Summary
Pour étudier
Abstract
Un essaim de la δ-protéobactérie xanthus Myxococcus contient des millions de cellules qui agissent comme un collectif, le mouvement de coordination à travers une série de signaux complexes pour créer des modèles dynamiques, en réponse à des signaux environnementaux. Ces modèles sont auto-organisation et émergence; ils ne peuvent pas être prédits en observant le comportement des cellules individuelles. En utilisant un test time-lapse microcinématographie suivi, nous avons identifié un modèle distinct émergente dans M. xanthus appelé chimiotactisme, défini comme le mouvement dirigé d'un essaim d'un gradient de nutriment vers la source 1.
Afin de caractériser efficacement la chimiotaxie par time-lapse microcinématographie, nous avons développé une très plaque modifiables complexe (figure 1) et construit un groupe de 8 microscopes (figure 2), chacune capable de capturer des vidéos time-lapse. Le test est assez rigoureux pour permettre la réplication cohérente des données quantifiables, et le resulting vidéos nous permettent d'observer et de suivre les changements subtils dans le comportement essaim. Une fois capturés, les vidéos sont transférées à un ordinateur d'analyse / de stockage avec assez de mémoire pour traiter et stocker des milliers de vidéos. La flexibilité de cette configuration s'est avéré utile pour plusieurs membres de la M. xanthus communauté.
Protocol
Fournitures nécessaires:
- Klett mètres
- Pipette et pointes
- 2,5 ml microtubes
- Microcentrifugeuse
- CTTYE médias:
- 1,0% casitone (Difco Laboratories), extrait de levure 0,5% (Difco Laboratories),
- 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4
- TPM médias:
- 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4
- Agarose
- Bain-marie réglé à 55 ° C
- Lames de microscope
- Lamelles de verre de grandes
- 2 x 2 cm, 0,5 mm d'épaisseur de joint en caoutchouc de silicone (Grace Bio-Lab Inc)
- Parafilm (ou bande d'étiquetage)
- Forceps
- Clips liant petites
- Micro-échantillonnage pipette (Fisher)
- 100 ul pointe de verre jetable (Fisher)
- Kimwipes
Partie 1: Préparation des cellules
Commencez par créer un environnement stérile.
- Propre espace de travail, gants de Don, et allumer le brûleur.
- Démarrer une culture de nuit de cellules en inoculant dans un flacon contenant un bouillon CTTYE et incubés à l'obscurité à 32 ° C en remuant vigoureusement.
- Une fois que la culture a atteint une densité de 5 x 10 8 cellules / ml, pipeter 1 ml de cellules dans un tube de 2,5 ml.
- Cellules par centrifugation pendant 2 min à 16000 xg (ou vitesse max).
- Décanter et éliminer le surnageant.
- Laver culot de cellules avec 1 ml TPM (sel équilibrés en nutriments médias libres).
- remettre en suspension et le vortex
- Re-pellets cellules par filage pendant 2 min à 16.000 xg (ou vitesse max). <li> Décanter et éliminer le surnageant.
- Complètement remis en suspension le culot dans 100 médias TPM ul utilisant une combinaison de pipetage et vortex.
IMPORTANT: Cette étape permet de s'assurer qu'il n'y ait pas des amas de cellules restant dans le tube. Cela peut prendre un certain temps. - Définissez les cellules réserver à température ambiante pendant la préparation des plaques d'essai de suivi.
ÉTAPE CRITIQUE
Partie 2: Préparation Agar
- Préparer 50 ml de fois TPM (analyse des médias) et CTTYE (disque nutritive) des médias.
- Ajouter 0,5 g d'agarose à chacun (agarose est moins diffraction de gélose).
- Autoclave pour stériliser.
- Après stérilisation, de maintenir le milieu à 55 ° C dans un incubateur (ou l'eau du bain) lors de la construction des complexes de suivi de plaque d'essai.
Partie 3: Construction de disque Nutritive
- Placez un stérile 0,5-mm d'épaisseur joint en caoutchouc de silicone sur le dessus d'une flamme-lame de verre de microscope stérilisé, formant ainsi un petit.
- Pipette ~ 300 ul de la 55 ° C CTTYE médias / agarose dans le puits créé par le joint sur la diapositive contenant le disque et nutritive. Les médias CTTYE / agarose devrait monticule.
- Placer une lame de flamme stérilisé (sans joint) au-dessus du support CTTYE / agarose.
IMPORTANT: Cette diapositive doit être posé à un angle pour éviter la formation de bulles. - Une fois que la lame est en place, serrer le complexe avec des clips liant mini - un de chaque côté.
- Placer le complexe coupé à 4 ° C et laisser le support CTTYE / agarose à régler. Cela prend habituellement environ 5 min.
Partie 4: Préparation Essai de suivi - Set Up Complexes plaques
Assemblez les composants, préparer les complexes de diapositives, placez le disque nutritive, versez les médias TPM / agarose, sepcomplexes plaques arate et sec, les cellules de plaques et assembler le suivi des complexes plaque de dosage.
Assembler les composants de plaques complexes
- Pour chaque complexe, la flamme stérilisé une lame de microscope en verre
- Placez un joint autoclave au-dessus de la lame et mettre de côté (stérilisé vers le haut). C'est ce qui constituera le fond de l'essai.
- Flamme stériliser un couvercle en verre de glisser et de le placer sur une lame de microscope second verre enveloppé d'étiquetage bande (ou Parafilm) et mettre de côté (stérilisé vers le haut). Il est utilisé comme un chariot de support pour maintenir la lamelle de craquage. Cela formera la partie supérieure de l'essai.
- Flamme stériliser une diapositive troisième verre de microscope et mettre de côté (stérilisé vers le haut). Il sera utilisé pour aplatir l'agarose.
IMPORTANT: Assurez-vous que les joints de former un joint avec le verre en appuyant dessus avec une pince, sinon les médias / agarose risque de sécher.
Pdentelle disque nutritive
IMPORTANT: les étapes 5 à 10 doit être fait à un complexe diapositive à la fois, sinon les médias / agarose pourrait commencer à se solidifier pour une qualité vidéo médiocre.
- Retirez le disque sous forme nutritive complexe de 4 ° C (étape 5 de la partie 3) et essayer de séparer les diapositives exposant la maintenant solidifié CTTYE / agarose.
- Suppression d'un "disque nutritive '1 mm de diamètre à partir du support CTTYE / agarose bien décrite ci-dessus à l'aide d'une pipette de micro-échantillonnage avec une pointe en verre de 100 ul jetable et placez-le dans le puits créé par le joint sur la lamelle (étape 3 ci-dessus) .
Verser dans les boîtes
ÉTAPE CRITIQUE
- Pipette ~ 300 ul de la 55 ° C TPM médias / agarose dans le puits créé par le joint sur la lamelle et contenant le disque nutritive. Les médias TPM / agarose devrait monticule.
CRITIQUE STEP - Placer la lame flamme stérilisés sans joint (à partir de l'étape 3) sur le dessus du support TPM / agarose.
IMPORTANT: Cette diapositive doit être posé à un angle pour éviter la formation de bulles. - Une fois que le coulisseau (à partir de l'étape 5) est en place, serrer le complexe avec des clips liants pour mini - une de chaque côté.
- Placer le complexe coupé à 4 ° C et laisser le support / agarose à régler. Cela prend habituellement environ 5 min.
Plaques séparées et sèche
IMPORTANT: Pour éviter des médias / agarose de se dessécher, les étapes 11 à 20 doit être effectuée que sur un complexe diapositive à la fois.
IMPORTANT: Pour de meilleurs résultats, les étapes 11 à 13 doivent être effectuées à 4 ° C.
- Une fois le support / agarose a pris, retirer les clips liant et presser le bout du complexe de desserrer le ruban gainé glissée.
- Retirez la lame de bande enroulée et le placer sur le banc pour une utilisation ultérieure.
ÉTAPE CRITIQUE - En utilisant une pince comme un coin, séparer la lamelle / joint / support / agarose complexe de la glissière de support (sans joint) et jeter coulisseau de support.
IMPORTANT: Ne pas utiliser un mouvement de levier pour séparer la lamelle / complexe d'étanchéité. Cela pourrait entraîner la rupture lamelle et / ou le collage des médias / agarose pour la lame support. - Placez la lamelle / joint / media / agarose complexe sur la lame de bande enroulée (côté joint haut) et retirer de 4 ° C. Placez ce complexe à côté d'un brûleur pour permettre à tous d'humidité visible s'évaporer de la nouvellement exposée médias / agarose surface - pas plus de 1 min.
IMPORTANT: Ne pas laisser sécher les médias / agarose pendant trop longtemps car cela pourrait influer sur la M. xanthus essaim comportement.
Cellules de la plaque
- Une fois l'excès d'humidité se soit évaporée, une pipette 0,5 ul de cellules concentrées (étape 8 de la partie 1) sur les médias environ 1 / agarose mm du disque en éléments nutritifs.
IMPORTANT: Il est extrêmement important de s'assurer que les cellules sont déposées en déplaçant la pipette vers le bas puis vers le haut. Cela garantit que l'essaim sera circulaire.
IMPORTANT: Il est extrêmement important de ne pas toucher l'embout de la pipette aux médias / agarose. Cela fera une dépression sur la surface et changer le comportement de l'M. xanthus essaim.
ASTUCE: Appuyez sur la pointe de la pipette avant d'approcher les médias / agarose. Cela permettra une baisse de cellules à apparaître sur le fond de l'embout de pipette et le rendre plus facile à déposer dans les cellules. - Une fois que les cellules sont déposées, placez le côté complexe du brûleur pour permettre à l'endroit de la cellule sèche - pas plus de 20 secondes.
Assemblez test
- Une fois l'endroit cellule a séché, alignez le complexe coulissant / joint (de l'étape 1) avec le joint sur la lamelle / joint / media / agarose / cellule complexe (de l'étape 13) et appuyez doucement pour former un joint.
ÉTAPE CRITIQUE - Nettoyer les surfaces de la lame et lamelle avec un Kimwipe pour enlever le résidu laissé par le Parafilm. Le test complet devrait ressembler à la Figure 1.
- Placez le complexe glissière achevée sur la scène chauffée maintenue à 32 ° C (toboggan, couvrir glisser vers le haut) immédiatement après essuyer (étape 15) pour éviter la formation de condensation forme. En cas de condensation, laisser reposer glissement complexe sur la scène chauffée pendant plusieurs secondes avant de démarrer le logiciel d'acquisition d'image.
- Choisissez l'objectif approprié (2X, 4X, 10X ou).
Partie 5: Préparation Film
t "> étape cruciale- Allumez l'appareil photo et d'un microscope, et de vérifier les niveaux de lumière (assurez-vous que la lumière n'est pas trop intense). Démarrez l'ordinateur et ouvrez le programme d'acquisition d'images.
- Cliquez sur la fenêtre d'image en direct et orienter le microscope. L'image devrait ressembler à celui illustré à la figure 3. Notez la surface de la gélose uniforme.
- Démarrer l'acquisition d'images.
ÉTAPE CRITIQUE - Vérifiez régulièrement l'objet au cours de la première heure, comme les médias / agar-agar a tendance à s'installer provoquant la mise au point à la dérive.
- Nettoyer la zone de travail.
- Une fois l'acquisition d'image est terminée, le transfert des images acquises pour le stockage et briser le complexe coulissant par trempage dans de l'éthanol à 90% du jour au lendemain.
- Joints autoclaves pour la réutilisation.
Illustration de bande dessinée la figure 1. Du complexe plaque TM.(A) montre la complexité plaque de base TM en vue éclatée et en coupe. (B) montre l'utilisation de plus gros joints.
Figure 2. Groupe microscope. Chaque noeud de microscope (encart) est constitué d'un microscope Nikon E400, objectifs, une platine chauffante, un appareil photo Insight, et un ordinateur portable. Chaque noeud est mis en réseau et reliés à un ordinateur de commande maître. Deux des nœuds sont mis en place avec des capacités de fluorescence qui se composent de la source de lumière d'EXFO et deux volets Uniblitz.
Figure 3. A l'image de l'appareil d'essai 20X suivi au temps = 0. La barre d'échelle, de 1 mm.
Figure 4. Adaptabilité du complexe plaque TM. (A) d'une image de 100XM. xanthus glisse sur la motilité CTTYE dans la gélose 1,0%. (B) une image à 20X de P. aeruginosa secousses motilité. (C) une image 20X S. marcescens essaimage motilité. Les deux (B) et (C) ont été testées sur LB dans la gélose 1,0%. (D) une image à 40X de M. smegmatis glisser sur la motilité LB agar dans 0,5%. Cette image a été capturée à l'aide de la configuration d'essai de remplacement vu dans la figure 1B.
Vidéo 1. Une vidéo time-lapse d'un essaim soumis à l'essai de suivi.
Vidéo 2. Une vidéo time-lapse d'un M. xanthus essaim où 1% des cellules sont marquées par fluorescence. Alternant à contraste de phase et des images fluorescentes ont été capturés et recouvert d'élucider la position de cellules fluorescentes dans l'essaim. Cette vidéo a été capturée sur CTTYE dans la gélose 1,0%.
Vidéo 3. Une vidéo time-lapse de M. xanthus glisse motilité. Cette vidéo a été capturée sur CTTYE dansAgar 1,0%.
Vidéo 4. Une vidéo time-lapse de P. aeruginosa secousses motilité. Cette vidéo a été capturée sur LB dans la gélose 1,0%.
Vidéo 5. Une vidéo time-lapse de S. marcescens essaimage motilité. Cette vidéo a été capturée sur LB dans la gélose 1,0%.
Vidéo 6. Une vidéo time-lapse de M. smegmatis glisser la motilité. Cette vidéo a été capturée sur LB agar 0,5% en utilisant la configuration d'essai de remplacement vu dans la figure 1B.
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Discussion
Time-lapse microcinématographie (TM) est devenu une approche standard à l'étude de la motilité procaryote 2-7. Traditionnellement, TM est effectuée en utilisant des mèches de papier filtre, blocs de gélose ou en plaques minces, en tant que substrats de gélose 8-11. Ces méthodes sont adéquates et rentable lorsqu'il est utilisé pour générer des séquences d'images d'illustrations généraux du mouvement bactérienne. Toutefois, si des séquences d'images doit se traduire par la production de données reproductibles et quantitativement rigoureuse, ces méthodes sont longues et peu fiables. Par exemple, les variations de ces techniques causés par une erreur humaine pourrait conduire à un large éventail d'inexactitudes, d'irrégularités dans la surface de la gélose qui pourrait considérablement affecter le comportement de la bactérie à l'étude des différences dans le plan focal d'un côté du substrat d'essai à l'autre. Pour résoudre ces problèmes, nous avons conçu un complexe plaque TM, qui est d'une qualité suffisamment cohérente pour produire resul reproductiblets en employant des joints de silicone qui sont à la fois peu coûteux et réutilisables (Fig. 1). En outre, le complexe plaque est hautement modifiable et a fait ses preuves pour rester hydraté et suffisamment oxygénée pendant plus d'une semaine sur une variété de types de supports et les concentrations de gélose.
Pour faciliter la génération de time-lapse films, 8 Nikon E400 microscopes ont été équipés avec des objectifs 2X, 4X, 10X et chacun. En outre, une caméra Insight (Diagnostic Instruments, Inc), et une platine chauffante (20/20 Technologies) a été acquis pour chaque microscope. Chaque caméra a été relié à un ordinateur portable sur lequel l'image de haute modifiables acquisition SPOT logiciel (Diagnostic Instruments, Inc) a été installé. Tous les différents éléments ont été assemblés dans les noeuds, chacun constitué d'un microscope, trois objectifs, une caméra Insight, une platine chauffante, et un ordinateur de commande. Chacun des huit noeuds sont reliés en réseau dans un cluster et relié à un ordinateur de stockage qui est noused pour compiler, analyser et stocker les vidéos time-lapse générés par le cluster (Fig. 2). Le stockage informatique a été équipé d'un système RAID 1 téraoctet, qui est nécessaire pour stocker la grande quantité de données générées par le cluster.
Une fois terminé, le complexe de plaque est placé sur la platine chauffante du microscope et le dosage de suivi est lancé. Les images sont acquises à des intervalles prédéfinis sont déterminés sur la base du taux de la motilité des cellules. Par exemple, M. individuelle cellules xanthus se déplacer à une vitesse d'environ une longueur de cellule par minute. Si les images sont acquises d'un M. xanthus essaim à ce même taux (une image par minute), le résultat time-lapse vidéo apparaître lisse lors de la lecture. Une fois l'acquisition des images est terminé, les images sont compilées dans une matrice séquentielle et lus à une vitesse suffisante qu'ils semblent se déplacer (Video. 1). Cette vidéo time-lapse peut maintenant être analysées en utilisant une variété de progiciels.
Variations sur Assay. Le complexe plaque TM est hautement modifiable et peut être utilisé pour visualiser de nombreux micro-organismes différents dans une variété de conditions. Visualisation essaim peut être effectuée en utilisant la microscopie à contraste de phase (qui enregistre le comportement de l'essaim comme une entité unique), microscopie à fluorescence (qui enregistre le comportement de cellules individuelles fluorescentes qui ont été dilués dans une population non fluorescent), ou une combinaison à la fois (ce qui recouvre en alternance séquentielle des images à contraste de phase et à fluorescence) (Vidéo 2). Le complexe plaque a été utilisée avec succès pour générer des vidéos time-lapse de plusieurs comportements procaryotes dont M. xanthus glisse motilité, Pseudomonas aeruginosa secousses motilité, marcescens Seratia essaimage motilité, et le roman Mycobacterium smegmatis motilité coulissant (fig. 4 et Vidéos 3-6).
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette recherche a été rendue possible grâce à une bourse de la National Science Foundation carrière (MCB-0746066, Caractérisation des activateurs transcriptionnels qui régulent le comportement émergent) pour RDW
Nous sommes reconnaissants à LJ Shimkus, BS Goldman, G. Suen, M. Singer, LG Welch, KA Murphy, et HG Taylor pour des discussions utiles et des commentaires sur le manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0% Casitone | Difco Laboratories | ||
| 0.5% yeast extract | Difco Laboratories | ||
| Micro-sampling pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 μl glass disposable tip | Fisher Scientific | ||
| 2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket | Grace Bio-Lab Inc. |
References
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