Summary
Para el estudio de
Abstract
Un enjambre de la δ-proteobacteria xanthus Myxococcus contiene millones de células que actúan como un movimiento colectivo, coordinando a través de una serie de señales para crear patrones complejos, dinámicos, como respuesta a señales ambientales. Estos patrones son de auto-organización y emergentes, ya que no se puede predecir mediante la observación del comportamiento de las células individuales. Mediante un ensayo de microcinematography lapso de tiempo de seguimiento, se identificaron un patrón distinto emergente en M. xanthus llamado quimiotaxis, que se define como el movimiento dirigido de un enjambre de hasta un gradiente de nutrientes hacia su fuente 1.
A fin de caracterizar de manera eficiente a través de la quimiotaxis microcinematography lapso de tiempo, hemos desarrollado un complejo altamente modificable placa (Figura 1) y construyó un grupo de 8 microscopios (Figura 2), cada uno capaz de capturar vídeos con lapso de tiempo. El ensayo es lo suficientemente riguroso como para permitir la replicación constante de datos cuantificables, y los videos resultantes nos permiten observar y rastrear cambios sutiles en el comportamiento de enjambre. Una vez capturados, los videos son trasladados a un equipo de análisis / almacenamiento con memoria suficiente para procesar y almacenar miles de videos. La flexibilidad de esta instalación ha demostrado ser útil para varios miembros de la M. xanthus comunidad.
Protocol
Material necesario:
- Klett metros
- Pipeta y puntas
- 2,5 ml tubos de microcentrífuga
- Microcentrífuga
- CTTYE los medios de comunicación:
- 1,0% casitona (Difco Laboratories), el 0,5% de extracto de levadura (Difco Laboratories),
- 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4
- TPM medios de comunicación:
- 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4
- Agarosa
- Baño de agua a 55 ° C
- Portaobjetos de vidrio
- Cubreobjetos de vidrio de gran
- 2 x 2 cm, 0,5 mm de espesor de caucho de silicona junta (Grace Bio-Lab Inc.)
- Parafilm (o cinta de etiquetado)
- Fórceps
- Pequeños clips de encuadernación
- Micro-pipeta de muestreo (Fisher)
- 100 l punta de vidrio desechable (Fisher)
- Kimwipes
Parte 1: Preparación de la célula
Comience por crear un ambiente estéril.
- Limpie espacio de trabajo, guantes de Don, y encender la hornilla.
- Iniciar un cultivo de una noche de las células mediante la inoculación en un matraz que contenía caldo CTTYE y se incubaron en la oscuridad a 32 ° C con agitación vigorosa.
- Una vez que el cultivo alcanzó una densidad de 5 x 10 8 células / ml, pipeta de 1 ml de células en un tubo de microcentrífuga de 2,5 ml.
- Pellet células por centrifugación durante 2 min a 16.000 xg (o velocidad máxima).
- Se decanta y se desecha el sobrenadante.
- Lavar el sedimento celular con 1 ml TPM (sal balanceada en nutrientes, sin los medios de comunicación).
- una nueva suspensión y agitar
- Re-pellet células girando durante 2 min a 16.000 xg (o velocidad máxima).
- Se decanta y se desecha el sobrenadante.
Paso crítico - Completamente re-suspender el precipitado en 100 medios de comunicación TPM l utilizando una combinación de pipeteo y agitación.
IMPORTANTE: Este paso asegura que no hay grupos de células en el tubo de la izquierda. Esto puede tomar un tiempo. - Establecer las células a un lado a temperatura ambiente mientras se prepara las placas de ensayo de seguimiento.
Parte 2: Preparación de Agar
- Prepare 50 ml de ambos TPM (ensayo de los medios de comunicación) y CTTYE (disco nutritivo) los medios de comunicación.
- Añadir 0,5 g de agarosa a cada uno (de agarosa es menor de difracción de agar).
- Autoclave para esterilizar.
- Después de la esterilización, mantener los medios de comunicación a 55 ° C en una incubadora (o baño de agua), mientras que la construcción de los complejos análisis de seguimiento de la placa.
Parte 3: Construcción de disco nutritivo
- Coloque una junta de silicona estéril de goma de 0,5 mm de espesor en la parte superior de una llama-esterilizados portaobjetos de vidrio, formando un pequeño pozo.
- Pipeta ~ 300 l de los 55 ° C CTTYE media / agarosa en el pozo creado por la junta en la diapositiva que contiene el disco y nutritivo. Los medios de comunicación CTTYE / agarosa debe montículo.
- Coloque una diapositiva llama esterilizada (sin juntas) en la parte superior de los medios de comunicación CTTYE / agarosa.
IMPORTANTE: Esta diapositiva se debe establecer en un ángulo para evitar que se formen burbujas. - Una vez que la tapa está en su lugar, la abrazadera del complejo, junto con clips de la carpeta mini - una a cada lado.
- Lugar del complejo recortado a 4 ° C y permitir que los medios CTTYE / agarosa al conjunto. Esto generalmente toma alrededor de 5 min.
Parte 4: Preparación de seguimiento del ensayo - Configurar Complejos Plate
Ensamblar los componentes, preparar los complejos de diapositivas, coloque el disco nutritivo, vierta los medios de comunicación TPM / agarosa, complejos placa separada y seco, las células de la placa, y montamos el seguimiento de los complejos de ensayo de placa.
Ensamblar los componentes de la placa de complejo
- Para cada complejo, llama esterilizados un portaobjetos de vidrio
- Coloque una junta de autoclave en la parte superior de la diapositiva y dejar de lado (esterilizada hacia arriba). Esta será la parte inferior de la prueba.
- Llama esterilizar una cubierta de vidrio antideslizante y colocarlo en la parte superior de una placa de vidrio segundo microscopio envueltos con cinta de etiquetado (o Parafilm) y dejar de lado (esterilizada hacia arriba). Esto se utiliza como una diapositiva de apoyo para mantener el cubreobjetos de las grietas. Esta será la parte superior de la prueba.
- Llama esterilizar a un portaobjetos de vidrio microscopio tercero y dejar de lado (esterilizada hacia arriba). Esto será utilizado para aplanar la agarosa.
IMPORTANTE: Asegúrese de que las juntas forman un sello con el vidrio presionando hacia abajo con las pinzas, de lo contrario los medios de comunicación / agarosa podría secarse.
P encaje disco nutritivo
IMPORTANTE: Los pasos del 5 al 10 se debe hacer a lo complejo de diapositivas de una en una, de lo contrario los medios de comunicación / agarosa podría comenzar a solidificarse como resultado una calidad de cine pobre.
- Retire el disco de forma complejo nutritivo 4 ° C (paso 5 de la parte 3) y separarlas de las diapositivas de la exposición de ahora solidificado CTTYE / agarosa.
- Eliminar un 'disco nutritivo "1 mm de diámetro de los medios de comunicación CTTYE / agarosa y se ha descrito anteriormente con una pipeta de muestreo de micro-con una punta de vidrio de 100 l desechable y colóquela en el pozo creado por la junta en la hoja de la cubierta (paso 3) .
En placas
Paso crítico
- Pipeta ~ 300 l de los 55 ° C TPM media / agarosa en el pozo creado por la junta en la hoja de la cubierta y que contiene el disco nutritivo. Los medios de comunicación TPM / agarosa debe montículo.
Paso crítico - Colocar la placa de la llama esterilizadas sin junta (del paso 3) en la parte superior de los medios de TPM / agarosa.
IMPORTANTE: Esta diapositiva se debe establecer en un ángulo para evitar que se formen burbujas. - Una vez que el carro (desde el paso 5) está en su lugar, la abrazadera del complejo, junto con clips de la carpeta mini - una a cada lado.
- Lugar del complejo recortado a 4 ° C y permitir que los medios / de agarosa al conjunto. Esto generalmente toma alrededor de 5 min.
Platos separados y seco
IMPORTANTE: Para evitar que los medios de comunicación / agarosa de la desecación, los pasos 11 a 20 sólo se debe realizar en un complejo de diapositivas a la vez.
IMPORTANTE: Para obtener mejores resultados, los pasos 11 a 13 se realizaron a 4 ° C.
- Una vez que los medios de comunicación / agarosa, quite el clips de la carpeta y apretar al final del complejo para aflojar la diapositiva cinta envuelta.
- Elimina la diapositiva cinta envuelta y el lugar en el banco para su uso posterior.
Paso crítico - El uso de pinzas a modo de cuña, separar la hoja de la cubierta / recinto junta / media / agarosa de la diapositiva de apoyo (sin empaque) y descartar el apoyo de diapositivas.
IMPORTANTE: No usar un movimiento de palanca para separar la hoja de la cubierta / recinto de la junta. Esto podría resultar en la ruptura cubreobjetos y / o la adherencia media / agarosa a la diapositiva de apoyo. - Coloque la hoja de la cubierta / recinto junta / media / agarosa en la diapositiva en cinta envuelta (lado junta hacia arriba) y eliminar de 4 ° C. Lugar este próximo complejos a un quemador para permitir que toda la humedad se evapore visible de la nueva exposición media / agarosa superficie - no más de 1 min.
IMPORTANTE: No deje que la seca media / agarosa durante demasiado tiempo ya que esto podría afectar la M. xanthus enjambre comportamiento.
Células de la placa
Paso crítico
- Una vez que el exceso de humedad se haya evaporado, pipeta de 0,5 l de las células concentradas (el paso 8 de la parte 1) en los medios de comunicación / agarosa de aproximadamente 1 mm de distancia desde el disco de nutrientes.
IMPORTANTE: Es muy importante asegurarse de que las células se depositan moviendo la pipeta hacia abajo y luego hacia arriba. Esto asegura que el enjambre será circular.
IMPORTANTE: Es muy importante no tocar la punta de la pipeta para los medios de comunicación / agarosa. Esto hará que una depresión en la superficie y cambiar el comportamiento de la M. xanthus enjambre.
CONSEJO: Presione el punta de la pipeta antes de acercarse a los medios de comunicación / agarosa. Esto permitirá una disminución de las células que aparecen en la parte inferior de la punta de la pipeta y que sea más fácil para depositar las células. - Una vez que las células se depositan, el lugar de la próxima complejo a un segundo plano para permitir que el lugar de células para secar - no más de 20 segundos.
Ensamble ensayo
- Una vez que el lugar de células se ha secado, alinear el conjunto de diapositivas / junta (del paso 1) con la junta en la hoja de la cubierta / junta / media / agarosa / celular compleja (del paso 13) y presione suavemente para formar un sello.
Paso crítico - Limpie las superficies de las diapositivas y hoja de cubierta con un Kimwipe para eliminar los residuos dejados por el Parafilm. El ensayo terminado debe ser similar a la Figura 1.
- Coloque el complejo de diapositivas completa en la etapa de calefacción mantiene a 32 ° C (deslizarse, hoja de cubierta para arriba) inmediatamente después de limpiar (paso 15) para evitar que el la formación de condensación. Si se ha formado condensación, deje reposar de diapositivas complejas en el escenario calentado por varios segundos antes de iniciar el software de adquisición de imágenes.
- Elegir el objetivo adecuado (2X, 4X o 10X).
Parte 5: Preparación de la película
t "> paso crítico- Encienda la cámara y el microscopio, y comprobar los niveles de luz (asegúrese de que la luz no sea demasiado intensa). Arranca el ordenador y abrir el programa de adquisición de imágenes.
- Haga clic en la ventana de la imagen en vivo y enfocar el microscopio. La imagen debe ser similar a la que se ve en la Figura 3. Aviso de la superficie del agar uniforme.
- Comenzar a adquirir las imágenes.
Paso crítico - Comprobar el enfoque con regularidad durante la primera hora, como los medios de comunicación / agar tiende a acumularse causando el foco a la deriva.
- Limpie el área de trabajo.
- Una vez que la adquisición de imágenes, transmite las imágenes adquiridas para el almacenamiento y romper el complejo de diapositivas por inmersión en etanol al 90% durante la noche.
- Juntas de autoclave para su reutilización.
Figura 1. Ilustración de dibujos animados de la compleja placa TM. (A) muestra el complejo básico TM placa de despiece y sección transversal. (B) muestra el uso de grandes juntas.
Figura 2. Cluster microscopio. Cada nodo microscopio (recuadro) consiste en un microscopio Nikon E400, los objetivos, una etapa de calefacción, una cámara de Insight, y un ordenador portátil. Cada nodo está conectado en red entre sí y vinculados a un equipo controlador maestro. Dos de los nodos se configuran con las capacidades de fluorescencia que consisten en la fuente de luz y dos persianas EXFO Uniblitz.
Figura 3. Una imagen de 20X de los aparatos de ensayo de seguimiento en el tiempo = 0. Barra de escala, de 1 mm.
Figura 4. Capacidad de adaptación del complejo de la placa de TM. (A) una imagen de 100X de M. xanthus deslizamiento en la motilidad CTTYE en 1,0% de agar. (B) una imagen de 20x de P. aeruginosa crispar la motilidad. (C) una imagen de 20X S. marcescens enjambre motilidad. Tanto (B) y (C) se analizaron en LB en 1,0% de agar. (D) una imagen de 40x de M. smegmatis deslizamiento en la motilidad de LB en el 0,5% de agar. Esta imagen fue tomada utilizando la configuración de ensayo alternativo se ve en la figura 1B.
Video 1. Un video de lapso de tiempo de un enjambre sometido a la prueba de seguimiento.
Video 2. Un video de lapso de tiempo de una M. xanthus enjambre donde el 1% de las células están marcados con fluorescencia. Alternando imágenes de contraste de fase y fluorescentes fueron capturados y superpuestos para dilucidar la posición de las células fluorescentes en el enjambre. Este video fue grabado en CTTYE en 1,0% de agar.
Video 3. Un video de lapso de tiempo de M. xanthus deslizamiento motilidad. Este video fue grabado en CTTYE en 1,0% de agar.
Video 4. Un video de lapso de tiempo de P. aeruginosa crispar la motilidad. Este video fue grabado en LB en el 1,0% de agar.
Video 5. Un video de lapso de tiempo de S. marcescens enjambre motilidad. Este video fue grabado en LB en el 1,0% de agar.
Video 6. Un video de lapso de tiempo de M. smegmatis deslizamiento motilidad. Este video fue grabado en LB en el 0,5% de agar con la configuración de ensayo alternativo se ve en la figura 1B.
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Discussion
Time-lapse microcinematography (TM) se ha convertido en un método estándar para el estudio de la motilidad procariotas 2-7. Tradicionalmente, la TM se lleva a cabo mediante el uso de mechas de papel de filtro, pastillas de finas agar, o agar losas como sustratos 08.11. Estos métodos son los adecuados y el coste efectivo cuando se usa para generar secuencias de imágenes de las ilustraciones general del movimiento de bacterias. Sin embargo, si las secuencias de imagen debe dar lugar a la generación de datos reproducibles y riguroso cuantitativamente, estos métodos consumen tiempo y son poco fiables. Por ejemplo, las variaciones de estas técnicas causados por error humano podría dar lugar a una amplia gama de errores, de irregularidades en la superficie del agar que podría afectar dramáticamente el comportamiento de las bacterias en estudio a las diferencias en el plano focal de un lado del sustrato de ensayo a la otra. Para resolver estos problemas, hemos diseñado un complejo TM placa que es de una calidad lo suficientemente consistente para obtener resultados reproducibles mediante el empleo de juntas de silicona que son baratos y reutilizables (Fig. 1). Además, el complejo de la placa es muy modificable y se ha demostrado para mantenerse hidratado y suficientemente oxigenada para más de una semana sobre una variedad de tipos y concentraciones de agar.
Para facilitar la generación de películas a intervalos, 8 microscopios Nikon E400 fueron equipados con objetivos 2X, 4X, 10X y cada uno. Además, una cámara de Insight (Diagnostic Instruments, Inc.), y una etapa de calefacción (20/20 Technologies) fue adquirida por cada microscopio. Cada cámara estaba conectada a una computadora portátil en el que había sido la gran imagen SPOT modificables adquisición de software (Diagnostic Instruments, Inc.) instalado. Los diversos componentes se reunieron en nodos, cada uno consistente en un microscopio, tres objetivos, una cámara de Insight, una etapa de calefacción, y un ordenador de control. Cada uno de los ocho nodos fueron conectados en red en un clúster y conectado a una computadora de almacenamiento que se utiliza para recopilar, analizar y almacenar los vídeos con lapso de tiempo generado por el cluster (Fig. 2). El equipo de almacenamiento se ha equipado con un sistema RAID 1 terabyte, que se necesita para almacenar la gran cantidad de datos generados por el cluster.
Una vez terminado, el complejo de la placa se coloca en el escenario con calefacción del microscopio y la prueba de seguimiento se inicia. Las imágenes se adquieren en los intervalos preestablecidos que se determina con base en la tasa de la motilidad de las células. Por ejemplo, cada M. xanthus células se mueven a un ritmo de aproximadamente una longitud de células por minuto. Si las imágenes se adquieren de una M. xanthus pululan en esa misma tasa (una imagen por minuto), el resultado de lapso de tiempo de vídeo aparecerá sin problemas durante la reproducción. Una vez que la adquisición de la imagen es completa, las imágenes se compilan en una matriz secuencial y se reproducen a un ritmo suficiente que parece que se mueven (Video. 1). Este video de lapso de tiempo ahora pueden ser analizados mediante una variedad de paquetes de software.
Las variaciones en el ensayo. El complejo de la placa de TM es muy modificable y se puede utilizar para visualizar muchos microorganismos diferentes en una variedad de condiciones. Enjambre de visualización se puede realizar utilizando microscopía de contraste de fase (que registra el comportamiento del enjambre como una entidad única), microscopía de fluorescencia (que registra el comportamiento de las células individuales de fluorescentes que se han diluido en una población no fluorescente), o una combinación de de ambos (que se superpone alterna secuenciales de contraste de fase y fluorescencia imágenes) (vídeo 2). El complejo de la placa se ha utilizado con éxito para generar vídeos con lapso de tiempo de varios comportamientos procariotas incluyendo M. xanthus deslizamiento motilidad, movilidad Pseudomonas aeruginosa espasmos, marcescens Seratia enjambre motilidad y la novela Mycobacterium smegmatis la motilidad de deslizamiento (Fig. 4 y Videos 3-6).
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Esta investigación fue posible gracias a un premio de la Fundación Nacional de Ciencias de Carrera (MCB-0746066, Caracterización de los activadores transcripcionales que regulan el comportamiento emergente) de RDW
Estamos muy agradecidos a LJ Shimkus, Goldman BS, Suen G., Singer M. Welch LG, Murphy KA, y HG Taylor útil para los debates y comentarios sobre el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0% Casitone | Difco Laboratories | ||
| 0.5% yeast extract | Difco Laboratories | ||
| Micro-sampling pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 μl glass disposable tip | Fisher Scientific | ||
| 2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket | Grace Bio-Lab Inc. |
References
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