What is explant culture and why is it used in neuroscience research?

Explant culture is a technique where neural tissue is carefully excised from an embryo and cultured in vitro to study development. This method allows researchers to manipulate and visualize developing tissues in ways impossible in living organisms. Explants maintain complex cellular architecture, enabling study of cell-cell interactions while providing accessibility to experimental tools and control over the chemical environment.

How are embryonic tissues prepared for explant culture?

Tissue preparation begins by sterilizing instruments with 70% ethanol and euthanizing a pregnant mouse. The uterus is surgically excised and placed in ice-cold buffer. Individual embryos are removed from their yolk sac under a dissection microscope, the brain is isolated, and the region of interest is carefully dissected and transferred to a culture dish containing culture medium.

What is slice culture and how does it differ from standard explant culture?

Slice culture involves sectioning neural tissue into thin sheets for improved visual access to developing cells. Before sectioning, tissue is embedded in 1.5% low melting point agarose for structural support. The agarose-embedded tissue is then glued to a specimen stage and sectioned using a vibratome, which uses a vibrating blade to cut thin slices of living tissue that are subsequently cultured.

What environmental conditions must be maintained for healthy explant tissue?

Explants are maintained in a 37°C incubator containing 5% CO2 for several weeks with 50% medium replacement every 2-3 days. Extracellular matrix proteins are often used to coat culture dishes since the ECM significantly impacts cell behavior. Some experiments require solutions resembling cerebrospinal fluid rather than traditional cell culture media to closely mimic the central nervous system environment.

How are cell migration assays performed using explanted neural tissue?

Cell migration assays use beads soaked in growth factors implanted into hindbrain explants to examine repulsive and attractive signals guiding neural cell movement. After 3-4 days of exposure, neurons are imaged using a confocal microscope. Results show whether neurons migrate toward or away from specific growth factors, revealing the chemical cues that direct neural cell migration during development.

What do co-culture assays reveal about neural development?

Co-culture assays investigate cell-cell interactions by culturing segments of spinal cord on top of muscle cell layers. Neurite projections emerge from the explant within 2 days, and functional innervation is observed by day 5 through muscle cell contraction. This demonstrates how spinal motor neurons establish connections with skeletal muscle and reveals the timeline of synapse formation during nervous system development.

How do axon guidance assays use explanted tissue to study neural development?

Axon guidance assays examine factors within neurons and the surrounding environment that direct axon elongation to proper target locations. Researchers use explanted tissues to study this complex process by observing how axons respond to environmental cues. This approach reveals the intrinsic and extrinsic signals that guide axon pathfinding during the establishment of neural connections between target tissue and the central nervous system.

Coltura di un espianto di tessuto nervoso

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Le colture di espianto servono come tecnica per studiare lo sviluppo di specifiche popolazioni cellulari e strutture neurali. Negli esperimenti di neuroscienze dello sviluppo, gli espianti sono tessuti neurali asportati da un embrione per lo sviluppo continuo in vitro. Queste colture danno ai ricercatori la capacità di manipolare e visualizzare i tessuti in via di sviluppo in modi che non sono possibili in vivo. Questo video introdurrà alcuni importanti principi alla base del lavoro con tessuti espiantati, procedure passo-passo per due approcci alla coltura di espianto, nonché applicazioni di questa tecnica.

Prima di approfondire i metodi, esaminiamo alcuni principi di base. Gli espianti possono essere stabiliti da un numero di organismi modello e da una varietà di tipi di tessuto. Generalmente, le colture vengono create rimuovendo con cura il tessuto neurale da un embrione, sezionando una regione di interesse e collocandola in un ambiente artificiale.

I tessuti possono anche essere sezionati in fogli sottili e coltivati in "slice culture". Poiché l'ambiente di coltura è progettato per imitare le condizioni in vivo dell'intero organo, questa strategia di coltura è spesso chiamata "organotipica".

Prima di iniziare, assicurati di sterilizzare i tuoi strumenti con il 70% di etanolo. Successivamente, l'eutanasia di un topo in gravidanza utilizzando il metodo preferito dal laboratorio. Quindi, asportare chirurgicamente l'utero e metterlo in un tampone ghiacciato. Trasferire il piatto su un microscopio di dissezione e rimuovere i singoli embrioni dal loro sacco vitellino. Quindi, isolare il cervello, sezionare attentamente la regione di interesse e trasferirsi in un piatto di cultura contenente terreno di coltura. Gli espianti possono essere mantenuti in un incubatore a 37 °C contenente il 5% di CO2 per alcune settimane sostituendo il 50% del mezzo ogni 2 - 3 giorni.

La coltura a fette di tessuto cerebrale richiede alcuni passaggi extra. Prima del sezionamento, il tessuto è incorporato nell'agarose, che fornisce supporto al tessuto in modo che rimanga intatto mentre viene affettato. Per fare questo, una soluzione di agarose a basso punto di fusione all'1,5% viene riscaldata fino a quando l'agarose si dissolve. Successivamente, l'agarose viene trasferito agli stampi incorporanti e lasciato raffreddare leggermente per evitare di danneggiare il tessuto.

Il tessuto può quindi essere accuratamente immerso e l'agarose lasciato indurire. I blocchi risultanti vengono tagliati e poi incollati a uno stadio campione e sezionati utilizzando un vibratoma, che è uno strumento che utilizza una lama vibrante per tagliare sottili fette di tessuto vivente. Man mano che le fette vengono generate, vengono accuratamente trasferite in un piatto rivestito contenente mezzi di coltura e coltivate come accennato in precedenza.

Ci sono una serie di vantaggi nell'utilizzare colture di espianto rispetto a in vivo e altri metodi in vitro. In primo luogo, le cellule nel tessuto espiantato sono più accessibili agli strumenti sperimentali. In secondo luogo, il fatto che gli espianti mantengano la complessa architettura cellulare dello sviluppo del tessuto neurale significa che le interazioni cellula-cellula possono essere studiate. In terzo luogo, poiché possono controllare la composizione chimica del terreno di coltura, gli scienziati possono utilizzare gli espianti per testare l'effetto di composti specifici sullo sviluppo dei tessuti.

Tuttavia, poiché viene rimosso dal suo ambiente naturale, è necessario prestare particolare attenzione per mantenere il tessuto felice e sano in vitro. Ad esempio, la presenza di matrice extracellulare, o ECM, ha un impatto significativo sul comportamento cellulare, quindi le proteine ECM purificate vengono spesso utilizzate per rivestire i piatti di coltura. Un'altra considerazione importante è la soluzione in cui vengono bagnati gli espianti. Mentre i tradizionali mezzi di coltura cellulare sono spesso usati, alcuni esperimenti richiedono soluzioni che assomigliano molto al fluido che circola nel sistema nervoso centrale: il liquido cerebrospinale, che è un reagente critico in esperimenti come quelli che stai per vedere.

Ora che abbiamo esaminato i metodi di coltura di espianto, vediamo come vengono utilizzate queste tecniche.

I saggi di migrazione cellulare utilizzano il tessuto espiantato per esaminare i segnali ripugnanti e attraenti coinvolti nel movimento delle cellule neurali. In questo esperimento, le pere che sono state precedentemente immerse in fattori di crescita vengono impiantate in espianti di cervello posteriore per esaminare la migrazione delle cellule neurali. Dopo 3 - 4 giorni di esposizione, i neuroni sono stati ripresi utilizzando un microscopio confocale. I risultati mostrano che i motoneuroni migrano verso perle imbevute di fattore di crescita endoteliale vascolare, ma non controllano le perle imbevute di tampone.

I saggi di co-coltura sono spesso utilizzati per studiare le interazioni cellula-cellula durante lo sviluppo. In questo esempio, segmenti di midollo spinale sono stati coltivati sopra uno strato di cellule muscolari per studiare come vengono fatte le connessioni tra i motoneuroni spinali e il muscolo scheletrico. Già 2 giorni dopo l'incubazione, le proiezioni dei neuroni, noti anche come neuriti, sono viste emergere dall'espianto. Entro 5 giorni, l'innervazione funzionale viene osservata dalla contrazione dello strato di cellule muscolari.

Durante lo sviluppo del sistema nervoso, i neuroni devono allungare i loro assoni per stabilire una connessione tra il tessuto bersaglio e il sistema nervoso centrale. Un modo per studiare questo complesso processo è attraverso saggi di guida assonale. I ricercatori usano tessuti espiantati per esaminare i fattori all'interno dei neuroni e nell'ambiente circostante che aiutano a guidare l'assone nella sua posizione corretta.

Hai appena visto la guida di JoVE per espiantare la coltura del tessuto neurale. Questo video ha coperto una panoramica dei vantaggi delle colture di espianto, strategie di coltura, protocolli passo-passo di due procedure di espianto comunemente usate e modi in cui queste tecniche vengono utilizzate oggi in laboratorio.

Grazie per l'attenzione!

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L'intricata struttura del sistema nervoso dei vertebrati deriva da una complessa serie di eventi che coinvolgono la differenziazione cellulare, la mig…