חקר היישום של חישה ביולוגית מבוססת פיזור רמאן משופר על פני שטח של sEVs בודדים באבחון מחלות ובטיפולים

אנו משתמשים בפיזור ראמן מוגבר על פני השטח בשילוב עם למידת מכונה כדי להתמודד עם אבחון מוקדם של סרטן, וגם לספק יישומים ביו-רפואיים. אתגר ניסויי מרכזי הוא ההטרוגניות הטבועה בדגימות אקסוזומים, הנתונים הספקטרוסקופיים המורכבים והממדים הגבוהים, שמחמירים עוד יותר על ידי יחס אות לרעש נמוך. בתחילה, פיפטה של כ-5 מיקרוליטר מדגימת הווסיקולה החוץ-תאית הקטנה על תת-המצע הפלזמוני המיועד.

הניחו את המצע במייבש כדי לתת לטיפה להתייבש לחלוטין למשך כ-15 דקות. לאחר מכן העבירו את המצע היבש למיקרוסקופ רמאן קונפוקלי. באמצעות תוכנת הכלי WiRE גרסה 4.4, התחל איסוף נתונים.

כוון את לייזר ההתרגשות ל-785 ננומטר ב-5 מיליוואט וכייל את המערכת. כדי לרכוש ספקטרות מהמצע הזהוב, יש לבצע סריקה סיור על שטח של 300 על 300 מיקרומטר כדי לאתר וזיקולות בודדות במצב סטטי עם גודל צעד של 10 מיקרומטר, חשיפה של 0.1 שנייה ועם 50% כוח לייזר. לאחר מיקום הוזיקולות, יש לבצע מיפוי ברזולוציה גבוהה במצב סטטי בתוך רשת של חמישה על חמש באמצעות גודל שלב של מיקרומטר אחד, חשיפה של 0.2 שניות לנקודה, ו-50% עוצמת לייזר.

לאחר מכן, רכוש ספקטרום ממצע הגרפן על ידי ביצוע הסריקות הבאות. סננו את הספקטרום הגולמי הראשוני והחריגו כל מי שמציג רעש מופרז או צורות ספקטרליות חריגות. החלו מסנן Savitsk-Golay על כל ספקטרום כדי להפחית רקע פלואורסצנציה ולהחליק את נתוני הספקטרום.

חשב את יחס האות לרעש עבור כל ספקטרום באמצעות שיטת שיא לקו הבסיס או שיטת סטיית התקן (סטיית תקן). לכל ספקטרום, מחשבים את יחס האות לרעש כיחס בין עוצמת השיא לאחר חיסור בסיסי ברצועת רמאן מייצגת לסטיית התקן של הרעש. הערכת רעש על ידי חיסור גרסה מוחלקת של הספקטרום, באמצעות גודל חלון של 11 וסדר פולינומי של שלושה מהספקטרום המקורי.

דירגו את כל הספקטרום בסדר עולה של יחס אות לרעש והערכו את ההתמדה של שיאי האבחון על פני הספקטרום המדורג כדי לקבוע את הסף. לאחר מכן קבע את הסף בנקודה שבה אחד מהפסגות הללו נעלם לרעש בסיסי התואם ליחס אות לרעש של 28. יש להוציא ספקטרות הנמוכות מסף יחס אות לרעש של 28 כדי להבטיח שרק ספקטרות איכותיות יישמרו לניתוח במורד הזרם.

וננרמל כל ספקטרום שנותר לעוצמת השיא המקסימלית שלו או לשטח הכולל מתחת לעקומה. הקצה תווית לכל מדידה ספקטרלית בהתבסס על מקורה, כמו חולה סרטן קיבה או ביקורת בריאה. הזן את הנתונים הספקטרליים המסומנים למסווג וקטורי תמיכה עם גרעין ליניארי והחלו חלוקת ערבוב שכבתית לאימות צולב חמש פעמים כדי להבטיח ייצוג מאוזן בכל קיפול.

כעת, ממוצע את מדדי הדיוק בכל הקיפולים כדי להעריך את ביצועי המודל הכוללים. לבסוף, השתמש בניתוח דיסקרימיננטי ליניארי, או LDA, כדי להפחית את הממדיות של מאגר הנתונים של פיזור רמאן משופר על פני השטח לצורך ויזואליזציה. השתמש במודל ניתוח ליניארי מבחין מאומן לביצוע סיווג ישיר בין קבוצות המדגם.

ספקטרום רמאן עם הספקטרום הממוצע המתאים חשף חתימות מולקולריות מובחנות בכל סוג דגימה שנלקח מאחידות חוץ-תאיות קטנות בודדות שבודדו מדגימות רקמה, דם ורוק. ניתוח ליניארי מבחין חשף קיבוץ ברור של נתוני וזיקולות חוץ-תאיות בהתאם לרקמה, לדם או לרוק המקור. סיווג בינארי באמצעות מסווג מכשיר וקטור תומך משיג את הדיוק הגבוה ביותר לדגימות רקמה עם 90.1%, אחריו דם ב-70.9% ורוק ב-60.7% בהתבסס על LDA מחלק בבירור דגימות סרטן בריאות וסרטן קיבה בנתוני ווסיקולה חוץ-תאית שמקורם ברקמה.

חלוקות סיווג דומות מבוססות LDA עבור נתוני ווסיקולה חוץ-תאית שמקורם בדם וברוק הראו הפרדה אופטימלית פחות בין דגימות בריאות לדגימות סרטן. ספקטרום הרמן של וזיקולות דוקסורוביצין מודגרות ללא גרפן הראו שיאים עקביים בכ-1,081, 1,206 ו-1,440 סנטימטרים הפוכים. עם גרפן, נצפו שיא D נוסף בכ-1,350 סנטימטרים הפוכים, ושיא G בכ-1,580 סנטימטרים הפוכים, ששימשו כתקנים פנימיים.

היחס בין שיא הדוקסורוביצין ב-442 סנטימטרים הפוכים, לשיא הגרפן G עלה עם ריכוזי תרופות גבוהים יותר וזמני דגירה ארוכים יותר. הקמנו טביעת אצבע ביוכימית של ווסיקולה אחת כדי להבחין בין מקורות מחלה המראים פוטנציאל לאבחון מוקדם. שלושה יתרונות מרכזיים של הטכניקה שלנו.

ראשית, זה רגיש מאוד. שתיים, זה לא פולשני. ושלישית, הוא אינו דורש ליסינג או פירוק פיזי של החלקיקים.

בעתיד, נקשר פרופיל ספקטרלי לפרופיל הפרוטאומי, אשר בתורו יסייע לקשר בין תוכן האקסום לפונקציות ספציפיות, כמו תקשורת תאית וההעברה.