In situ subcellulära fraktionering av däggdjursceller på mikroskop täckglas tillåter visualisering av protein lokalisering.
Proteiners funktion är intimt kopplad till protein lokalisering. Även om vissa proteiner är begränsade till en viss plats eller subcellulära fack, många proteiner är närvarande som ett fritt diffuserande befolkningen i fritt utbyte med en delpopulation som är tätt förknippad med en viss subcellulära domän eller struktur. In situ subcellulära fraktionering tillåter visualisering av protein uppdelning och kan också avslöja protein delpopulationer som lokaliserar till specifika strukturer. Till exempel kan borttagning av lösliga cytoplasmiska proteiner och löst höll nukleära proteiner avslöja stabil sammanslutning av vissa transkriptionsfaktorer med kromatin. Efter rötning av DNA kan i vissa fall avslöja samband med det nätverk av proteiner och RNA som kollektivt kallas den nukleära schavotten eller nukleära matris.
Här beskriver vi de åtgärder som krävs vid in situ fraktionering av anhängare och icke-häftande däggdjursceller på mikroskop täckglas. Protein visualisering kan uppnås med hjälp av specifika antikroppar eller fluorescerande proteiner fusion och fluorescensmikroskopi. Antikroppar och / eller fluorescerande färger som fungerar som markörer för specifika utrymmen eller strukturer kan protein lokalisering kan kartläggas i detalj. In situ fraktionering också kan kombineras med Western blotting för att jämföra mängden protein som finns i varje fraktion. Denna enkla biokemiska angreppssätt kan avslöja föreningar som annars skulle förbli oupptäckta.
Vanliga problem och förslag:
Alla eller de flesta av cellerna försvinner vid tvätt. Under tvättsteg vätskor måste tillsättas långsamt till sidan av 6-brunnar undvika täckglas. Likaså vätskor bör avlägsnas genom att försiktigt luta plattan och långsamt pipettera bort överflödig vätska. Celladhesion kan ökas med hjälp av poly-L-Lysin belagda täckglas.
Genomisk DNA är inte helt smält. För vissa celltyper i DNAse jag matsmältningen steg kan beh?…
The authors have nothing to disclose.
Anyaporn Sawasdichai och Nazefah Abdul Hamid är tacksamma mot den thailändska regeringen och Malaysias regering respektive för doktorsexamen Stipendier. Detta arbete har finansierats av ett Wellcome Trust projektbidrag beviljas till PSJ och KG. Vi är också tacksamma till University of Bristol Wolfson Bioimaging Facility.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
BSA | Chemical | Sigma | A9647-100G | |
DNase I | Chemical | Sigma | DN25-1G | |
poly-L-Lysine | Chemical | Sigma | P-8920 | |
Trypsin | Chemical | |||
EGTA | Chemical | Sigma | E4378-25G | |
Fomaldehyde | Chemical | BDH | 284216N | |
PIPES | Chemical | Sigma | P-6757 | |
Sucrose | Chemical | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
Triton X-100 | Chemical | Sigma | T-6876 | |
Mounting Medium with DAPI | Chemical | Vector Laboratories | H-1200 | |
Fugene 6 Transfection Reagent | Chemical | Roche | 11814443001 | |
Histone H1 | Antibodies | Santa Cruz | SC-8030 | |
Lamin A/C | Antibodies | Santa Cruz | SC-20681 | |
Tubulin-α | Antibodies | Santa Cruz | SC-32293 |