Dissektion af Eye-Brain Complex fra Fly Pupper: En metode til at isolere Retinal Tissue

Overview

Denne video beskriver, hvordan man dissekere og isolere eye-brain kompleks fra Drosophila pupper. Den fremhævede protokol demonstrerer proceduren, der giver væv af høj kvalitet, der er kompatibel med for eksempel immunostaining, samt andre genekspressionseksperimenter.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra DeAngelis og Johnson, Dissektion af Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis og RNA Isolation,   J. Vis. Exp. (2019).

1. Vævspræparat

1. Opret Drosophila kors (som beskrevet tidligere i Greenspan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)) eller kultur specifikke Drosophila stammer for at opnå pupper af den ønskede genotype. For at sikre, at et stort antal pupper opstår tilfældigt, etablere disse flyve kulturer i to eksemplarer på næringsrige fødevarer medier eller standard fødevarer medier generøst suppleret med gær-pasta.
2. Drosophilas kulturer skal bevares ved 25 °C. For kors udnytte UAS-GAL4 system, GMR-GAL4 er en ideel driver udtrykt i larve øjenskive celler posterior til morfogenetiske fure og i hele pupal udvikling. Korset UAS-lacZ X GMR-GAL4 fungerer som et ideelt kontrolkors, da det driver udtryk for det ikke-endogene og inaktive β-galactosidaseprotein.
3. Brug spidsen af en 6" bambusskinne, der er blevet våd med destilleret vand, til forsigtigt at løfte hvid forpuppe(figur 1B) fra siden af sunde dyrkningsglas (figur 1A) og læg den i et 1,5 mL mikrocentrifugerør (Figur 1C).
4. Placer rørene i en plastpipettespidskasse sammen med et lille stykke væv gennemblødt i destilleret vand for at opretholde kammeret ved tilstrækkelig luftfugtighed til at beskytte pupperne mod udtørring (figur 1D). Pupperne inkuberes ved 25 °C indtil dissektion.
5. Brug en tør 6"-bambusskinne til forsigtigt at skubbe pupperne ud fra mikrocentrifugerøret og på en sort dissekeringsskål. Læg et nyt stykke dobbeltsidet tape på dissekerepladen væk fra pupperne.
6. Ved hjælp af et par pincet anbringes puppernes dorsale side forsigtigt op (dvs. operculums med udsigt, figur 1B) på båndet (Figur 2A). Sørg for, at pupperne klæber godt til båndet.
   BEMÆRK: Fugt på pupal sagen vil hæmme sikker vedhæftning til båndet, i hvilket tilfælde, lad pupperne til lufttørre før placering på dobbeltsidet tape.

2. Dissektion af eye-hjerne komplekser

1. Brug pincet til at fjerne operculum af hver puppe (Figur 2C).
2. Brug microdissection saks til at skære eller skære åbne pupal tilfælde af hver puppe. Flap åbne pupal sagen for at afsløre hovedet, brystkassen, og forreste abdominal segment, sikre kanterne af pupal sagen til dobbeltsidet tape (Figur 2C).
   BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt helt at afsløre pupperne.
3. Pierce maven af hver puppe med skarpe pincet, at gribe dyret, og fjerne det fra sin pupal sag (Figur 2C).
4. Puppen anbringes på den sorte dissektionsskål, væk fra tapen, og den dækkes med ca. 400 μL iskold fosfatbufferopløsning (PBS, pH 7.4).
5. Tag fat i hver puppe ved maven med pincet, og med mikrodissection saks, lav et rent tværsnit skåret gennem hele brystkassen og skær puppen i halvdelen (Figur 2D).
6. Fjern den bageste rest af hvert slagtekroppe fra PBS og læg det til side på dissekeringsskålen (kassér ikke trin 3.2.1).
7. Brug to par fine pincet, åbne brystkasse og hoved af hver puppe til at afsløre øjet-hjerne kompleks (Figur 2E). For at gøre dette skal du gribe fat i brystkasseepitelets skærekanter og gradvist rive for at åbne brystkassen og derefter hovedkapslen og udsætte øjen-hjerne-komplekset og det omgivende fedtvæv.
8. Uden at gribe fat i vævet, skal du bruge pincet til at guide øjet-hjerne kompleks væk fra resterne af hovedet kapsel eller scoop øjet-hjerne kompleks fra revet-åbne hoved kapsel.
   BEMÆRK: Øjen-hjerne-komplekset er håndvægtsformet, off-white og mere gennemskinneligt end det omgivende cremefarvede fedt(Figur 2B, E).
9. Med pincet, omhyggeligt fjerne de fleste fedt forbundet med øjet-hjerne komplekser uden at røre øjenvævet.

3. Behandling af væv med henblik på immunfluorescens

1. Dissekere mindst 6-10 pupper som beskrevet (trin 2.1-2.9).
   BEMÆRK: Tre til fire uafhængige replikater af hver dissektion har tendens til at give tilstrækkelige data til at teste en hypotese.
2. Vask og fiksering
   1. Skær spidsen af en P20- eller P100-pipettespids med et rent barberblad for at øge spidsåbningen til ~1 mm i radius og smør ved at pipettere en blanding af PBS og fedt op og ned. Dette fedt kan fås fra slagtekroppen rester fjernet i trin 2.6.
   2. Overfør øjen-hjerne komplekser i ~ 400 μL PBS i en 9-brønds glas skål, på is. Brug den smurte spids og en P20 eller P100 luftforskydning mikropipette til at overføre.
      BEMÆRK: Eye-brain komplekser vil overholde ulubricated tips under pipetter og blive beskadiget eller tabt.
   3. Fjern det resterende fedt, der er forbundet med øjenvævet, ved at pipetter PBS op og ned for forsigtigt at hvirvle øjen-hjerne-komplekserne. I denne og alle efterfølgende vasketrin må du ikke direkte pipette øjen-hjerne komplekser op og ned, da dette vil skade det skrøbelige øjenvæv.
   4. Eye-brain-komplekserne overføres i et minimalt volumen (<20 μL) af PBS til mindst 250 μL fikseringsmiddel. Bland ved at pipettere opløsningen op og ned. Inkuber i 35 minutter, på is.
      BEMÆRK: Den samme smurt spids tilberedt i trin 3.1.1 kan bruges til denne overførsel.
   5. Med samme pipettespids overføres øjen-hjerne-komplekserne til en brønd, der indeholder ~400 μL PBS. Bland ved at pipettere opløsningen op og ned og inkubere i 5-10 minutter på is, for at vaske. Gentag vasketrinnet mindst to gange.
      BEMÆRK: Øjen-hjerne-komplekser kan vedligeholdes i flere timer i den endelige PBS-vask, på is eller ved 4 °C, før du fortsætter til trin 3.3.1.
3. Antistof farvning
   1. For at blokere vævet, før det udsættes for antistofopløsninger, overføres øjen-hjerne-komplekserne til ~400 μL PBT. Brug den smurte spids og en P20 eller P100 luftforskydning mikropipette til overførslen. Inkuber i 10 til 60 minutter, på is.
   2. Den primære antistofopløsning fremstilles ved at fortynde passende antistoffer i PBT. Da øjen-hjerne komplekser inkuberes i 10 μL aliquots af antistofopløsning, vil det forberedte volumen være en replikat af 10.
   3. Aliquot 10 μL antistofopløsning i en ren brønd på en 72-brønds microwell bakke.
   4. Skær spidsen af en P10 pipette spids med et rent barberblad for at øge spidsen åbning til ~ 0,5 mm i radius og smøre ved pipetter PBT op og ned.
   5. Der overføres ikke mere end 5 øjen-hjernekomplekser i et volumen på <3 μL PBS til hver 10 μL brønd af antistofopløsning ved hjælp af en P10 luftforskydningsmikropipette og den smurte spids.
   6. Antistofopløsningen homogeniseres ved at pipettere opløsningen op og ned. Rør ikke øjen-hjerne-komplekserne op og ned, da dette vil skade vævet.
   7. For at minimere fordampning af antistofopløsningen skal der anbringes et lille stykke væv gennemblødt i destilleret vand i mikrowellbakken og forsegles bakken (f.eks. med det medfølgende låg). Inkuber natten over ved 4 °C.
   8. Overfør øjen-hjerne komplekser fra microwell bakken i ~ 400 μL PBT i en 9-welled glas skål, til vask. Brug en P10 luftforskydningsmikropipette og PBT-smurt spids (forbered som beskrevet i trin 3.3.4). Bland ved at pipettere opløsningen op og ned. Inkuber i 5-10 minutter på is.
   9. Gentag vasketrinnet mindst to gange. Brug en P20- eller P100-luftforskydningsmikropipette og PBT-smurt spids til at overføre øjen-hjerne-komplekserne mellem vaskeopløsninger.
   10. Den sekundære antistofopløsning fremstilles ved at fortynde passende fluorophore-mærkede sekundære antistoffer i PBT efter behov. 100 μL sekundær antistofopløsning er tilstrækkelig pr. parti på 6-10 pupper. Aliquot den sekundære antistofopløsning i en 9-godtet glasdissektionsskål.
   11. Overfør øjen-hjerne-komplekserne til sekundær antistofopløsning. Brug en P20- eller P100-luftforskydningsmikropipette og PBT-smurt spids til overførslen.
   12. Eye-brain-komplekserne inkuberes i sekundær antistofopløsning i 1-2 timer ved stuetemperatur eller 3-5 timer ved 4 °C. For at forhindre blegning af fluorophorer ved lys, dække præparatet med folie.
       BEMÆRK: Optimal inkubationsvarighed i sekundær antistofopløsning kan variere afhængigt af de primære og sekundære antistoffer, der anvendes.
   13. Overfør øjen-hjerne komplekser i ~ 400 μL PBT i en 9-brønds glas skål, til vask. Bland ved at pipettere opløsningen op og ned. Inkuber i 5-10 minutter på is. Dette vasketrin skal gentages mindst to gange.
4. Sekundær fiksering
   1. Ved sekundær fiksering overføres øjen-hjerne-komplekserne til mindst 200 μL fikseringsmiddel og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur eller 35 min ved 4 °C.
      BEMÆRK: Sekundær fiksering stivner øjenvævet, som hjælper montering (trin 3.5).
   2. Brug en P20 eller P100 luftforskydning micropipette og PBT-smurt spids til at overføre eye-brain komplekser i ~ 400 μL PBT i en 9-brønds glas skål, på is, til at vaske i 5 min.
   3. Gentag vasketrinnet mindst én gang.
   4. Brug en P20 eller P100 luftforskydning micropipette og PBT-smurt spids til at overføre eye-brain komplekser i ~ 400 μL PBS i en 9-brønds glas skål, på is, til at skylle i 1-2 min. Hold vævet i bevægelse ved pipetter PBS, men ikke vævet, op og ned for at forhindre øjen-hjerne komplekser i at bosætte sig og overholde glasset parabol under PBS-skylning.
5. Montering
   1. Overfør øjen-hjerne-komplekserne til ~200 μL monteringsmedier. Brug en P20 eller P100 luftforskydning micropipette og PBT-smurt spids til at overføre eye-hjerne komplekser. Lad vævet ekvilibrere i monteringsmedier i 1-2 timer.
   2. Placer en 5-8 μL dråbe frisk monteringsmedie på et rent mikroskop dias.
   3. Skær en P10 spids med et rent barberblad for at øge spidsåbningen til ~ 0,5 mm i radius og brug denne og en P10 luftforskydning mikropipette til at overføre eye-brain komplekser i 5-8 μL montering medier i dråbe montering medier på diaset.
   4. Brug to wolframnåle til at adskille øjnene fra optiske lobes. Fastgør et øjenhjernekompleks til rutsjebanen med en robust wolframnål og skær hvert øje væk fra den tilhørende optiske lap med en fin wolframnål(Figur 2F).
   5. Brug den fine wolfram nål til at manøvrere hvert øje til overfladen af mikroskopet dias med den basale overflade af hvert øje støder op til diaset. Sænk forsigtigt et rent dæksedlen over vævet og fastgør med neglelak.
      BEMÆRK: At arrangere øjnene på diaset, så de er tæt på hinanden eller i en linje, vil lette efterfølgende mikroskopi.
   6. Billede nethinden ved hjælp af fluorescerende eller konfokal mikroskopi.
      BEMÆRK: Lysbilleder skal opbevares ved 4 °C, hvis de ikke afbildes med det samme.

Representative Results

Figur 1: Udvælgelse og kultur af pupper til dissektion. (A) Wandering tredje larve instar (L3) larver og pupper finde langs siderne af sunde Drosophila kulturer. (B) Præ-pupper kan identificeres ved deres gennemskinnelige hvide farve som pigment er endnu ikke genereret i den beskyttende pupal tilfælde. Anterior-posterior og dorsal-ventral akse af puppen er vist i blåt. En fugtig bambusskinne bruges til at løsne og plukke pre-pupper fra hætteglasvæggene. (C) Pupperne anbringes i 1,5 mL mikrocentrifugerør, der er mærket korrekt (genotype, indsamlingsdato og indsamlingstidspunkt) og (D) dyrket i et befugtet kammer, der er samlet fra en tom pipettespidskasse. Fugtigheden opretholdes ved at placere et stykke fugtigt væv inde i kassen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Dissekering af pupaløjet. (A) Pupper klæbes til dobbeltsidet tape på en sort dissekeringsskål. Forreste, bageste og dorsale koordinater er angivet med blåt. (B) For at isolere øjen-hjerne komplekser (en enkelt er vist her), (C) puppen er først fjernet fra sin pupal sag. Vigtige trin i denne proces vises. Røde linjer angiver, hvor pupalkassen skal rives og åbnes, når operculumet er fjernet. Pupperne fjernes derefter fra det revne pupal-tilfælde med pincet. (D) En eksponeret puppe skæres først langs brystkassen med mikrodissection saks (position angivet med stiplet rød linje) og hovedet epitel derefter forsigtigt revet åben (røde pile), som vist i (E) for at afsløre uigennemsigtige øje-hjerne kompleks. (F) Efter inkubation med passende antistoffer skæres nethinder fra øjen-hjerne-komplekser. Vigtige trin i denne proces vises. Øje-hjernen er stabiliseret med en robust wolfram nål (venstre) og nethinder fjernet med en fin wolfram nål (højre). Til protein- og RNA-analyser kan ikke-fastgjorte nethinder skæres rent af optiske lobes ved hjælp af et fint barberblad eller mikrodissection saks, snarere end en fin wolfram nål. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bamboo splints, 6"	Ted Pella Inc	116
Black dissecting dish			Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder	Fine Science Tools	10053
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Double-sided tape	3M	665
Drosophila& food media, nutrient-rich			7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila& food media, standard			Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Fixative solution			4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Glass 9-well dishes	Corning	7220-85	Also known as 9-well dishes
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Scientific	12-550-413
Glass petri dish	Corning	3160-100BO
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microcentrigure tubes	Axygen	MCT-175-C
Microdissection scissors	Fine Science Tools	15000-03
Microwell trays (72 x 10 µL wells)	Nunc	438733
Mounting media			0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate	Sigma-Aldrich	P3130
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Sigma-Aldrich	P5368	Prepare according to manufacturer's instructions
PBT			0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH	Imgenex	IMG-3073	For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1	Cell signaling	9578S	For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCAD2	For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
Scalpel blades	Fine Science Tools	10050	Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-545-153	For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-144	For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Cell Signaling Technology	7077	For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	305-035-003	For Western blotting. Used at 1:3000
Stereo dissecting microscope (M60 or M80)	Leica Microsystems		or similar microscope
Sylgard (black)	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (transparent)	Dow Corning	SYLG184	Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes	KIMTECH	34120
TritonX	Sigma-Aldrich	T8787
Tungsten needle, fine	Fine Science Tools	10130-10	Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy	Fine Science Tools	10130-20	Insert into pin holder
Yeast paste	(local supermarket)		Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O