Name: שני פוטונים סימולטני In vivo הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
Description: חקור הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת עכבר Retrosplenial באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים in vivo בשילוב זיהום וירוס AAV המביע mCherry. שיטה זו מאפשרת מעקב ארוך טווח בשינויים מבניים תלויי ניסיון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות מ Steczkowski להקלטות קול, מ Borczyk עבור ציורים, א Trąbczyńska לייצור וירוס, מ Ziókowska עבור genotyping וא Mirgos לסיוע בעבודת המצלמה. KR מכיר מתנה סוג של וירוס adeno הקשורים רקומביננטי (rAAV) המבטאים חלבון פלואורסצנטי mCherry בשליטת היזם CaMK מ ק דייזרות. פרויקט זה בוצע במתקני הגרעין של מעבדה של מודלים בבעלי חיים המעבדה של מבנה רקמות ותפקוד, מרכז לנוירוביולוגיה, Nencki המכון לביולוגיה ניסויית, עם השימוש בתשתית CEPT במימון האיחוד האירופי - קרן האירופית לפיתוח אזורי בתוך התכנית התפעולית &quot;כלכלה חדשנית&quot; עבור 2007-2013. עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של הלאומית למדע מרכז: סונטה Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02,996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00,861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00,691 ל KR וסונטה Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC

כל הפרוצדורות המתוארות להלן אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית במכון Nencki לביולוגיה ניסויית, פולנית האקדמיה הלאומית למדעים. הערה: החלק מן הקלעים של הווידאו הקשור מואץ. גורם מהירות מותווה בסצנות אלה. 1. ניתוח הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל הכלים, מיכלי זכוכית עבור נוזלים צמר גפן ב החיטוי. יש להשתמש בכפפות אפשר לוותר עליהן. נקו את שולחן הניתוחים, מסגרת stereotaxic וכל האזור שמסביב עם אתנול 70%. השתמש כרית כירורגית סטרילית ליצור מרחב סטרילי עבור כל הציוד המעוקר. חותכים gelfoam לחתיכות קטנות להשרות אותם מלח סטרילית. הערה: על פי המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה, אתנול אינו מהווה sterilant ולא חיטוי ברמה גבוהה. זה אמור לשמש רק כסוכן ניקוי / defatting על משטחים מעוקרים בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את החיה הדואר בתא האינדוקציה ולהגדיר את רמת isoflurane עד 5% ו זרימת חמצן 2 ליטר / דקה. הליך זה צריך לקחת כ -3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את החיה מתוך חדר האינדוקציה. השתמש צובט זנב או הבוהן על מנת להבטיח כי בעל החיים הוא מסומם לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש גוזם מדויק לגלח את השיער מהחלק האחורי של הראש (בין האוזניים) עד העיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את החיה בתוך מסגרת stereotaxic ולייצב את הראש עם ברי אוזניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיוון דרגת הרדמה isoflurane 1.5-2% ו -0.3 ליטר / דקה חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את משחת עיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את תת עורי חיה עם Tolfedine (4 מ&quot;ג / ק&quot;ג), Butomidor (2 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו Baytril (5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) כדי למנוע דלקת, כאב וזיהום, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את לשריר חיה עם Dexamethasone (0.2 מ&quot;ג / ק&quot;ג) כדי למנוע נפיחות במוח. הערה: אפשר להזריק תת עורי Dexamethasone או intraperitoneally למנוע נזק לשרירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את העור באמצעות sצמר גפן terile בבטאדין ואחריו אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את הכפפות ולרסס אותם עם אתנול 70%. הערה: בעת שימוש בכפפות חד פעמיות אין לגעת שדה סטרילי. גע החיה היחידה בקצות מכשירי ניתוח סטרילי ספוגיות סטרילי. </li></ol> כירורגיה 2. חלון גולגולתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את העור עם מלקחיים באמצעות מספרי מייקרו לחתוך את העור בצורה אופקית לאורך בבסיס הראש ולאחר מכן באלכסון עד לנקודת החזית בין העיניים. הסר את דש העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחה לידוקאין עם ספוגית סטרילית על קרום העצם כדי למנוע דימום וכאב מוגזם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צמר גפן סטרילי או אזמל כדי להסיר את קרום העצם. לייבש את הגולגולת עם צמר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט סטרילית להחיל דבק cyanoacrylate צפוף על קצות העור לשתק אותם ולמנוע ממגע במלט שיניים. חכו הדבק להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נח coverglass 3 מ&quot;מ סטרילית על tהוא גולגולת קדמית אל תפר lambdoid. מרכז את coverslip ב RSC קואורדינטות: AP, גבחת -2.8; ML, גבחת 0. סמן את הקצוות coverslip ידי מגרד את פני הגולגולת עם מחט סטרילית. שים את coverglass בחזרה לתוך המיכל סטרילית עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מקדח שיניים במהירות גבוהה עם בר קוטר קטן לשרטט מעגל בקוטר 3 מ&quot;מ. נקה את הקידוח מעפר העצם עם מטליות טבולות תמיסת מלח סטרילית. השתמש gelfoam ו מטליות כדי לעצור את הדימום מדי פעם ולנקות את העצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין לבין הקידוח לבדוק את עובי העצם עם מלקחיים בסדר על ידי נגיעת מעגל העצם בעדינות ובדיקת הניידות שלה. זכור כי העצם עבה על האזור של התפר. עצור את הקידוח כאשר מעגל העצם הוא נייד ורק בשכבה אחידה, דקה של עצם נשארת על ההיקף. נקה את השדה התפעולי של כל אבק העצם הנותרים עם מטליות טבלו מלוחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק את תמיסת מלח סטרילית על אזור הקידוח, המכסה את CIR קדחCLE. בזהירות לחטט מעגל העצם עם מלקחיים בסדר ואז בעדינות אך בתקיפות להסיר את העצם על ידי הרמתו כלפי מעלה. היזהר שלא להטות את מעגל העצם כשאני מרים אותה כדי למנוע נזק אפשרי הדורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להחיל את gelfoam ספוגה תמיסת מלח סטרילית על הדורה כדי לעזור לעצור את הדימום. חכו עד שכל הדימום נעצר לחלוטין. מוציאים בזהירות את gelfoam לא להפריע בתהליך הקרישה. הערה: אזור התפר הוא vascularized מאוד, כך את הדימום בנקודה זו עלולה להתברר עמוק. זה חיוני כדי לחכות מספיק זמן הדימום להפסיק לחלוטין. זה עוזר לשמור על gelfoam המלוח ספוג מקורר על ידי הצבתו על קרח. </li></ol> 3. הזרקת וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף משאבת עירוי למגדל stereotactic ולחבר את הבקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מחט 35G לתוך המזרק. שטוף את המזרק 10 פעמים עם אתנול לעקר אותו 10 פעמים עם תמיסת מלח סטרילית כדי להסיר עקבות של דוארthanol. הסר בועות אוויר מן המזרק. הכנס את המזרק לתוך המשאבה. הערה: יש לשקול שימוש בחומרי חיטוי אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר מנה בודדת של הכנה מרמת rAAV2 / 1 mCherry (10 12 pfu מומלץ) ולשמור אותו על קרח. מלאו את המזרק עם פתרון וירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכז את המחט על גבחת ואז בעדינות להכניס לתוך ההיפוקמפוס באמצעות הקואורדינטות הבאות: AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. נקודות ציון אלה יהיו ממוקמים ליד קץ craniotomy. מתן 5 דקות עבור הרקמות לייצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 0.7 μl של פתרון mCherry מרמת rAAV2 / 1 בשיעור של 50 nl / min. חכה 10 דקות עבור הווירוס לספוג באופן מלא. הוצא בעדינות את המחט. כתם עם gelfoam אם הדימום מתרחש. חזור עם האתר הנגדי. </li></ol> 4. גולגולתי חלון השרשה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את coverglass סטרילי, מיובשים על גבי הדורה בפריים מעגל קדח. החזק את coverglass עם forceps לשטח ההדור בעדינות ולהביא coverglass &#39;קצוות קרובים לפני שטח הגולגולת. הערה: יתכן כי coverglass משבש את הקריש ואת קורות חיים הדימום. אם זה המקרה, להרים את coverglass, למקם אותו באלכוהול, יבש ולחזור לשלב 2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט סטרילית להחיל את דבק cyanoacrylate צפוף בשולי coverglass לצרף אותם אל הגולגולת. חכו הדבק להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בר קיבעון (אגוז M2 או עיצוב בהתאמה אישית) בחלק הקדמי של הגולגולת. החל את דבק cyanoacrylate על הקצוות של הבר. חכו הדבק להתייבש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את בר קיבעון בעמדה שתאפשר מיקום האופקי של החלון גולגולתי במהלך ההדמיה הפגישה. מניח אותו כמו רחוק ככל האפשר מן החלון. אם היא ממוקמת קרוב מדי אל החלון, הבר ואת הבורג חיבורו עם בעל מחוייט עלול להוות מכשול עבור המטרה במהלך תהליך ההדמיה. </li></ol></li><li&gt; הכן את אקריליק שיניים ולהחיל אותו על פני הגולגולת מסביב לכוס. זה מועיל כדי ליצור צורת מכתש דמוי סביב החלון. זה ייצור חלל עבור מים מיושמים מאוחר הדמיה במטרת המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור כובע עם אקריליק השיניים, המכסה את שאר השטח המבצעי, קצות עור, בר קיבעון, חיזוק המכתש סביב החלון גולגולתי. חכה מלט השיניים להתקשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיה מן המסגרת stereotaxic והכניס אותו לחדר התאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו החיה להתאושש מהניתוח תוך שמירה על תפקודים פיזיולוגיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל שיכוך כאבים שלאחר הניתוח (carprofen, 10 מ&quot;ג / ק&quot;ג) וטיפול אנטיביוטי (Baytril, 5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) במשך 48 שעות. </li></ol> הדמיה 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את טי: ספיר לייזר, כוח את המיקרוסקופ. המערכת השתמשה בניסוי זה מצוידת ליזר שני פוטונים, מערכת OPO ו PMT Gaasp הכפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את החיה inducתא tion ולגרום הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיה מן חדר האינדוקציה ומכניס את מסכת גז ההרדמה מתחת למיקרוסקופ. להקטין את זרימת החמצן 0.3 L / min ואת ריכוז isoflurane ל 1.5-2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן החיה למסגרת מיקרוסקופ המותאם אישית עם בורג M2 (או אחר מערכת מותאמת אישית). אזנו את החלון גולגולתי. הערה: אפשר להשתמש במערכת קיבוע הראש של מיקרוסקופ היצרן, למרות המסגרת המותאמת אישית המסוימת נותנת תוצאות טובות יותר (יציבות ראש משופרת, מיצוב קבוע בפגישות מרובות במהלך ניסוי כרוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בהגדרות מיקרוסקופ widefield ומרכז המטרה בהגדלה נמוכה הנוף על אחד הצדדים של קליפת retrosplenial ולהתמקד אותו על פני השטח coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל טיפה של מים לתוך הבאר אקריליק דמוי מכתש. Switch to טבילה אובייקטיבי מים למרחקים ארוכים. הזז את המטרה לעבר החלון גולגולתי עד con המניסקוס מיםnects הדגימה ואובייקטיבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור להגדרות שני הפוטונים ולהתחיל סריקה העליון הדגימה למטה באמצעות זום הנמוך ביותר. המעבר של דורה מאטר יהיה גלוי כמו בוהק של אות גבוהה שאינו ספציפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הגדרות הרכישה מיקרוסקופ בשני הערוצים (GFP ו mCherry) על פי עוצמת האות מתאי ניאון כדי לכסות את הטווח הדינמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מציאת נוירון מתאים (עם העץ הדנדריטי להפריד תאים אחרים) לבצע סריקה ראשונית רק באמצעות GFP filterset עם זום z למרחקים הנמוך של 5 מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג השלכה מרבית של ערימת סרוקים ולהדפיס אותו על הערות (באמצעות צבעים הפוכים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר זום לערך שיאפשר לתדמית פרטי מורפולוגיים הרצויים. תמונת העץ הדנדריטי כולו בערוצי GFP ו mCherry באמצעות הקרנה מרבית כמדריך. </li></ol>

<ol><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li>
<li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li>
<li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li>
</ol>

המחברים (KL, MR, KR) יש זכויות פטנט (PL410001) עבור מסגרת מחזיק בסעיף זה.

במאמר הנוכחי אנו מציגים פרוטוקול עבור שני הפוטונים סימולטני in vivo הדמיה של תשומות הסינפטי מטרות postsynaptic ב RSC דרך חלון גולגולתי. הליך ההשתלה להשתרע על פני כמה שלבים עיקריים. ראשית, החיה בהרדמה עמוקה וקבוע בפריים stereotactic, אז הגולגולת מעל RSC היא דלילה עם מקדחה בנוסח החוזר המסומן ואת העצם העגול מוסר. לאחר דימום פסק, mCherry מרמת rAAV2 / 1 מוזרקת לתוך ההיפוקמפוס, וכן מכסה זכוכית מקובע הגולגולת מעל אזור הקדח. לבסוף לבר הקיבעון מאובטח על ראש החיה מושמת ב...

שני הפוטונים מיקרוסקופיה מהפכת התצפית של פעילות המוח הן חי ופועל חיות. מאז השקתו בשנת 1990 הוא במהירות לפופולריות והוא מיושם כיום כאחת הגישות המעניינות והחדשניות ביותר כלפי בחינת היבטים רבים של פעילות מוח in vivo 1,2. יישומים אלה כוללים מדידות זרימת דם, הפעלת נוירונים (למשל, באמצעות אינדיקטורים רמת סידן או ביטוי גנים מוקדם מיידיים) ואת המורפולוגיה של תאים עצביים. מספר גדל והולך של מעבדות להשתמש מיקרוסקופי שני פוטונים, יישום הטכניקה ברחבי העולם המדעי כסטנדרט חדש עבור הדמיה המוחית in vivo. הגישה הסטנדרטית כוללת השתלה של החלון גולגולתי (חור עגול הגולגולת מכוסית זכוכית לכסות) מעל החבית או בקליפת המוח הראייתית של עכבר המוח 3. לאחר מכן, בהתאם לפרוטוקול הניסוי, mouse עובר סדרה של ויזואליזציה והדרכות התנהגותי, המאפשר לעקוב אחר השינויים בפעילות המוח והמורפולוגיה עצבית לאורך זמן 4,5. בשני המקרים craniotomy משפיע רק על עצם הקודקוד, מבלי לחצות את התפרים. הוא האמין בעיקר כי החיסרון העיקרי של השיטה הוא היישום שלה מוגבל cortexes ונגיש כגון חבית או בקליפת המוח הראייתית. השרשה של החלון גולגולתי על פני אזורים אחרים מציבה הרבה קשיים, עקב דימום יתר ו / או הפרעה מרחבית. במאמר זה אנו מציעים את ההשתלה של החלון גולגולתי מעל הקורטקס retrosplenial (RSC) כעוד באזור ריבית אפשרי עבור שני פוטונים in vivo מיקרוסקופיה 6. RSC היא מרכיב חשוב של המעגל במוח האחראי על היווצרות הזיכרון המרחבי. אנטומית, RSC היא חלק מהרשת עצבית חיבור קליפת מוח, בהיפוקמפוס, ואזורים התלמוס 7. זהבכבדות מעורב במגוון של התנהגויות, כגון לימוד ושינון הכחדה המרחבית וכן ניווט מרחבית 6. על מנת להמחיש את השינויים המורפולוגיים של נוירונים אנו משתמשים קו עכבר מהונדס מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת אמרגן Thy1. בעכברים אלו, GFP מתבטא כ 10% של הנוירונים במוח המאפשרים להדמיה ברורה של אקסונים קליפת המוח דנדריטים באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים 8. חידוש נוסף שאנו מציעים הוא הזרקה של סרוטיפ וירוס adeno הקשורים רקומביננטי 2/1 (מרמת rAAV2 / 1) קידוד חלבון פלואורסצנטי אדום (mCherry) תחת האמרגן camkii ספציפי נוירון 9 לתוך המבנים העמוקים יותר של המוח מקרין RSC , כגון ההיפוקמפוס. הביטוי של מרמת rAAV2 / 1 mCherry בהיפוקמפוס של העכבר Thy1-GFP מאפשר להדמיה סימולטני של אלמנטים טרום postsynaptic של hippocampo-cortical הסינפסות 10. הביטוי rAAV מונחה של mCherry דורש שבועיים עד שלושה שבועות לחלבון להגיע לרמה מספקת במסופים אקסונלית. תקופה זו עולה בקנה אחד עם הזמן הרגיל הנדרש להתאוששות מן craniotomy.

<table><tbody><tr><td><חזק>תרופה</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>בקסטר</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>5-2% טרום ניתוח</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>בקסטר</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>1.5-2% במהלך הניתוח</td></tr><tr><td>דקסמטזון</td><td>סריקת וטרינר</td><td>דקסאון 2 מ"ג/מ"ל</td><td>0.2 מ"ג/ק"ג תוך שרירי</td></tr><tr><td>Baytril Bayer</td><td></td><td>2.50%</td> <td>5 מ"ג/ק"ג תת עורי</td></tr><tr><td>טולפדין</td><td>וטוקינול</td><td>4%</td><td>4 מ"ג/ק"ג תת עורי</td></tr><tr><td>בוטומידור</td><td>ריכטר פארמה</td><td>10 מ"ג/מ"</td><td>ל 2 מ"ג/ק"ג תת עורי</td></tr><tr><td>קרפרופן</td><td>KRKA-Polska</td><td>Rycarfa 50 מ"ג/מ"ל</td><td>10 מ"ג/ק"ג תת עורי</td></tr><tr><td>לידוקאין</td><td>ג'לפה</td><td>ליגנוקאינום</td><td>מקומי</td></tr><tr><td>לידוקאין</td><td>ג'לפה</td><td>20 מ"ג/גרם</td><td>באופן מקומי</td></tr><tr><td><ניתוח>חזק</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קצף קצף</td><td>אתיקון</td><td>ספונגוסטן; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>משחת עיניים</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>באופן מקומי</td></tr><tr><td>CA דבק</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste</td><td></td></tr><tr><td>אקריליק שיניים</td><td>SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>מסגרת סטריאוטקסית</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td><חזק>כלי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>הרווארד מכשיר</td><td>HSE-64-0720</td><td>קוטר 3 מ"מ</td></tr><tr><td>מקדחה דנטלית</td><td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>מוט קיבוע</td><td>ניתן להשתמש באגוזי בורג N/A M2 או M3 בהתאמה אישית ניתן להשתמש</td><td></td><td></td></tr><tr><td>במלקחיים</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרו</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>מסגרת <חזקה>הדמיה</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחזיקה בהתאמה</td><td>אישית</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דו-פוטוני</td><td>Zeiss</td><td>Upright Axio Examiner Z1</td><td>יחידת לייזר: זיקית קוהרנטית 690-1040 ננומטר עם מתנד פרמטרי אופטי 1050-1300 ננומטר. מטרות: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 ו-LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. זיהוי: מסנני פס פס של Zeiss BP 500-550 (GFP) ו-BP 570-610 (mCherry) מופרדים על ידי מפצל אלומה ב-560 ננומטר ומחוברים לשני גלאי פוטו GaAsP.</td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virus</td><td>מתנה מ-K. Deisseroth</td><td></td><td>Recombinant adeno-associated virus (rAAV) המבטא חלבון פלואורסצנטי mCherry בשליטת מקדם CaMK</td></tr></tbody></table>

שני פוטונים סימולטני<em&gt; in vivo</em&gt; הדמיה של תשומות synaptic ויעדי postsynaptic בקליפת עכבר retrosplenial

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר (RSC) באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo בקו העכבר הטרנסגני Thy1-GFP. גישה זו יוצרת אפשרות לחקור את המתאם בין מניפולציות התנהגותיות לשינויים במורפולוגיה העצבית in vivo.
הליך השתלת חלון הגולגולת נחשב מוגבל רק לאזורי קליפת המוח הנגישים בקלות כגון שדה החבית. הגישה שלנו מאפשרת הדמיה של נוירונים ב-RSC בעל כלי דם גבוהים. RSC הוא מרכיב חשוב במעגל המוח האחראי על זיכרון מרחבי, שנחשב בעבר לבעייתי עבור הדמיית שני פוטונים in vivo.
השתלת חלון הגולגולת מעל ה-RSC משולבת עם הזרקה של נגיף אדנו-רקומביננטי המבטא mCherry (rAAVmCherry) לתוך ההיפוקמפוס הגבי. ה-mCherry המתבטא מתפשט להקרנות אקסונליות מההיפוקמפוס ל-RSC, ומאפשר הדמיה של שינויים הן בבוטונים אקסונליים פרה-סינפטיים והן בקוצים דנדריטיים פוסט-סינפטיים בקליפת המוח. 
טכניקה זו מאפשרת ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

<html> הביטוי של ה- GFP משנה של נוירונים עכבר כתב Thy1-GFP מאפשר in vivo ההדמיה של דנדריטים קליפת המוח ותחזיות axonal המקומיות RSC. איור 1 א מציג הקרנה מקסימלי של ערימה של תמונות עם דנדריטים GFP חיובים מרובים גלויים. גוף התא הוא מוסתר על ידי עורק. 1B האיור מראה תמונה אחת מטוס תקריב (זום דיגיטלי 3x) של סניף הדנדריטים המצוין 1A. פרטים של מורפולוגיה הדנדריטים (קוצים, filopodia) נראים בבירור. ערוץ GFP נרכש באמצ...

סרטון זה מציג את הליך הגולגולת המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר באמצעות מיקרוסקופ פוטונים שני פוטונים in vivo בקו טרנסגני Thy1-GFP. גישה זו משולבת עם הזרקת נגיף הקשור לאדנו המבטא mCherry לתוך ההיפוקמפוס הגבי. טכניקות אלו מאפשרות ניטור ארוך טווח של פלסטיות מבנית תלוית ניסיון ב-RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

כל ההליכים הניסיוניים המתוארים להלן אושרו על ידי הוועדה לאתיקה המקומית במכון ננסקי לביולוגיה ניסויית, האקדמיה הפולנית למדעים. סרטון זה מציג הליך קרניוטומיה המאפשר דימות כרוני של נוירונים בקורטקס רטרוספליני של עכבר באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo בשורת transgenic של one-G of feet. גישה זו משולבת עם הזרקה של נגיף אדנו-אסוציאטיבי, AAV, המבטא mCherry להיפוקמפוס הדורסלי.שילוב של טכניקות אלו מאפשר ניטור ארוך טווח של תלות מפותחת ופלסטיות מבנית בקליפת המוח הרטרוספלינלית (retrosplenial cortex). במאמר זה, אנו מציעים את השתלת החלון הגולגולתי מעל הקליפת הרטרוספלינלית כאזור עניין אפשרי למיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo. כדי להמחיש את השינויים המורפולוגיים במבנים עצביים, אנו משתמשים בעכברי thy1-GFP, שבהם מבוטא חלבון GFP פלורסצנטי בכ-10 אחוזים מהנוירונים במוח.חדשנות נוספת שאנו מציעים היא הזרקה של AAV, המבטא חלבון פלואורסצנטי mCherry תחת פרומוטור ספציפי לנוירונים, אל תוך מבנים עמוקים יותר במוח, כגון ההיפוקמפוס, במטרה לה可דמיזציה של השליחות מהמבנה אל קליפת המוח הרטרוספלינלית. סטריליזו את כל הכלים, כלי הזכוכית לנוזלים ומקלוני הצמר באוטוקלאב. השתמשו בכפפות חד-פעמיות.נקה את שולחן הניתוח, את המסגרת הסטריאוטקטית ואת כל האזור שסביבם בעזרת 70% ethanol. השתמש בפד כירורגי סטרילי כדי ליצור מרחב סטרילי עבור כל הציוד שעבר עיקור. חתוך ספוג ג'ל לחתיכות קטנות והשרה אותן בתמיסת סליין סטרילית.הכנס את בעל החיים לתא ההשראה וכוון את רמת האיסופלורן ל-5% ואת זרימת החמצן לשני ליטרים לדקה. הליך זה אמור להימשך כ-שלוש דקות. הוצא את בעל החיים מתא ההשראה.השתמשו בצביטה בזנב או בבהונות כדי לוודא שהבעל חיים נמצא תחת הרדמה מלאה. בעזרת תכלימי גזירה מדויקים, גזרו את הפרווה מהחלק האחורי של הראש, בין האוזניים, עד לעיניים. מקמו את בעל החיים במסגרת הסטריאוטקטית וייצבו את הראש באמצעות מוטות אוזניים.כוון את רמות ההרדמה ל-1.5 עד 2% isoflurane ושלושה עשיריים של ליטר חמצן לדקה. מרח את המשחה לעיניים. הזרק לבעל החיים תת-עורית (subcutaneously) tolfedine במינון 4 mg/kg, butomidor במינון 2 mg/kg ו-Baytril במינון 5 mg/kg כדי למנוע דלקת, כאב וזיהום בהתאמה.הזריק לבעל החיים דקסמתזון, 0.2 מיליגרם לקילוגרם, לתוך השריר כדי למנוע בצקת מוחית. נקה את העור באמצעות מקלוני צמר sterile עם betadine ולאחר מכן עם 70% ethanol. החלף כפפות ורסס אותן עם 70% ethanol.הרימו את העור באמצעות פינצטה ובעזרת מיקרו-מספריים בצעו חתך אופקי בעור לאורך בסיס הראש ולאחר מכן חתך אלכסוני לנקודה הקדמית שבין העיניים. הסירו את פני השטח של העור. מרחו משחה של lidocaine בעזרת מקלון סטרילי על הפריאוסטום (periosteum) כדי למנוע דימום מוגבר וכאב.השתמשו במקלוני צמר גפן סטריליים או בסקאלפל כדי להסיר את הפריאוסטום (periosteum). ייבשו את הגולגולת באמצעות מקלוני צמר גפן סטריליים. בעזרת מחט סטרילית, מרחו דבק ציאנואקרילט (cyanoacrylate) סמיך על שולי העור כדי לקבע אותם ולמנוע מגע נוסף עם סמנט דנטלי.המתינו לייבוש הדבק. הניחו זכוכית כיסוי סטרילית בעובי שלושה מילימטרים מעל הגולגולת, קדמית לתפר הלמדואידי (lambdoid suture). מרכזו את זכוכית הכיסוי בקואורדינטות הרטרוספלניאליות (retrosplenial), קדמי, אחורי ברגמה (bregma) מינוס 2.8, מדיאלי לטראלי ברגמה 0.סמנו את קצוות זכוכית ה כיסייה על ידי שריטה של פני הגולגולת עם מחט סטרילית. החזירו את זכוכית הכיסייה למכל הסטרילי עם 70% ethanol. השתמשו במקדח שיניים במהירות גבוהה עם ראש קידוח בעל קוטר קטן כדי להקיף במעגל בעל קוטר של שלושה מילימטרים.נקה את אתר הקידוח מאבקת עצם באמצעות מקלוני sworn סטריליים עם טיפות סלין. השתמש בספוג ג'ל ובמקלונים כדי לעצור דימומים מזדמנים ולנקה את העצם. בין פעולות הקידוח, בדוק את עובי העצם בעזרת פינצטה עדינה על ידי נגיעה עדינה במעגל העצם ובדיקת ניידותו.יש לקחת בחשבון שהעצם עבה יותר באזור התפרים. יש להפסיק את הקידוח כאשר עיגול העצם נייד ונותרה רק שכבה דקה ואחידה של עצם בהיקף. נקה את שדה הפעולה מכל שאריות אבקת העצם באמצעות מקלוני צמר גפן ספוגים בסליין.טפטפו תמיסת סליין סטרילית על אזור הקידוח, כך שתכסה את המעגל שקדוח. הרימו בזהירות את מעגל העצם בעזרת פינצטה עדינה, ולאחר מכן הסירו בעדינות אך בנחישות את העצם על ידי הרמה כלפי מעלה. היזהרו לא להטות את מעגל העצם בזמן ההרמה כדי למנוע נזק אפשרי לדורה.הניחו בעדינות את ספוג הג'ל הספוג בתמיסת סלין סטרילית על הדורה כדי לסייע בעצירת הדימום. המתינו עד שהדימום ייעצר לחלוטין. הסירו בזהירות את ספוג הג'ל כדי לא להפריע לתהליך קרישת הדם.שימו לב, אזור התפירה עשיר בכלי דם, לכן הדימום בנקודה זו עלול להיות עז. חיוני להמתין זמן מספיק עד להפסקת הדימום. חברו את משאבת ההזרקה למגדל הסטריאוטקטי וחברו את הבקר.הכנס את המחט בכילוי (guage) 35 למזרק המילוי. שטוף את המזרק 10 פעמים עם אתנול כדי לעקרו, ו-10 פעמים עם תמיסת מלח סטרילית כדי להסיר שאריות אתנול. הסר בועות אוויר מהמזרק.הכנס את המזרק אל המשאבה. מלא מנה בודדת של תכשיר AV ושמור אותה על קרח. מלא את המזרק בתמיסת נגיף.מרכזו את המחט על הבריגמה ולאחר מכן הכניסו אותה בעדינות להיפוקמפוס באמצעות הקואורדינטות הבאות: Anterior, posterior -2, medial lateral ±1, dorsal ventral -1. קואורדינטות אלה ימוקמו קרוב לקצה התחום הגולגולתי. המתינו חמש דקות לייצוב הרקמה.הזריק 0.7 µL מתמיסת AV בקצב של 50 nL לדקה. המתן 10 דקות לספיגה מלאה של הנגיף. הוצא את המחט בעדינות.ספגו בעזרת ספוג ג'ל אם מופיע דימום. חזרו על הפעולה בצד הנגדי. הנחו את זכוכית הכיסוי הסטרילית והיבשה על החלק העליון של הקשיה (dura) בתוך מסגרת המעגל שנקדחה.החזקו את זכוכית הכיסוי בעזרת פינצטה כדי לשטח בעדינות את הקשיה (dura) ולהביא את קצוות זכוכית הכיסוי קרוב יותר לפני השטח של הגולגולת. בעזרת מחט סטרילית, מרחו דבק ציאנואקרילט דחוס על קצוות זכוכית הכיסוי כדי להצמיד אותם לגולגולת. המתינו לייבוש הדבק.מקמו מוט קיבוע, בורג אנטון (anton nut) או תכנון מותאם אישית בחלק הקדמי של הגולגולת. שימו לב, יש למקם את מוט הקיבוע במיקום שיאפשר מיקום אופקי של חלון הגולגולת במהלך סשן ההדמיה. מרחו את הדבק על קצותיו של המוט.המתינו לייבוש הדבק. שימו לב, יש למקם את מוט הקיבוע רחוק ככל האפשר מהחלון. אם הוא ימוקם קרוב מדי לחלון, המוט והבורג המחבר אותו למחזיק המותאם אישית עלולים להוות מכשול עבור העדשה במהלך תהליך הדמיה.הכינו את האקריליק הדנטלי ומרחו אותו על פני הגולגולת מסביב לזכוכית. מומלץ ליצור צורה דמוית מכתש מסביב לחלון; הדבר ייצור חלל עבור המים שיוסיפו מאוחר יותר לצורך הדמיה עם עדשת מים.צרו כיסוי באמצעות האקרילי הדנטלי, המכסה את שאר קצורי העור של אזור הפעולה, את מוט הקיבוע ומחזק את השוליים סביב החלון הגולגולתי. המתינו להתקשחות הצמנט הדנטלי. הוציאו את בעל החיים מהמסגרת הסטריאוטקסטיקה והעבירו אותו לתא התאוששות.המתינו להתאוששות החיה מהניתוח תוך מעקב אחר התפקודים הפיזיולוגיים. הגישו אלחוש לאחר ניתוח באמצעות cyroproferrin, 10 milligrams per kilogram, וטיפול באנטיביוטיקה Baytril, 5 milligrams per kilogram, למשך 48 שעות. הפעילו את לייזר ה-ti sapphire והדליקו את המיקרוסקופ.המערכת שבה נעשה שימוש בניסוי זה מצוידת בלייזר דו-פוטוני, מערכת OPO ו-PMT מזויף של גליום ארסניד כפול. הכניסו את בעל החיים לתא ההשראה והרדימו אותו. הוציאו את בעל החיים מתא ההשראה והניחו אותו תחת מסיכת הרדמה בגז מתחת למיקרוסקופ.הפחית את זרימת החמצן ל-0.3 ליטר לדקה ואת ריכוז האיסופלורן ל-1.52%. קבע את בעל החיים למסגרת המיקרוסקופ המותאמת אישית באמצעות בורג MT או מערכת מותאמת אישית אחרת. יישר את החלון הגולגולתי. שים לב, ניתן להשתמש במערכת קיבוע הראש של יצרן המיקרוסקופ, אם כי המסגרת המותאמת אישית הספציפית מעניקה תוצאות טובות יותר, יציבות ראש משופרת ומיקום עקבי לאורך מספר הפגשם במהלך ניסוי כרוני.בעזרת הגדרות מיקרוסקופ שדה רחב ועדשה בעלת הגדלה נמוכה, מרכזו את השדה על אחד מצדדיו של קליפת המוח הרטרו-ספלניאלית (retrosplenial cortex) ומקדו את המיקוד על פני השטח של זכוכית הביסוף. הוסיפו טיפת מים אל תוך הבאר האקרילית הדמויה למכתש. עברו לעדשת טבילה במים למרחק ארוך.הזז את העדשה לעבר חלון הגולגולת עד שהמניסקוס של המים יחבר בין הדגימה לעדשה. עבור להגדרות של דו-פוטון והתחל לסרוק את הדגימה מלמעלה למטה תוך שימוש בזום הנמוך ביותר. חציית הקרום הקשיח (dura mater) תהיה גלויה כסנוור של אות לא ספציפי גבוה.כוון את הגדרות הרכישה של המיקרוסקופ בשני הערוצים, GFP ו-mCherry, בהתאם לעוצמת האות מהתאים הפלואורסצנטיים כדי לכסות את כל הטווח הדינמי. לאחר מציאת נוירון מתאים שבו עץ הדנדריטים מופרד מתאים אחרים, בצע סריקה ראשונית באמצעות מסנני GFP בלבד, המוגדרים עם הזוום הנמוך ביותר ומרחק Z של חמישה מיקרונים. השג תמונת מקסימום פרוג'קציה של ערימת הסריקה והדפס אותה לצורך סימונים תוך שימוש בצבעים הפוכים.הגדירו את הזוום לערך שיאפשר הדמיה של הפרטים המורפולוגיים הרצויים. הדמיאו את כל העץ הדנדריטי בערוצי GFP ו-mCherry תוך שימוש בהקרנה מקסימלית (maximum projection) כמדריך. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן יהיה לנטר שוב ושוב מבנים פרה- ופוסט-סינפטיים בקליפת המוח הרטרוספלאניאלית (retrosplenial cortex).ניתן להשתמש בגישה זו בניסוי כרוני שבו מניפולציות התנהגותיות צפויות להתואם עם שינויים במורפולוגיה של דנדריטים, קוצים סינפטיים או נוירונים פרה-סינפטיים. ניתן לבצע את מפגשי הדימות בכל תדירות, אך מומלץ להשתמש במרווח זמן של 24 שעות כדי לאפשר התאוששות תקינה של בעל החיים ולמזער את השפעת ההרדמה. ביישום נכון, טכניקה זו מאפשרת ביצוע מפגשי דימות מרובים לאורך מספר חודשים.

simultaneous-two-photon-vivo-imaging-synaptic-inputs-postsynaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina.  J. Vis. Exp. (2021). סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית רשתית in vivo באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני. עכברים מורדמים מוכנים להדמיה על ידי אבטחת ראשם, מריחת חומר סיכה לעיניים והנחת כיסוי על העין. תאי גנגליון רשתית (RGCs) המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים מוצגים לראשונה באמצעות אפיפלואורסצנציה ליישור. לבסוף, נעשה שימוש בהדמיה דו-פוטונית, המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של RGCs.

הדמיית שני פוטונים in vivo של רשתית העכבר

מקור: Maruoka, H., et. al. {{}}הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכברים ערים. J. Vis. exp. (2022) סרטון זה מציג הליך מיקרוסקופיה דו-פוטוני להדמיית פעילות עצבית ודינמיקה של מיקרוגליה בעכבר ער במהלך גירוי חזותי, תוך הדגשת מעברי סידן ואינטראקציות תאיות.

הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכבר ער

מקור: Kamei, R., et. al., In vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון מדגים את תהליך ההתקנה וההדמיה של מיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo של דינמיקת מיקרוגליה בהיפוקמפוס CA1 (Cornu ammonis 1) ובפיתול המשונן, מה שמבטיח יישור אופטי אופטי והערכת שלמות מבנית.

הדמיה דו-פוטונית in vivo של דינמיקת מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

שיטה מתוארת לתיוג נוירונים עם צבעי ניאון בתחומי מייקר מראש תפקודיים של הניאוקורטקס. ראשית, דימות אופטי אות פנימית משמש להשגת מפה תפקודית. אז מיקרוסקופ שני פוטונים משמש לתווית ונוירונים תמונה בתוך תחום מייקרו של המפה.

תיוג ממוקד של תאי עצב בתחומים ספציפיים מייקר פונקציונליים של הניאוקורטקס ידי שילוב אותות פנימיים והדמית שני פוטונים

שינויים מולקולריים חוויה תלויה בתאי עצב חיוניים ליכולתו של המוח להסתגל בתגובה לאתגרים התנהגותיים.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

הדמיית זמן-lapse בבעל חיים חי מספקת מידע רב ערך על ארגון מחדש מבני במוח השלם. כאן, אנו מציגים תכשיר גולגולת דק המאפשר הדמיה טרנס-גולגולתית של מבנים סינפטיים בעלי תווית פלואורסצנטית בקליפת העכבר החי על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

אנו מתארים תהליך ניסוי למדידת פעילות. עצבית מבעד לחלונות אופטי כפול מעל הדו-צדדיים העיקרי המגע corticies (S1) ב- Thy1-GCaMP6s העכברים הטרנסגניים באמצעות 2-פוטון (2p) מיקרוסקופיה ויוו.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

שיטה זו מתארת הכנה כרונית המאפשרת גישה אופטית להיפוקמפוס של עכברים חיים. הכנה זו יכולה לשמש לביצוע הדמיה אופטית לאורך של הפלסטיות הקונסטרוקטיבית העצבית ופעילות-מעורר פלסטיות הסלולר במשך תקופה של מספר שבועות.

אורך שני-פוטון הדמיה של CA1 היפוקמאל בעכברים חיים

הדמיית in vivo היא כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה מתאר הדמיה טרנס-אימונית של רשתית העכבר באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי של שני פוטונים. הוא גם מדגים שיטות שונות של הדמיה חיה כדי לתייג פלואורסצנטיות קבוצות תאים מרובות של הרשתית.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

חקור הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת עכבר Retrosplenial באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים in vivo בשילוב זיהום וירוס AAV המביע mCherry. שיטה זו מאפשרת מעקב ארוך טווח בשינויים מבניים תלויי ניסיון.

שני פוטונים סימולטני

גלה סרטונים נוספים