C.エレガンス 化学式アッセイ:ワームの化学感覚をテストする方法

Overview

このビデオでは、線虫 C.エレガンス の化学運動軸を紹介し、硫酸銅に対する化学戦術嫌悪をテストするサンプルプロトコルを示しています。

Protocol

以下のプロトコルは、キャンベルら、カエノハブディティス・エレガンス栄養状態ベースの銅嫌悪アッセイ、J.Vis.Exp.(2017)からの抜粋です。

1. 実験生物の調製
   1. 試験時に生物が若年成人であることを確認するためにアッセイを立ち上げる前に、24時間ごとに10 L4ステージング線虫を選ぶ。試験した各変異体または対照線虫について、10 L4s(制御用10、アッセイ用10)を選ぶ。
      1. OP50大腸菌を播種した標準的な寒天プレート上の24時間の標準的な方法を使用してL4生物を維持する。次の洗浄工程で生物が失われた場合は、開始サンプルサイズを大きくして補います(すなわち、10ではなく20のワームを選びます)。
         注: 動作は自然に可変的な表現型です。3 つの別々の日に各株の三重でメソッドを実行します。ディスカッションセクションで強調されているように、新しい株のための追加の制御株と条件を含めます。
   2. アッセイの直前に、実験生物を細菌のない寒天プレートに移し、線虫が1分間自由に動いて余分な細菌を除去できるようにします。
      1. 実験生物がアッセイ前の24時間の間に汚染条件を経験した場合は、それらを廃棄する。
   3. M9のピペット1 mLを細菌を含まないプレートに入れ、ワームをマイクロ遠心チューブに洗浄します。
   4. 遠心分離機 3,000 x g で 1 分間ワームは、チューブの下部にペレットを形成する必要があります。ワームペレットを破壊することなく、吸気M9溶液。M9のM9を1mL加え、チューブを反転してワームと溶液を混ぜる。
   5. 手順 1.4 をさらに 3 回繰り返します。
      1. 過剰な細菌が最初にワームと一緒に移された場合は、合計5回繰り返します。銅食品のレースプレートに細菌を移す必要はありません。食品がアッセイプレートに移された場合、正確なデータ収集を妨げてしまいます。
   6. 最終洗浄後、M9の100 μLまで吸気上清が残ります。
      注意: 飢餓関連の行動は30分後に明らかになります。したがって、洗浄手順が完了したら、ワームは溶液から直ちに移送する必要があります。
2. アッセイプレートの準備
   1. アッセイの2日前に標準のNGM寒天プレートを用意します。
      1. プレートを湿気のある環境に保つ場合は、アッセイの3日前に寒天プレートを作ります。あるいは、プレートの蓋を3〜6時間取り外し、適切な乾燥を確保する(もし無菌環境の場合)。
   2. 厚い永久マーカーを使用して、プレートの下側に外側のエッジに沿って線を作り、もう1本の線を作って中間線バリアを形成します(図1)。中間境界は、プレートの各エッジから等距離にする必要があります。定規を使用して、正確な測定を行います。これらのラインは、細菌と銅溶液を転送するときのガイドとして機能します。銅溶液の前に大腸菌が転送される場合、これらの線は指標として機能します。
   3. 銅バリアの片側に50μLのOP50大腸菌を持つ種子プレートで、均一な芝生を作ります(図2)。細菌濃度はアッセイ全体で一貫して維持する必要があります。しかし、濃度の穏やかな違いに応じて、ほとんど変動が観察されていません。
      1. プレートの下側にあるマークされた線を使用して、細菌が銅溶液に接触しないようにします。銅溶液がプレートの縁を接し、中間線バリアを形成する場合は、銅溶液が食料源に接触しないように細菌を移す。
   4. 2番目のプレートセットをマークし、OP50大腸菌をそれらに移さない(図2)。これらのプレートは、負のコントロールを評価するのに役立ちます。これらのプレートには、初期転写起点を示すプレートの半分にマーキングが必要です。
   5. 細菌を乾燥させ、一晩37°Cでプレートをインキュベートします。37°Cインキュベーターまたは部屋に移す際に、細菌のパッチが乱れないようにしてください。過度の乱れは、食品パッチの位置または形状を変更する可能性があります。
3. 化学療法アッセイ
   1. アッセイ開始時刻の前に0.5 Mの銅(II)硫酸塩溶液を作製してください。1プレートあたり125μLの溶液を使用する場合は、使用するアッセイプレートの数に応じてこの体積をスケールアップします(例えば5アッセイプレート、625 μL)。
   2. 寒天の端に銅(II)硫酸溶液のピペット100μLは、外側の銅バリアを作成する。プレートのマークされた下側は、ガイドとして機能する必要があります。
   3. ピペット25μLの銅(II)硫酸溶液は、正中バリアを作成する。
      1. 銅(II)硫酸塩溶液が細菌パッチに接触していないことを確認してください。ストリーキングは寒天のインデント/傷による移動に影響を与える可能性があるため、斑点のあるテクニックを使用します。
   4. 銅溶液をプレート上で乾燥させます。期間は、プレートとラボの条件によって異なる場合があります。転写後5分ごとに乾燥度を目視で確認します。
      注: 銅の解決は青がかった色を表示し、容易に識別可能である。実験室の組織を使用して、プレートの端付近の溶液を軽くダブして乾燥を見分けます。
   5. 管の底部から細菌を含まないアッセイプレートの半分にワームペレットのピペット20μL。
      1. 10個のワームがアッセイプレートに移されることを確認します。余分なワームが誤って含まれていた場合は、細菌がプレートに追加されないようにハロカーボンオイルで摘み取ることによってそれらを取り除きます。各アッセイは、アッセイ中に一貫した数の線虫を有するべきである。
         注: アッセイ中に転送されるワームが少なすぎると、初期サンプルサイズを大きくすると、ワッシュや転送中の潜在的な損失が軽減されます。
   6. 実験室のティッシュとプレートから余分なM9を取除く。M9は、銅(II)硫酸溶液と接触してはならない。
      注意: この手順を実行する際、ワームと寒天表面が影響を受けないようにしてください。あまりにも厳しく使用すると、実験室組織はプレートの寒天表面へのインデントを作成することができ、ワームを除去することができます。誤って KimWipe経由で削除されたワームは廃棄する必要があります。
   7. M9溶液が除去され、すべてのワームが非液体の運動パターンを開始したら、アッセイストップウォッチを開始します。
      1. 最適に、M9溶液を最小で取り除きます。必須パラメータは、副次的移動の識別です。ワームロコモテは、液体中の正弦波ではなくスラッシングなど、異なる方法でロコモテをする。実験生物のそれぞれがスラッシングを停止したら、アッセイストップウォッチを開始します。
   8. 30分ごとにアッセイプレートをチェックしてください。
      1. 細菌パッチを含むアッセイプレートの場合、4時間にわたって食品パッチに達した場合、生物に積極的にスコアを付けます。ネガティブコントロールプレートの場合、バリアを越えた場合は積極的に採点します。

Representative Results

図1:5cmペトリ皿の下側に銅溶液の配置を示すマーキングの視覚的表現。これらの適応症は、プレートのセクションが適切に測定されていることを確認するために使用され、寒天表面に細菌パッチと銅溶液を転送する際のガイドラインとして機能します。

図2:5cmのペトリ皿は食品アッセイプレートのオンとオフのための2つのセクションに分かれており、細菌の芝生は、オンフードプレートのためのこれらのセクションの中央に形成されています。食品パッチは、プレートの端を並べて正接バリアを形成する試験化合物に接触してはならない。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M