C. 埃莱甘斯 化疗分析：在蠕虫中测试化学感官的方法

Overview

此视频介绍了线虫 C. elegans 中的化疗，并显示了对硫酸铜的化学厌恶测试示例协议。

Protocol

以下协议摘自坎贝尔 等人， 一个 卡诺哈布迪蒂斯埃莱甘斯 营养状态为基础的铜厌恶分析 ，J.Vis.Exp.（2017 年）。

1. 实验生物的制备
   1. 在开始检测之前，每株24小时挑选10个L4分期线虫，以确保生物体在测试时是年轻人。对于测试的每个突变体或控制线虫，选择 10 L4s（10 用于控制，10 用于检测）。
      1. 使用标准方法维护L4生物体，在标准阿加板块上使用24小时，这些阿加板由OP50大肠杆菌播种。如果生物体在随后的洗涤步骤中丢失，则通过增加启动样本大小（即选择 20 个蠕虫而不是 10 个蠕虫）进行补偿。
         注： 行为是一种与生俱来的可变表型。在三天内对每种菌株执行三分法。包括新的菌株的其他控制菌株和条件，如讨论部分所强调的。
   2. 在检测之前，将实验生物转移到没有细菌的阿加板块，并允许线虫自由移动1分钟，以去除多余的细菌。
      1. 如果实验生物在检测前的 24 小时内遇到污染情况，则丢弃它们。
   3. 将 1 mL 的 M9 放入无菌板上，将蠕虫洗成微中性管。
   4. 离心机在 3，000 x g 1 分钟。蠕虫应在管子底部形成颗粒。吸气M9溶液，而不会破坏蠕虫颗粒。将 1 mL 的 M9 添加到蠕虫颗粒中，倒管将蠕虫与溶液混合。
   5. 再重复步骤 1.4 三次。
      1. 如果多余的细菌最初与蠕虫一起转移，则重复共5次。任何细菌都不应转移到铜制食品比赛板上。如果食物被转移到检测板，它会干扰准确的数据收集。
   6. 最后洗涤后，吸气超自然，直到100μL的M9和蠕虫颗粒仍然存在。
      注意：30分钟后饥饿相关行为变得明显。因此，一旦洗涤步骤完成，应立即从溶液中转移蠕虫。
2. 分析板的准备
   1. 在检测前两天准备标准的NGM agar板。
      1. 如果板材保存在潮湿的环境中，在检测前 3 天制作 agar 板。或者，将板盖取出 3 - 6 小时，以确保适当的干燥（如果在无菌环境中）。
   2. 用一个厚厚的永久标记，沿着外缘在板的底面做一条线，另一条线形成中线屏障（图1）。中间线屏障应与板的每个边缘等距。使用标尺确保精确测量。这些线将作为转移细菌和铜溶液时的指南。只要大肠杆菌在铜溶液之前被转移，这些线将作为指标。
   3. 种子板与50μL的OP50大肠杆菌在铜屏障的一侧，以创建一个统一的草坪（图2）。细菌浓度应在整个检测中保持一致;然而，由于浓度的轻微差异，观察到的变异性很少。
      1. 使用板下方的标记线条，确保细菌不会与铜溶液接触。只要铜溶液线的板的边缘，并形成一个中线屏障，转移细菌，使铜溶液不会接触到食物来源。
   4. 标记第二组板，并转移没有OP50大肠杆菌给他们（图2）。这些板将用来评估负控制。这些板在板的一半上还应有标记，以表示初始转移原点。
   5. 允许细菌干燥，然后在37°C的夜间孵化板。确保在转移到 37 °C 孵化器或房间时不会干扰细菌斑块。过度干扰可能会改变食物斑块的位置或形状。
3. 切莫塔克斯分析
   1. 在检测开始时间之前，请重新准备 0.5 M 铜 （II） 硫酸盐溶液。如果每个板使用 125 μL 的溶液，则根据使用的检测板数量（例如5 个检测板，625 μL）放大此音量。
   2. 铜 （II） 硫酸盐溶液的 Pipette 100 μL 在 agar 边缘创建外部铜屏障。板的标记下侧应作为指南。
   3. 管道 25 μL 的铜 （II） 硫酸盐溶液，以创建中线屏障。
      1. 确保硫酸铜溶液不会与细菌斑块接触。使用斑点技术，条纹可能会影响运动，由于缩痕/划痕在阿加。
   4. 让铜溶液干燥到板上。时间段可能因板和实验室条件而异。转移后每 5 分钟可直观地检查一次干燥程度。
      注： 铜溶液具有蓝色色调，易于识别。使用实验室组织在板的边缘附近轻轻涂抹溶液，以辨别干燥。
   5. 从管子底部到检测板的无菌半部分的蠕虫颗粒的 Pipette 20 μL。
      1. 确保将 10 个蠕虫转移到检测板中。如果意外地包括额外的蠕虫，用卤素油采摘来去除它们，以确保没有细菌添加到盘子中。每次测定在检测过程中应有一致数量的线虫。
         注： 如果在检测过程中转移的蠕虫太少，增加初始样本量将减少洗涤和转移过程中的潜在损失。
   6. 用实验室组织从盘子中取出多余的M9。M9 不应与硫酸铜解决方案接触。
      注意：确保蠕虫和阿加表面在执行此步骤时不受影响。如果使用过于严厉，实验室组织可能会对板的 agar 表面产生凹痕，并可以去除蠕虫。应丢弃通过KimWipe 意外删除的蠕虫。
   7. 一旦M9溶液被移除，所有蠕虫都开始非液体嗜血模式，开始检测秒表。
      1. 最好在一分钟内删除 M9 解决方案。基本参数是识别鼻窦运动。蠕虫在液体中以不同的方式运动，例如在液体中鞭打而不是鼻窦。一旦每个实验生物停止猛击，开始检测停止观察。
   8. 每 30 分钟检查一次检测板。
      1. 对于带有细菌斑块的检测板，如果生物在 4 小时内到达食物补丁，则对生物体进行正评分。对于负控制板，如果生物已经越过屏障，则对它们进行正面评分。

Representative Results

图1：指示铜溶液放置在5厘米培养皿下侧的标记的视觉表示。这些指示用于确保板的各部分经过适当测量，并在将细菌贴片和铜溶液转移到 agar 表面时作为指南。

图2：5厘米的Petry Dish分为两个部分，用于食品检测板的开和关，细菌草坪在食物盘的其中一个部分的中心形成。食物贴片不应与测试化合物接触，测试化合物将盘子的边缘排成一行，形成中线屏障。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M