سي إليغانز Chemotaxis المقايسة : طريقة لاختبار العلاج الكيميائي في الديدان

Overview

يقدم هذا الفيديو chemotaxis في النيماتودا C. elegans ويظهر بروتوكول عينة اختبار النفور الكيميائي إلى كبريتات النحاس.

Protocol

البروتوكول التالي هو مقتطف من كامبل وآخرون، A Caenorhabditis elegans الحالة الغذائية القائم على النحاس النفور المقايسة، J. Vis. Exp. (2017).

1. إعداد الكائنات الحية التجريبية
   1. اختيار 10 L4 الديدان الخيطية على مراحل لكل سلالة 24 ساعة قبل البدء في الفحص لضمان أن الكائنات الحية هي الشباب البالغين عند اختبارها. لكل الديدان الخيطية متحولة أو السيطرة اختبارها، واختيار 10 L4s (10 للسيطرة و 10 للمقايسة).
      1. الحفاظ على الكائنات الحية L4 باستخدام أساليب قياسية لمدة 24 ساعة على لوحات أجار القياسية المصنفة مع OP50 إشريكيا القولونية. إذا فقدت الكائنات الحية خلال خطوات الغسيل اللاحقة، تعوض عن طريق زيادة حجم العينة الأولية(أي اختيار 20 دودة بدلا من 10).
         ملاحظة: السلوك هو النمط الظاهري متغير فطريا. تنفيذ الأسلوب في ثلاثية لكل سلالة على ثلاثة أيام منفصلة. تضمين سلالات تحكم إضافية وظروف للسلالات الجديدة، كما هو موضح في قسم المناقشة.
   2. قبل الفحص مباشرة، نقل الكائنات الحية التجريبية إلى لوحة أجار مع عدم وجود البكتيريا والسماح الديدان الخيطية للتحرك بحرية لمدة 1 دقيقة لإزالة البكتيريا الزائدة.
      1. إذا عانت الكائنات الحية التجريبية من حالات تلوث خلال 24 ساعة قبل الفحص ، فتخلص منها.
   3. ماصة 1 مل من M9 على لوحة خالية من البكتيريا لغسل الديدان في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
   4. جهاز طرد مركزي عند 3000 x g لمدة دقيقة واحدة. يجب أن تشكل الديدان بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. أسبيرات M9 الحل دون تعطيل بيليه دودة. إضافة 1 مل من M9 إلى بيليه دودة، أنبوب عكس لخلط الديدان مع الحل.
   5. كرر الخطوات 1.4 ثلاث مرات أخرى.
      1. إذا تم نقل البكتيريا الزائدة في البداية مع الديدان ، كرر ما مجموعه 5 مرات. لا ينبغي نقل البكتيريا إلى لوحات سباق الغذاء النحاس. إذا تم نقل الطعام إلى لوحة المقايسة، فإنه سيتداخل مع جمع البيانات الدقيقة.
   6. بعد الغسيل النهائي ، يستنشق فائقا حتى 100 ميكرولتر من M9 وتظل بيليه الدودة.
      تحذير: السلوكيات المتعلقة بالمجاعة تصبح واضحة بعد 30 دقيقة. وبالتالي يجب نقل الديدان على الفور من المحلول بمجرد الانتهاء من خطوات الغسيل.
2. إعداد لوحات المقايسة
   1. إعداد لوحات أجار NGM القياسية قبل يومين من الفحص.
      1. إذا تم الاحتفاظ لوحات في بيئة رطبة، وجعل لوحات أجار 3 أيام قبل الفحص. بدلا من ذلك، قم بإزالة غطاء اللوحة لمدة 3 -6 ساعات لضمان جفاف مناسب (إذا كان في بيئة معقمة).
   2. مع علامة دائمة سميكة، وجعل خط على الجانب السفلي من لوحة على طول الحافة الخارجية وآخر لتشكيل حاجز منتصف الخط(الشكل 1). يجب أن يكون حاجز منتصف الخط متساوي البعد عن كل حافة من اللوحة. استخدم مسطرة لضمان قياسات دقيقة. وستكون هذه الخطوط بمثابة دليل عند نقل البكتيريا ومحلول النحاس. شريطة أن يتم نقل الإشريكية القولونية قبل محلول النحاس ، فإن هذه الخطوط ستكون بمثابة مؤشرات.
   3. لوحة البذور مع 50 ميكرولتر من OP50 E. القولونية على جانب واحد فقط من حاجز النحاس لإنشاء حديقة موحدة (الشكل 2). وينبغي أن يظل التركيز البكتيري متسقا عبر المقايسات؛ ومع ذلك، لوحظ القليل من التباين استجابة للاختلافات الطفيفة في التركيز.
      1. استخدم الخطوط المميزة على الجانب السفلي من اللوحة لضمان عدم احتكاك البكتيريا بمحلول النحاس. شريطة أن خطوط الحل النحاس حافة لوحة ويشكل حاجز منتصف الخط، ونقل البكتيريا بحيث الحل النحاس لن تتلامس مع مصدر الغذاء.
   4. وضع علامة على مجموعة ثانية من لوحات ونقل أي OP50 E. القولونية لهم (الشكل 2). هذه اللوحات سوف تعمل على تقييم السيطرة السلبية. يجب أن تحتوي هذه اللوحات أيضا على علامة على نصف اللوحة للدلالة على أصل النقل الأولي.
   5. السماح للبكتيريا لتجف ثم احتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تأكد من عدم إزعاج البقع البكتيرية عند نقلها إلى حاضنة أو غرفة 37 درجة مئوية. يمكن أن يغير الاضطراب المفرط موقع أو شكل رقعة الطعام.
3. فحص تشيموتاكسيس
   1. إعداد محلول كبريتات نحاسي (II) 0.5 متر طازجا قبل وقت بدء الفحص. شريطة أن يتم استخدام 125 ميكرولتر من المحلول لكل لوحة ، ارتقاء هذا الحجم اعتمادا على عدد لوحات المقايسة المستخدمة(على سبيل المثال 5 لوحات المقايسة ، 625 ميكرولتر).
   2. ماصة 100 ميكرولتر من النحاس (II) محلول كبريتات على حافة أجار لإنشاء حاجز النحاس الخارجي. وينبغي أن الجانب السفلي ملحوظ من لوحة بمثابة دليل.
   3. ماصة 25 ميكرولتر من النحاس (II) محلول كبريتات لإنشاء حاجز خط الوسط.
      1. تأكد من أن النحاس (II) محلول كبريتات لا تلامس مع التصحيح البكتيري. استخدام تقنية رصدت كما streaking قد تؤثر على الحركة بسبب المسافات البادئة / الخدوش على أجار.
   4. السماح للمحلول النحاس لتجف على لوحة. يمكن أن تختلف الفترة الزمنية وفقا لظروف اللوحة والمختبر. تحقق بصريا من الجفاف كل 5 دقائق بعد النقل.
      ملاحظة: يعرض محلول النحاس لونا أزرق ويمكن التعرف عليه بسهولة. استخدام الأنسجة المختبرية لداب طفيفة الحل بالقرب من حافة لوحة لتمييز الجفاف.
   5. ماصة 20 ميكرولتر من بيليه دودة من الجزء السفلي من الأنبوب على نصف خالية من البكتيريا من لوحة المقايسة.
      1. تأكد من نقل 10 ديدان إلى لوحة الفحص. إذا تم تضمين ديدان إضافية عن طريق الخطأ ، قم بإزالتها عن طريق الانتقاء بزيت الهالوكربون لضمان عدم إضافة أي بكتيريا إلى اللوحة. يجب أن يكون لكل مقايسة عدد ثابت من الديدان الخيطية أثناء الفحص.
         ملاحظة: إذا تم نقل عدد قليل جدا من الديدان أثناء عمليات الفحص، فإن زيادة حجم العينة الأولية سوف تخفف من الخسائر المحتملة أثناء عمليات الغسيل والنقل.
   6. إزالة M9 الزائدة من لوحة مع الأنسجة المختبرية. M9 لا ينبغي أن تتلامس مع النحاس (الثاني) محلول كبريتات.
      تنبيه: تأكد من أن الديدان وسطح أجار لا تتأثر أثناء تنفيذ هذه الخطوة. إذا استخدمت بقسوة شديدة، يمكن للأنسجة المختبرية إنشاء المسافات البادئة إلى سطح أجار من لوحة ويمكن إزالة الديدان. يجب التخلص من الديدان التي تمت إزالتها عن طريق الخطأ عبر KimWipe.
   7. بمجرد إزالة محلول M9 وبدء جميع الديدان في أنماط الحركة غير السائلة ، ابدأ ساعة توقيت الفحص.
      1. على النحو الأمثل، قم بإزالة محلول M9 في غضون دقيقة واحدة. المعلمة الأساسية هي تحديد الحركة الجيوب الأنفية. الديدان locomote بشكل مختلف، على سبيل المثال سحق بدلا من الجيوب الأنفية، عندما تكون في السائل. بدء مراقبة وقف المقايسة مرة واحدة كل من الكائنات الحية التجريبية توقف سحق.
   8. تحقق من لوحات المقايسة كل 30 دقيقة.
      1. للحصول على لوحات المقايسة مع بقع بكتيرية ، يسجل بشكل إيجابي الكائنات الحية إذا وصلت إلى التصحيح الغذائي على مدى فترة 4 ساعة. لوحات التحكم السلبية، يسجل إيجابيا الكائنات الحية إذا كانت قد عبرت الحاجز.

Representative Results

الشكل 1: تمثيل مرئي للعلامات للإشارة إلى وضع محلول النحاس على الجانب السفلي من طبق بيتري 5 سم. وتستخدم هذه المؤشرات لضمان أن أجزاء من لوحة قد تم قياسها بشكل مناسب وبمثابة المبدأ التوجيهي عند نقل التصحيح البكتيري ومن ثم محلول النحاس على سطح أجار.

الشكل 2: ينقسم طبق بيتري الذي يبلغ 5 سم إلى قسمين للوحة المقايسة الغذائية وخارجها، ويتم تشكيل حديقة بكتيرية في وسط أحد هذه الأقسام للطبق الموجود على الطعام. يجب أن لا تتلامس رقعة الطعام مع مركب الاختبار الذي يبطن حواف الطبق ويشكل حاجزا وسطا.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M