שני פוטונים סימולטני In vivo הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

כל ההליכים הניסויים המתוארים להלן אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית במכון ננסקי לביולוגיה חווייתית באקדמיה הפולנית למדעים. סרטון זה מציג הליך קרניוטומיה המאפשר הדמיה כרונית של נוירונים בקליפת המוח הרטרו-טחולית של העכבר באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo בקו טרנסגני של כפות הרגליים. גישה זו משולבת עם הזרקת mCherry המבטא וירוס הקשור לאדנו, AAV, בהיפוקמפוס הגבי.

בשילוב יחד, טכניקות אלה מאפשרות ניטור ארוך טווח של תלות מנוסה, פלסטיות מבנית בקליפת המוח הרטרו-טחולית. במאמר זה, אנו מציעים השתלה של חלון הגולגולת מעל קליפת המוח הרטרו-טחולית כאזור עניין לא אפשרי עבור מיקרוסקופיה דו-פוטונית in vivo. על מנת לדמיין את השינויים המורפולוגיים במבנים עצביים, אנו משתמשים בעכברי B עם ביטוי של חלבון GFP פלואורסצנטי בכ-10 אחוזים מהנוירונים במוח.

חידוש נוסף שאנו מציעים הוא הזרקת AAV, ביטוי של חלבון פלואורסצנטי mCherry מתחת למקדם ספציפי לנוירונים למבנים העמוקים יותר במוח, כגון היפוקמפוס, על מנת לדמיין הקרנות של המבנה לקליפת המוח הרטרו-טחולית. עקר את כל הכלים, מיכלי הזכוכית לנוזלים וספוגיות צמר גפן בחיטוי. אתה כפפות שאפשר לוותר עליהן.

נקו את שולחן הניתוחים, את המסגרת הסטריאוטקטית ואת כל האזור שמסביב עם 70% אתנול. השתמש בפד כירורגי סטרילי כדי ליצור מרחב סטרילי לכל הציוד המעוקר. חותכים קצף ג'ל לחתיכות קטנות ומשרים אותם במי מלח סטריליים.

הכניסו את החיה לתא האינדוקציה והגדירו את רמת האיזופלורן ל-5% ואת זרימת החמצן לשני ליטר לדקה. הליך זה אמור להימשך כשלוש דקות. הוצא את החיה מתא האינדוקציה.

השתמש בצביטות זנב או בוהן על מנת להבטיח שהחיה מורדמת לחלוטין. בעזרת גוזמים מדויקים, גלחו את השיער מהחלק האחורי של הראש, בין האוזניים, עד העיניים. הניחו את החיה במסגרת הסטריאוטקטית וייצבו את הראש בעזרת מוטות אוזניים.

הגדר את רמות ההרדמה ל-1.5 עד 2% איזופלורן ואפס נקודה שלושה ליטר חמצן לדקה. יש למרוח את משחת העיניים. הזרקו לבעל החיים טולפדין תת עורי עם טולפדין, ארבעה מיליגרם לקילוגרם, בוטומידור, שני מיליגרם לקילוגרם, וביטריל, חמישה מיליגרם לק"ג למניעת דלקת, כאב וזיהום בהתאמה.

הזריק לבעל החיים תוך שרירי דקסמתזון, אפס נקודה שני מיליגרם לקילוגרם, כדי למנוע נפיחות במוח. נקו את העור באמצעות צמר גפן סטרילי עם בטדין ואחריו 70% אתנול. החלף את הכפפות ורסס אותן באתנול 70%.

הרם את העור בעזרת מלקחיים ובעזרת מיקרומספריים חתך את העור בצורה אופקית לאורך בסיס הראש ולאחר מכן באלכסון לנקודה הקדמית בין העיניים. הסר את דש העור. מרחו משחת לידוקאין עם ספוגית סטרילית על הפריאוסטאום כדי למנוע דימום וכאב מוגזמים.

השתמש בצמר גפן סטרילי או באזמל כדי להסיר את הפריאוסטאום. יבש את הגולגולת בעזרת ספוגיות סטריליות. בעזרת מחט סטרילית, מרחו דבק ציאנואקרילט צפוף על קצוות העור כדי לשתק אותם ולמנוע מגע נוסף עם מלט שיניים.

המתן עד שהדבק יתייבש. הנח זכוכית כיסוי סטרילית של שלושה מילימטר מעל הגולגולת מלפנים לתפר הכבש. מרכז את החלקת הכיסוי בקואורדינטות רטרוספליאליות, קדמי, ברגמה אחורית מינוס שתיים נקודה שמונה, ברגמה לרוחב מדיאלי אפס.

סמן את קצוות החלקת הכיסוי על ידי גירוד משטח הגולגולת בעזרת מחט סטרילית. החזירו את זכוכית הכיסוי למיכל הסטרילי עם 70% אתנול. השתמש במקדחה דנטלית מהירה עם בור בקוטר קטן כדי לשרטט עיגול בקוטר שלושה מילימטרים.

נקה את אתר הקידוח מאבק העצמות בעזרת ספוגיות סטריליות עם קצה מי מלח. השתמש בקצף הג'ל ובמקלונים כדי לעצור את הדימום מדי פעם ולנקות את העצם. בין הקידוח, בדוק את עובי העצם בעזרת מלקחיים עדינים על ידי נגיעה עדינה במעגל העצם ובדיקת הניידות שלו.

יש לזכור כי העצם עבה יותר באזור התפרים. הפסק את הקידוח כאשר מעגל העצם נייד ונשארת רק שכבה דקה של עצם על ההיקף. נקה את השדה התפעולי מכל אבק העצמות שנותר בעזרת ספוגיות עם קצה מלח.

זרוק את מי המלח הסטריליים על אזור הקידוח, מכסה את המעגל הקדוח. חטפו בזהירות את עיגול העצם בעזרת מלקחיים עדינים ולאחר מכן הסירו את העצם בעדינות אך בחוזקה על ידי הרמתה כלפי מעלה. היזהר לא להטות את מעגל העצם בזמן הרמתו כדי למנוע נזק אפשרי לדורה.

מרחו בעדינות את קצף הג'ל הספוג במי מלח סטריליים על הדורה כדי לעזור להגביר את הדימום. המתן עד שכל הדימום ייפסק לחלוטין. הסר בזהירות את קצף הג'ל כדי לא להפריע לתהליך הקרישה.

שימו לב, אזור התפר הוא כלי דם גבוהים ולכן הדימום בשלב זה עשוי להתגלות כעמוק. חיוני להמתין לזמן מספיק כדי שהדימום ייפסק. חבר את משאבת העירוי למגדל הסטריאוטקטי וחבר את הבקר.

הכנס את מחט ה-35 למזרק המילוי. יש לשטוף את המזרק 10 פעמים באתנול כדי לעקר אותו ו -10 פעמים במי מלח סטריליים כדי להסיר עקבות של אתנול. הסר בועות אוויר מהמזרק.

הכנס את המזרק למשאבה. מלאו מנה אחת של תכשיר AV ושמרו אותה על קרח. מלאו את המזרק בתמיסת וירוסים.

מרכז את המחט על ברגמה ולאחר מכן הכנס בעדינות להיפוקמפוס באמצעות הקואורדינטות הבאות: קדמי, אחורי מינוס שתיים, לרוחב מדיאלי פלוס מינוס אחד, גחון גבי מינוס אחד. קואורדינטות אלה ימוקמו בסמוך לקצה תחום הגולגולת. המתן חמש דקות עד שהרקמה תתייצב.

הזרקת נקודת אפס שבעה מיקרוליטר של תמיסת AV בקצב של 50 ננוליטר לדקה. יש להמתין 10 דקות עד שהנגיף ייספג במלואו. הסר בעדינות את המחט.

כתם בקצף ג'ל אם מתרחש דימום. חזור על הפעולה עם הצד הנגדי. הניחו את זכוכית הכיסוי היבש הסטרילית בחלק העליון של הדורה במסגרת המעגל הקדוח.

החזק את זכוכית הכיסוי עם הקדמות כדי לשטח בעדינות את הדורה ולקרב את קצוות זכוכית הכיסוי למשטח הגולגולת. בעזרת מחט סטרילית, מרחו את דבק הציאנואקרילט הצפוף על קצוות זכוכית הכיסוי כדי לחבר אותם לגולגולת. המתן עד שהדבק יתייבש.

הניחו מוט קיבוע, אגוז אנטון או עיצוב בהתאמה אישית בחלק הקדמי של הגולגולת. שימו לב, יש למקם את מוט הקיבוע במצב שיאפשר מיקום אופקי של חלון הגולגולת במהלך הפעלת ההדמיה. מרחו את הדבק על שולי המוט.

המתן עד שהדבק יתייבש. שימו לב, יש למקם את מוט הקיבוע רחוק ככל האפשר מהחלון. אם הוא ממוקם קרוב מדי לחלון, המוט והבורג המחבר אותו עם המחזיק בהתאמה אישית עלולים להוות מכשול למטרה במהלך תהליך ההדמיה.

הכינו את האקריליק הדנטלי ומרחו אותו על משטח הגולגולת סביב הזכוכית. זה מועיל ליצור צורה דמוית מכתש סביב החלון. זה ייצור חלל למים המיושמים מאוחר יותר להדמיה עם מטרת המים.

צור כובע עם האקריליק הדנטלי, המכסה את שאר האזור התפעולי קצוות העור מוט קיבוע המחזק מחדש את המכתש סביב חלון הגולגולת. המתן עד שהמלט הדנטלי יתקשה. הסר את החיה מהמסגרת הסטריאוטקטית והכניס אותה לתא ההתאוששות.

המתן עד שהחיה תתאושש מהניתוח תוך התבוננות בתפקודים הפיזיולוגיים. יש למרוח סירופרופרין בהרדמה לאחר הניתוח, 10 מיליגרם לק"ג, וטיפול אנטיביוטי בייטריל, חמישה מיליגרם לק"ג, למשך 48 שעות. הפעל את לייזר הספיר, הפעל את המיקרוסקופ.

המערכת המשמשת בניסוי זה מצוידת בלייזר דו-פוטוני, מערכת OPO ו-PMT מזויף כפול גליום ארסניד. הכניסו את החיה לתא האינדוקציה וגרמו להרדמה. הוציאו את החיה מתא האינדוקציה והניחו במסכת הרדמת הגז מתחת למיקרוסקופ.

הפחת את זרימת החמצן לנקודת אפס שלושה ליטר לדקה ואת ריכוז האיזופלורן ל-1.52%קבע את החיה למסגרת המיקרוסקופ המותאמת אישית עם בורג MT או מערכת מותאמת אישית אחרת. יישר את חלון הגולגולת. שימו לב, ניתן להשתמש במערכת קיבוע הראש של יצרן המיקרוסקופ, אם כי המסגרת המותאמת אישית הספציפית נותנת תוצאות טובות יותר, יציבות ראש משופרת, מיקום קבוע במספר הפעלות במהלך ניסוי כרוני.

באמצעות הגדרות המיקרוסקופ בעל השדה הרחב, מטרה בהגדלה נמוכה, מרכז את הנוף באחד מצידי קליפת המוח הרטרו-טחולית ומקד אותו על משטח החלקת הכיסוי. מרחו טיפת מים לבאר האקרילית דמוית המכתש. עבור למטרת טבילה במים למרחקים ארוכים.

הזז את המטרה לכיוון חלון הגולגולת עד שמניסקוס המים מחבר בין הדגימה למטרה. עבור להגדרות של שני פוטונים והתחל לסרוק את הדגימה מלמעלה למטה באמצעות הזום הנמוך ביותר. חציית חומר הדורה תהיה גלויה כבוהק של אות גבוה לא ספציפי.

התאם את הגדרות רכישת המיקרוסקופ בשני הערוצים, GFP ו-mCherry בהתאם לעוצמת האות מתאי פלורסנט על מנת לכסות את כל הטווח הדינמי. לאחר מציאת נוירון מתאים עם העץ הדנדריטי המופרד מתאים אחרים, בצע סריקה ראשונית באמצעות מסנני GFP בלבד המוגדרים עם הזום הנמוך ביותר ומרחק Z של חמישה מיקרון. השג הקרנה מקסימלית של ערימת הסריקה והדפס אותה לביאורים באמצעות צבעים הפוכים.

הגדר את הזום לערך שיאפשר לדמות את הפרטים המורפולוגיים הרצויים. דמיין את כל העץ הדנדריטי בערוץ GFP ו-mCherry באמצעות הקרנה מקסימלית כמדריך. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן יהיה לנטר שוב ושוב מבנים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים בקליפת המוח הרטרו-טחולית.

ניתן להשתמש בגישה זו עם ניסוי כרוני שבו מניפולציות התנהגותיות צפויות להיות בקורלציה כאשר שינויים במורפולוגיה של דנדריטים, עמודי שדרה סינפטיים או נויטרונים קדם-סינפטיים. ניתן לבצע את מפגשי ההדמיה בכל תדירות, אך עדיף מרווח זמן של 24 שעות על מנת לאפשר התאוששות תקינה של בעל החיים ולמזער את השפעת ההרדמה. אם מיושמת כראוי, טכניקה זו מאפשרת לבצע מספר מפגשי הדמיה במהלך מספר חודשים.