-שלוש דקות. הוצא את בעל החיים מתא ההשראה.

השתמשו בצביטה בזנב או בבהונות כדי לוודא שהבעל חיים נמצא תחת הרדמה מלאה. בעזרת תכלימי גזירה מדויקים, גזרו את הפרווה מהחלק האחורי של הראש, בין האוזניים, עד לעיניים. מקמו את בעל החיים במסגרת הסטריאוטקטית וייצבו את הראש באמצעות מוטות אוזניים.

כוון את רמות ההרדמה ל-1.5 עד 2% isoflurane ושלושה עשיריים של ליטר חמצן לדקה. מרח את המשחה לעיניים. הזרק לבעל החיים תת-עורית (subcutaneously) tolfedine במינון 4 mg/kg, butomidor במינון 2 mg/kg ו-Baytril במינון 5 mg/kg כדי למנוע דלקת, כאב וזיהום בהתאמה.

הזריק לבעל החיים דקסמתזון, 0.2 מיליגרם לקילוגרם, לתוך השריר כדי למנוע בצקת מוחית. נקה את העור באמצעות מקלוני צמר sterile עם betadine ולאחר מכן עם 70% ethanol. החלף כפפות ורסס אותן עם 70% ethanol.

הרימו את העור באמצעות פינצטה ובעזרת מיקרו-מספריים בצעו חתך אופקי בעור לאורך בסיס הראש ולאחר מכן חתך אלכסוני לנקודה הקדמית שבין העיניים. הסירו את פני השטח של העור. מרחו משחה של lidocaine בעזרת מקלון סטרילי על הפריאוסטום (periosteum) כדי למנוע דימום מוגבר וכאב.

השתמשו במקלוני צמר גפן סטריליים או בסקאלפל כדי להסיר את הפריאוסטום (periosteum). ייבשו את הגולגולת באמצעות מקלוני צמר גפן סטריליים. בעזרת מחט סטרילית, מרחו דבק ציאנואקרילט (cyanoacrylate) סמיך על שולי העור כדי לקבע אותם ולמנוע מגע נוסף עם סמנט דנטלי.

המתינו לייבוש הדבק. הניחו זכוכית כיסוי סטרילית בעובי שלושה מילימטרים מעל הגולגולת, קדמית לתפר הלמדואידי (lambdoid suture). מרכזו את זכוכית הכיסוי בקואורדינטות הרטרוספלניאליות (retrosplenial), קדמי, אחורי ברגמה (bregma) מינוס 2.8, מדיאלי לטראלי ברגמה 0.

סמנו את קצוות זכוכית ה כיסייה על ידי שריטה של פני הגולגולת עם מחט סטרילית. החזירו את זכוכית הכיסייה למכל הסטרילי עם 70% ethanol. השתמשו במקדח שיניים במהירות גבוהה עם ראש קידוח בעל קוטר קטן כדי להקיף במעגל בעל קוטר של שלושה מילימטרים.

נקה את אתר הקידוח מאבקת עצם באמצעות מקלוני sworn סטריליים עם טיפות סלין. השתמש בספוג ג'ל ובמקלונים כדי לעצור דימומים מזדמנים ולנקה את העצם. בין פעולות הקידוח, בדוק את עובי העצם בעזרת פינצטה עדינה על ידי נגיעה עדינה במעגל העצם ובדיקת ניידותו.

יש לקחת בחשבון שהעצם עבה יותר באזור התפרים. יש להפסיק את הקידוח כאשר עיגול העצם נייד ונותרה רק שכבה דקה ואחידה של עצם בהיקף. נקה את שדה הפעולה מכל שאריות אבקת העצם באמצעות מקלוני צמר גפן ספוגים בסליין.

טפטפו תמיסת סליין סטרילית על אזור הקידוח, כך שתכסה את המעגל שקדוח. הרימו בזהירות את מעגל העצם בעזרת פינצטה עדינה, ולאחר מכן הסירו בעדינות אך בנחישות את העצם על ידי הרמה כלפי מעלה. היזהרו לא להטות את מעגל העצם בזמן ההרמה כדי למנוע נזק אפשרי לדורה.

הניחו בעדינות את ספוג הג'ל הספוג בתמיסת סלין סטרילית על הדורה כדי לסייע בעצירת הדימום. המתינו עד שהדימום ייעצר לחלוטין. הסירו בזהירות את ספוג הג'ל כדי לא להפריע לתהליך קרישת הדם.

שימו לב, אזור התפירה עשיר בכלי דם, לכן הדימום בנקודה זו עלול להיות עז. חיוני להמתין זמן מספיק עד להפסקת הדימום. חברו את משאבת ההזרקה למגדל הסטריאוטקטי וחברו את הבקר.

הכנס את המחט בכילוי (guage) 35 למזרק המילוי. שטוף את המזרק 10 פעמים עם אתנול כדי לעקרו, ו-10 פעמים עם תמיסת מלח סטרילית כדי להסיר שאריות אתנול. הסר בועות אוויר מהמזרק.

הכנס את המזרק אל המשאבה. מלא מנה בודדת של תכשיר AV ושמור אותה על קרח. מלא את המזרק בתמיסת נגיף.

מרכזו את המחט על הבריגמה ולאחר מכן הכניסו אותה בעדינות להיפוקמפוס באמצעות הקואורדינטות הבאות: Anterior, posterior -2, medial lateral ±1, dorsal ventral -1. קואורדינטות אלה ימוקמו קרוב לקצה התחום הגולגולתי. המתינו חמש דקות לייצוב הרקמה.

הזריק 0.7 µL מתמיסת AV בקצב של 50 nL לדקה. המתן 10 דקות לספיגה מלאה של הנגיף. הוצא את המחט בעדינות.

ספגו בעזרת ספוג ג'ל אם מופיע דימום. חזרו על הפעולה בצד הנגדי. הנחו את זכוכית הכיסוי הסטרילית והיבשה על החלק העליון של הקשיה (dura) בתוך מסגרת המעגל שנקדחה.

החזקו את זכוכית הכיסוי בעזרת פינצטה כדי לשטח בעדינות את הקשיה (dura) ולהביא את קצוות זכוכית הכיסוי קרוב יותר לפני השטח של הגולגולת. בעזרת מחט סטרילית, מרחו דבק ציאנואקרילט דחוס על קצוות זכוכית הכיסוי כדי להצמיד אותם לגולגולת. המתינו לייבוש הדבק.

מקמו מוט קיבוע, בורג אנטון (anton nut) או תכנון מותאם אישית בחלק הקדמי של הגולגולת. שימו לב, יש למקם את מוט הקיבוע במיקום שיאפשר מיקום אופקי של חלון הגולגולת במהלך סשן ההדמיה. מרחו את הדבק על קצותיו של המוט.

המתינו לייבוש הדבק. שימו לב, יש למקם את מוט הקיבוע רחוק ככל האפשר מהחלון. אם הוא ימוקם קרוב מדי לחלון, המוט והבורג המחבר אותו למחזיק המותאם אישית עלולים להוות מכשול עבור העדשה במהלך תהליך הדמיה.

הכינו את האקריליק הדנטלי ומרחו אותו על פני הגולגולת מסביב לזכוכית. מומלץ ליצור צורה דמוית מכתש מסביב לחלון; הדבר ייצור חלל עבור המים שיוסיפו מאוחר יותר לצורך הדמיה עם עדשת מים.

צרו כיסוי באמצעות האקרילי הדנטלי, המכסה את שאר קצורי העור של אזור הפעולה, את מוט הקיבוע ומחזק את השוליים סביב החלון הגולגולתי. המתינו להתקשחות הצמנט הדנטלי. הוציאו את בעל החיים מהמסגרת הסטריאוטקסטיקה והעבירו אותו לתא התאוששות.

המתינו להתאוששות החיה מהניתוח תוך מעקב אחר התפקודים הפיזיולוגיים. הגישו אלחוש לאחר ניתוח באמצעות cyroproferrin, 10 milligrams per kilogram, וטיפול באנטיביוטיקה Baytril, 5 milligrams per kilogram, למשך 48 שעות. הפעילו את לייזר ה-ti sapphire והדליקו את המיקרוסקופ.

המערכת שבה נעשה שימוש בניסוי זה מצוידת בלייזר דו-פוטוני, מערכת OPO ו-PMT מזויף של גליום ארסניד כפול. הכניסו את בעל החיים לתא ההשראה והרדימו אותו. הוציאו את בעל החיים מתא ההשראה והניחו אותו תחת מסיכת הרדמה בגז מתחת למיקרוסקופ.

הפחית את זרימת החמצן ל-0.3 ליטר לדקה ואת ריכוז האיסופלורן ל-1.52%. קבע את בעל החיים למסגרת המיקרוסקופ המותאמת אישית באמצעות בורג MT או מערכת מותאמת אישית אחרת. יישר את החלון הגולגולתי. שים לב, ניתן להשתמש במערכת קיבוע הראש של יצרן המיקרוסקופ, אם כי המסגרת המותאמת אישית הספציפית מעניקה תוצאות טובות יותר, יציבות ראש משופרת ומיקום עקבי לאורך מספר הפגשם במהלך ניסוי כרוני.

בעזרת הגדרות מיקרוסקופ שדה רחב ועדשה בעלת הגדלה נמוכה, מרכזו את השדה על אחד מצדדיו של קליפת המוח הרטרו-ספלניאלית (retrosplenial cortex) ומקדו את המיקוד על פני השטח של זכוכית הביסוף. הוסיפו טיפת מים אל תוך הבאר האקרילית הדמויה למכתש. עברו לעדשת טבילה במים למרחק ארוך.

הזז את העדשה לעבר חלון הגולגולת עד שהמניסקוס של המים יחבר בין הדגימה לעדשה. עבור להגדרות של דו-פוטון והתחל לסרוק את הדגימה מלמעלה למטה תוך שימוש בזום הנמוך ביותר. חציית הקרום הקשיח (dura mater) תהיה גלויה כסנוור של אות לא ספציפי גבוה.

כוון את הגדרות הרכישה של המיקרוסקופ בשני הערוצים, GFP ו-mCherry, בהתאם לעוצמת האות מהתאים הפלואורסצנטיים כדי לכסות את כל הטווח הדינמי. לאחר מציאת נוירון מתאים שבו עץ הדנדריטים מופרד מתאים אחרים, בצע סריקה ראשונית באמצעות מסנני GFP בלבד, המוגדרים עם הזוום הנמוך ביותר ומרחק Z של חמישה מיקרונים. השג תמונת מקסימום פרוג'קציה של ערימת הסריקה והדפס אותה לצורך סימונים תוך שימוש בצבעים הפוכים.

הגדירו את הזוום לערך שיאפשר הדמיה של הפרטים המורפולוגיים הרצויים. הדמיאו את כל העץ הדנדריטי בערוצי GFP ו-mCherry תוך שימוש בהקרנה מקסימלית (maximum projection) כמדריך. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן יהיה לנטר שוב ושוב מבנים פרה- ופוסט-סינפטיים בקליפת המוח הרטרוספלאניאלית (retrosplenial cortex).

ניתן להשתמש בגישה זו בניסוי כרוני שבו מניפולציות התנהגותיות צפויות להתואם עם שינויים במורפולוגיה של דנדריטים, קוצים סינפטיים או נוירונים פרה-סינפטיים. ניתן לבצע את מפגשי הדימות בכל תדירות, אך מומלץ להשתמש במרווח זמן של 24 שעות כדי לאפשר התאוששות תקינה של בעל החיים ולמזער את השפעת ההרדמה. ביישום נכון, טכניקה זו מאפשרת ביצוע מפגשי דימות מרובים לאורך מספר חודשים.