הקלטה התנהגות תאיים ב Myxococcus xanthus Biofilms באמצעות זמן לשגות Microcinematography

Summary

כדי ללמוד

Abstract

נחיל של δ-proteobacterium Myxococcus xanthus מכיל מיליוני תאים לפעול כתנועה, תיאום הקולקטיבי באמצעות סדרה של אותות כדי ליצור מורכבות, דפוסי דינמי כתגובה לאותות סביבתיים. דפוסים אלה מארגנים עצמית ו מתהווה, הם לא ניתן לחזות על ידי התבוננות בהתנהגות של תאים בודדים. באמצעות זמן לשגות מעקב assay microcinematography, זיהינו דפוס מתהווה נפרדות מ xanthus בשם chemotaxis, כהגדרתו התנועה מכוונת של נחיל את שיפוע מזין כלפי מקורו ^1.

כדי לאפיין ביעילות chemotaxis דרך microcinematography זמן לשגות, פיתחנו מורכב מאוד לשינוי צלחת (איור 1) ונבנה מקבץ של 8 מיקרוסקופים (איור 2), שכל אחד מהם מסוגל זמן לשגות לכידת וידאו. Assay הוא קפדני מספיק כדי לאפשר שכפול עקבי של נתונים מדידים, ואת קטעי וידאו וכתוצאה מכך מאפשרים לנו להתבונן ולעקוב אחר שינויים עדינים התנהגות נחיל. לאחר שנתפסו, קטעי וידאו המועברים למחשב ניתוח / אחסון עם מספיק זיכרון כדי תהליך ולאחסן אלפי קטעי וידאו. הגמישות של התקנה הזאת הוכיחה שימושי כמה מחברי מ xanthus הקהילה.

Protocol

ציוד נחוץ:

• Klett מטר
• פיפטה וטיפים
• 2.5 microcentrifuge צינורות מ"ל
• Microcentrifuge
• CTTYE התקשורת:
  • Casitone 1.0% (Difco Laboratories), תמצית שמרים 0.5% (Difco Laboratories),
  • 10.0 mM טריס-HCl (pH 8.0), 1.0 מ"מ KH ₂ PO _4, 8.0 mM MgSO ₄
• TPM התקשורת:
  • 10.0 mM טריס-HCl (pH 8.0), 1.0 מ"מ KH ₂ PO _4, 8.0 mM MgSO ₄
• Agarose
• אמבט מים מוגדר 55 ° C
• מיקרוסקופ זכוכית שקופיות
• Coverslips זכוכית גדול
• 2 x 2 ס"מ, 0.5 מ"מ בעובי אטם גומי סיליקון (גרייס Bio-Lab Inc)
• Parafilm (או קלטת תיוג)
• מצבטים
• קלסר קליפים קטנים
• Micro-הדגימה פיפטה (פישר)
• 100 μl זכוכית קצה חד פעמיות (פישר)
• Kimwipes

חלק 1: הכנת Cell

התחל על ידי יצירת סביבה סטרילית.

• סביבת עבודה נקייה, כפפות דון, ואת האור צורב.

1. התחל תרבות הלילה של תאים על ידי inoculating לתוך בקבוקון המכיל מרק CTTYE וטופחו בחושך ב 32 ° C עם מתערבל נמרצת.
2. לאחר התרבות הגיעה צפיפות של 5 x 10 ⁸ תאים / מ"ל, פיפטה 1 מ"ל תאים לתוך צינור microcentrifuge 2.5 מ"ל.
3. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה דקות 2 ב XG 16,000 (או מהירות מרבית).
4. למזוג וזורקים supernatant.
5. לשטוף תא גלולה עם 1 מ"ל TPM (מלח מאוזן, מזין ללא מדיה).
   • מחדש להשעות ו מערבולת
6. Re-גלולה תאים על ידי ספינינג דקות 2 ב XG 16,000 (או מהירות מרבית).
7. למזוג וזורקים supernatant.
   
   שלב קריטי
   
   
8. לגמרי מחדש להשעות גלולה ב 100 התקשורת TPM μl באמצעות שילוב של pipetting ו vortexing.
   
   חשוב: צעד זה מבטיח כי אין גושים של תאים שמאל בצינור. זה עלול לקחת זמן מה.
9. הגדר את התאים בצד בטמפרטורת החדר בעת הכנת לוחות assay מעקב.

חלק 2: הכנת אגר

1. הכן 50 מ"ל של שני TPM (assay התקשורת) ו CTTYE (דיסק התזונתי) בתקשורת.
2. הוסף 0.5 גרם agarose זה (agarose הוא דיפרקטיבית פחות מ אגר).
3. החיטוי לעקר.
4. לאחר העיקור, לשמור על המדיה 55 ° C באינקובטור (או אמבט מים) תוך בניית הצלחת מתחמי מעקב assay.

חלק 3: בנייה דיסק התזונתי

1. המקום גומי סטרילי 0.5 מ"מ בעובי אטם הסיליקון על גבי להבה מעוקרים שקופיות מיקרוסקופ זכוכית, ויצרו גם קטן.
2. פיפטה ~ 300 μl של 55 ° C CTTYE מדיה / agarose לתוך נוצר גם על ידי אטם בשקופית ומכיל את הדיסק התזונתי. התקשורת CTTYE / agarose צריך התל למעלה.
3. המקום שקופית הלהבה מעוקרים (עם אטם לא) על גבי מדיה CTTYE / agarose.
   
   חשוב: זה חייב להיות מוגדר להחליק במורד בזווית כדי למנוע בועות מ טביעה.
4. לאחר שקופית נמצא במקום, מהדק המורכבת יחד עם קטעי קלסר מיני - אחד בכל צד.
5. מניחים את מורכבות מקוטע ב 4 ° C ולאפשר התקשורת CTTYE / agarose להגדיר. בדרך כלל זה לוקח בערך 5 דקות.

חלק 4: הכנת Assay מעקב - הגדרת מתחמי פלייט

להרכיב את המרכיבים, להכין את מתחמי שקופיות, במקום דיסק התזונתי, לשפוך את התקשורת TPM / agarose, מתחמי צלחת נפרדת יבש, תאים צלחת, ולהרכיב מעקב צלחת מתחמי assay.

הצלחת להרכיב רכיבים מורכבים

1. במשך כל מורכבות, להבה מעוקרים שקופיות מיקרוסקופ זכוכית
2. הצב אטם autoclaved על גבי השקופית ומניחים בצד (עיקור כלפי מעלה). זה יהוו את החלק התחתון של assay.
3. הלהבה לעקר כיסוי זכוכית להחליק ומקם אותה על גבי שקופיות מיקרוסקופ second זכוכית עטוף עם סרט תיוג (או Parafilm) ומניחים בצד (עיקור כלפי מעלה). זה משמש שקופית תמיכה כדי לשמור על coverslip מ פיצוח. זה יהוו את החלק העליון של assay.
4. הלהבה לעקר שקופיות third מיקרוסקופ זכוכית ומניחים בצד (עיקור כלפי מעלה). זה ישמש כדי לשטח את agarose.
   
   חשוב: ודא אטמים הטופס חותם עם הזכוכית על ידי לחיצה על אותו עם מלקחיים, אחרת בתקשורת / agarose עלול להתייבש.

P תחרה דיסק התזונתי

חשוב: שלבים 5 עד 10 צריך לעשות כדי מורכבים שקופית אחת בכל פעם, אחרת בתקשורת / agarose יכול להתחיל לגבש וכתוצאה מכך איכות הסרט ירודה.

5. הסר את הטופס דיסק התזונתי מורכב 4 ° C (שלב 5 מחלק 3) ו לחטט בנפרד את השקופיות חשיפת CTTYE הקרושה עכשיו / agarose.
6. הסרת "דיסק התזונתי" בקוטר 1 מ"מ מהתקשורת CTTYE / agarose תיאר היטב מעל בעזרת פיפטה מיקרו הדגימה עם טיפ 100 μl כוס חד פעמי מקום בו יצר טוב על להחליק את המכסה (שלב 3 לעיל) על ידי אטם .

יוצקים צלחות

שלב קריטי

7. פיפטה ~ 300 μl של 55 ° C TPM מדיה / agarose לתוך נוצר גם על ידי אטם על להחליק את מכסה ומכיל את הדיסק התזונתי. התקשורת TPM / agarose צריך התל למעלה.
   
   שלב קריטי
8. מניחים את השקופית להבה מעוקר עם אטם לא (משלב 3) על גבי מדיה TPM / agarose.
   
   חשוב: זה חייב להיות מוגדר להחליק במורד בזווית כדי למנוע בועות מ טביעה.
   
   
9. לאחר השקופית (משלב 5) נמצא במקום, מהדק מורכבים יחד עם קטעי קלסר מיני - אחד בכל צד.
10. מניחים את מורכבות מקוטע ב 4 ° C ולאפשר מדיה / agarose להגדיר. בדרך כלל זה לוקח בערך 5 דקות.

הפרד ויבש צלחות

חשוב: כדי למנוע את מדיה / agarose מהתייבשות, שלבים 11 עד 20 צריך להתבצע רק על מורכבות שקופית אחת בכל פעם.

חשוב: לקבלת תוצאות מיטביות, שלבים 11 עד 13 יש לבצע על 4 ° C.

11. ברגע מדיה / agarose קבע, להסיר את הסרטונים קלסר וסוחטים סוף המתחם כדי לשחרר את השקופית קלטת עטוף.
12. הסר את השקופית קלטת עטוף ולמקם אותו על הספסל לשימוש נוסף.
    
    שלב קריטי
13. בעזרת מלקחיים כמו טריז, להפריד את פליטת לכסות / אטם / מדיה / agarose מורכב משקופית התמיכה (עם אטם לא) וזורקים שקופיות תמיכה.
    
    חשוב: אין להשתמש בתנועה חטטניות להפריד את פליטת לכסות / מורכב אטם. זה יכול לגרום לשבירת לכסות להחליק ו / או התקשורת / agarose דבק להחליק את התמיכה.
14. מניחים את תלוש לכסות / אטם / מדיה / agarose מורכבות בשקופית קלטת עטוף (צד אטם למעלה) ולהסיר 4 ° C. המקום הבא זה מורכב מבער לאפשר לכל לחות לעין להתאדות מפני השטח מדיה / agarose חשוף החדש - לא יותר מ 1 דקות.
    
    חשוב: אל תתנו לתקשורת / agarose יבש יותר מדי זמן כמו זה יכול להשפיע על M. xanthus התנהגות נחיל.

צלחת התאים

שלב קריטי

1. לאחר עודף לחות התאדו, פיפטה 0.5 μl של תאים מרוכזים (שלב 8 מתוך חלק 1) על גבי מדיה / agarose כ 1 מ"מ מן הדיסק מזין.
   
   חשוב: חשוב מאוד לוודא כי התאים מופקדים על ידי העברת פיפטה ישר למטה ואז ישר למעלה. הדבר מבטיח כי נחיל יהיה מעגלי.
   
   חשוב: חשוב מאוד לא לגעת קצה פיפטה לתקשורת / agarose. זה יגרום דיכאון על פני השטח ולשנות את התנהגותם של מ ' xanthus נחיל.
   
   טיפ: לדכא את קצה פיפטה לפני מתקרבים מדיה / agarose. זה יאפשר ירידה של תאים להופיע בחלק התחתון של קצה פיפטה ולהקל להפקיד את התאים.
2. ברגע שתאי מופקדים, למקום הבא מורכב צורב כדי לאפשר את הנקודה תא יבש - לא יותר מ 20 שניות.

להרכיב assay

1. לאחר נקודה תא התייבש, ליישר את מורכבות שקופיות / אטם (משלב 1) עם אטם על להחליק את מכסה / אטם / מדיה / agarose / תא מורכב (משלב 13) ולחץ בעדינות יחד כדי ליצור חותם.
   
   שלב קריטי
2. נקו את המשטחים של השקופית ומכסים להחליק עם Kimwipe כדי להסיר את שאריות שהותירו Parafilm. Assay השלימה צריכה להיות דומה באיור 1.
3. מניחים את מורכבות להחליק הושלמה על הבמה מחומם שמרו על 32 מעלות צלזיוס (להחליק, להחליק את מכסה) מיד לאחר לנגב (שלב 15) על מנת למנוע התעבות מים הטופס. אם נוצר עיבוי, בואו לשבת שקופיות מורכבים על הבמה מחומם למשך מספר שניות לפני הפעלת התוכנה רכישת התמונה.
4. בחרו את היעד המתאים (2X, 4X או 10X).

חלק 5: הכנת סרט

t "> שלב קריטי

1. הפעילו את המצלמה ואת מיקרוסקופ, ולבדוק את רמות האור (לוודא את האור לא חזק מדי). התחל את המחשב ולפתוח את תוכנית רכישת התמונה.
2. לחץ על התמונה בחלון לחיות למקד את המיקרוסקופ. התמונה צריכה להופיע דומה לזה לראות באיור 3. שימו לב אגר משטח אחיד.
3. התחל רכישת תמונות.
   
   שלב קריטי
4. בדוק את המיקוד באופן קבוע במהלך השעה הראשונה, כמו התקשורת / אגר נוטה להסתפק גורם למקד את להיסחף.
5. ניקוי אזור העבודה.
6. לאחר רכישת התמונה הושלמה, העברת רכשה תמונות לאחסון לשבור את מורכבות שקופיות על ידי השריית באתנול 90% בין לילה.
7. אטמים החיטוי לשימוש חוזר.

באיור 1. איור קריקטורה של המתחם צלחת TM. (א) מראה את מורכבות צלחת בסיסית TM בתצוגה התפוצצה חתך. (ב) מציג את השימוש אטמים גדול.

איור 2. מצרר מיקרוסקופ. כל צומת מיקרוסקופ (הבלעה) מורכב מיקרוסקופ ניקון E400, מטרות, שלב מחוממת, מצלמה Insight, ומחשב נייד. כל צומת מחובר לרשת יחד המקושר למחשב בקר מאסטר. שני הצמתים מוגדרים עם יכולות הקרינה המורכבות של מקור האור EXFO ושני תריסים Uniblitz.

איור 3. 20X תמונה של המנגנון assay מעקב בזמן = 0. סרגל קנה מידה, 1 מ"מ.

איור 4. כושר הסתגלות של המתחם צלחת TM. (א) תמונה של 100x מ xanthus גלישה על תנועתיות CTTYE אגר ב 1.0%. (ב) תמונה של 20X פ aeruginosa מתעוות תנועתיות. (ג) תמונה 20X ס marcescens רוחשת תנועתיות. שני (B) (ג) היו assayed על אגר LB ב 1.0%. (ד) תמונה 40X מ ' smegmatis הזזה תנועתיות על אגר LB ב -0.5%. תמונה זו נלכד באמצעות תצורת assay חלופה לראות 1B איור.

וידאו 1. וידיאו זמן לשגות של נחיל נתון assay המעקב.

2. וידאו וידאו זמן לשגות של M. xanthus נחיל שבו 1% של התאים הם שכותרתו fluorescently. תמונות שלב ניגודיות פלורסנט לסירוגין נתפסו מעולף על מנת להבהיר את עמדתו של תאים ניאון בתוך הנחיל. סרט הווידאו הזה נתפס על CTTYE אגר ב 1.0%.

3. וידאו וידאו זמן לשגות של מ ' xanthus תנועתיות גלישה. סרט הווידאו הזה נתפס על CTTYE אגר ב 1.0%.

וידאו 4. וידיאו זמן לשגות של פ aeruginosa מתעוות תנועתיות. סרט הווידאו הזה נתפס על אגר LB ב 1.0%.

וידאו 5. וידיאו זמן לשגות ש marcescens רוחשת תנועתיות. סרט הווידאו הזה נתפס על אגר LB ב 1.0%.

וידאו 6. וידיאו זמן לשגות של מ ' smegmatis הזזה תנועתיות. סרט הווידאו הזה נתפס על אגר LB ב -0.5% באמצעות תצורת assay חלופה לראות 1B איור.

Discussion

זמן לשגות microcinematography (TM) הפכה הגישה הסטנדרטית ללימוד תנועתיות פרוקריוטים ^2-7. באופן מסורתי, TM מבוצעת באמצעות פתילות נייר פילטר, רפידות אגר דקה, או לוחות אגר כמו מצעים ^8-11. שיטות אלה נאותה וחסכונית כאשר נעשה שימוש כדי ליצור רצפים התמונה איורים הכללי של תנועת חיידקים. עם זאת, אם התמונה sequences חייב לגרום לדור של לשחזור נתונים קפדני כמותית, שיטות אלו זמן רב ולא אמינה למדי. לדוגמה, שינויים בשיטות אלה שנגרמו על ידי טעות אנוש עלול להוביל למגוון רחב של אי דיוקים, אי סדירות של פני השטח אגר שיכול להשפיע באופן דרמטי את התנהגותם של חיידקים הנלמד ההבדלים במישור המוקד מצד אחד של המצע assay לשני. כדי לפתור בעיות אלו, עיצבנו מורכבת צלחת TM כי הוא באיכות עקבית מספיק כדי להניב תוצאות לשחזור על ידי העסקת אטמי סיליקון כי הן זול לשימוש חוזר (איור 1). בנוסף, הוא מאוד מורכב צלחת לשינוי ו הוכיחה להישאר להתייבש מחומצן מספיק עבור יותר משבוע על מגוון רחב של סוגי מדיה ריכוזי אגר.

כדי להקל על הדור של זמן לשגות סרטים, 8 ניקון E400 מיקרוסקופים היו לבוש עם מטרות 2X, 4X, 10X ואת כל. בנוסף, המצלמה Insight (אבחון מכשירים, Inc), ובמה מחומם (20/20 Technologies) נרכשה עבור כל מיקרוסקופ. כל מצלמה נקשר מחשב נייד שעליו לשינוי רכישת ביותר תמונה התוכנה SPOT (אבחון מכשירים, Inc) הותקנו. כל הרכיבים השונים נאספו לתוך צמתים, שכל אחד מהם בהיקף של מיקרוסקופ, שלושה יעדים, מצלמה Insight, שלב מחוממת, ומחשב שליטה. כל אחד שמונה צמתים ברשת היו יחד לתוך אשכול וגם המקושר למחשב האחסון המשמש לקמפל, לנתח החנות זמן לשגות קטעי וידאו שהופקו על ידי צביר (איור 2). המחשב האחסון היה לבוש עם מערכת terabyte RAID 1, אשר נדרש כדי לאחסן את כמות עצומה של נתונים שנוצרו על ידי באשכול.

שלמה פעם, מורכב המשטח מונח על הבמה מחומם של המיקרוסקופ ו assay מעקב היא יזמה. תמונות נרכשים במרווחי זמן קבועים מראש אשר נקבעים על פי הריבית תנועתיות של התאים. לדוגמה, אדם מ תאים xanthus לנוע בשיעור של כ אורך תא אחד לדקה. אם התמונות נרכשים של M. xanthus נחיל בשיעור באותו (תמונה אחת לדקה), שהתקבל זמן לשגות הווידאו יופיעו חלק במהלך השמעה. לאחר רכישת התמונה הושלמה, התמונות הן מלוקט לתוך מטריצה ​​רציפים ו שיחקה לאחור בקצב מספיק שהם נראים נעים (Video. 1). וידאו זה זמן לשגות כעת ניתן נותחו באמצעות תוכנה במגוון חבילות.

וריאציות על Assay. מורכבים צלחת TM הוא מאוד לשינוי, וניתן להשתמש כדי לחזות מיקרואורגניזמים שונים תחת מגוון של תנאים. ויזואליזציה הנחיל ניתן לבצע באמצעות שלב בניגוד מיקרוסקופיה (אשר מתעדת את התנהגות הנחיל כישות אחת), מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אשר מתעדת את התנהגותם של תאים בודדים פלורסנט כי כבר מדולל האוכלוסייה הלא ניאון), או שילוב של שניהם (אשר שכבות לסירוגין רציפים שלב ניגודיות פלורסנט תמונות) (וידאו 2). המתחם צלחת שימש בהצלחה ליצור זמן לשגות קטעי וידאו של התנהגויות פרוקריוטים מספר כולל מ xanthus תנועתיות גלישה, תנועתיות Pseudomonas aeruginosa מתעוות, marcescens Seratia רוחשת תנועתיות, ואת תנועתיות רומן Mycobacterium smegmatis הזזה (איור 4 וסרטי וידאו 3-6).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0% Casitone	Difco Laboratories
0.5% yeast extract	Difco Laboratories
Micro-sampling pipette	Fisher Scientific
100 μl glass disposable tip	Fisher Scientific
2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket	Grace Bio-Lab Inc.