Un giorno Scheme flusso di lavoro per batterica Rilevazione dei patogeni e test di resistenza antimicrobica dalle emocolture

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare e valutare la suscettibilità agli antibiotici degli isolati di emocoltura in meno tempo rispetto ai metodi convenzionali. Ciò si ottiene identificando prima l'isolato dell'emocoltura. Utilizzando un nuovo test PCR DNA MultiPro a 16 s ribosomiale.

Quindi l'isolato viene incubato con un pannello di antibiotici per sei ore. Il passo successivo consiste nel determinare la crescita o la crescita nell'inibizione dell'isolato in presenza dell'antibiotico utilizzando un test quantitativo di 16 s di D-N-A-P-C-R. In definitiva, i risultati mostrano che l'identificazione e il test di suscettibilità agli antibiotici di un isolato di emocoltura possono essere ottenuti più rapidamente attraverso questa combinazione di coltura e PCR.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come quelli che utilizzano sistemi automatizzati phoenix o IIC, è che non è richiesto alcuno stato di coltura precedente e che i risultati dell'identificazione e dei test di sensibilità agli antibiotici possono essere disponibili entro lo stesso giorno. A dimostrare la procedura saranno Vandy Hanson e gli studenti di dottorato GID ing del nostro laboratorio Diluire 100 microlitri di emocoltura positivi per la crescita microbica in una provetta di reazione contenente 900 microlitri di cloruro di sodio allo 0,9%. Quindi centrifugare il campione a 13, 400 volte G per cinque minuti per pellettare i batteri dopo la centrifugazione.

Reese, sospendere il pellet in 100 microlitri di acqua demineralizzata sterile. Installare il campione a quattro gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Una volta che tutti i campioni sono pronti, preparare le miscele di reazione PCR in tempo reale per amplificare il DNA ribosomiale specifico 16 s dai batteri di interesse.

Utilizzare acqua demineralizzata per regolare i volumi a 20 microlitri per reazione. Aliquotare 20 microlitri di miscela PCR per pozzetto in una piastra PCR a 96 pozzetti. Quindi aggiungere cinque microlitri di campione in ciascun pozzetto e sigillare la piastra PCR.

Successivamente, eseguire la PCR sul sistema di PCR in tempo reale A BI Prism 7, 900 HT per analizzare i risultati una volta completata la PCR, utilizzare prima la scheda delle impostazioni di analisi per regolare l'analisi CT su 0,1. Quindi restringere le configurazioni di base per iniziare il ciclo sei e terminare il ciclo 15. Registrare il valore CT per ogni campione.

Il valore limite per considerare un risultato PCR come positivo può generalmente essere impostato su un valore CT di 35. In questo esempio, il profilo di identificazione di un'emocoltura infetta da E. coli è mostrato in due miscele di reazione. Sono stati inclusi primer di DNA ribosomiale Universal 16 s che hanno generato due curve di amplificazione di CT 25.2 e 25.95.

La terza curva di amplificazione è derivata dalla sonda specifica per Coli. Altre sonde specifiche non hanno generato segnali rilevabili. Una volta identificato l'agente patogeno, è possibile eseguire il test antibiotico.

Inizia trasferendo cinque millilitri di brodo da un'emocoltura positiva in una provetta di separazione del siero. Centrifugare il campione a 2000 volte G per 10 minuti dopo la centrifugazione, scartare l'agente supan dalla provetta. Quindi, utilizzando un batuffolo di cotone sterile, trasferire i batteri dallo strato di gel della provetta in cloruro di sodio allo 0,9% fino ad ottenere una soluzione con una torbidità di uno standard di McFarland 0,5.

Ciò corrisponde a circa 1,5 volte 10 alle otto unità formanti colonie per millilitro. Successivamente, diluire la sospensione in doppia concentrazione Muller Hinton. Due brodi per ottenere una concentrazione di circa cinque volte 10 alle cinque unità formanti colonie per millilitro.

Aliquotare 50 microlitri per pozzetto della sospensione in una piastra per microtitolazione contenente già 50 microlitri per pozzetto di una selezione di antibiotici. Assicurati di includere controlli di crescita positivi per ogni campione utilizzando pozzetti con acqua invece di antibiotici. Coprire il piatto quando ha finito.

Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per sei ore per consentire la crescita batterica. Assicurati di conservare un'aliquota della sospensione batterica a quattro gradi Celsius come controllo negativo della crescita. Dopo l'incubazione di sei ore, trasferire il contenuto di ciascun pozzetto e il campione di controllo negativo in provette sterili separate.

Segue una centrifugazione di cinque minuti a 16.000 volte. G, rimuovere 80 microlitri di surnatante e risospendere i pellet in 80 microlitri di acqua demineralizzata sterile. Diluire i campioni da uno a 10 in acqua prima di utilizzarli per la PCR in tempo reale del DNA a 16 s ribosomiale.

Preparare la miscela PCR utilizzando la super miscela IQ cyber green e 16 primer di DNA ribosomiale e aliquota. 20 microlitri per pozzetto in una piastra PCR a 96 pozzetti. Quindi aggiungere cinque microlitri di ciascun campione ai pozzetti e sigillare la piastra.

Quindi, eseguire la PCR per analizzare i risultati. Innanzitutto, calcola il valore CT di cutoff. In generale, il CT di cutoff è uguale al CT del controllo di crescita positivo più 0,5 volte il CT del controllo di crescita negativo meno il CT del controllo di crescita.

Tuttavia, per piperacillina, piperacillina con tazobactam e CEF dazadi in bastoncelli gram-negativi, nonché per amoxicillina, oxacillina e trimetoprim con sulfametossazolo in staphylococcus aureus o da amoxicillina. Nell'enterococcus SPP, il fattore di moltiplicazione di 0,5 dovrebbe essere ridotto a 0,25. La suscettibilità o la resistenza dei ceppi in ciascun campione può essere determinata confrontando la TC del campione con la ct cutoff.

Un valore CT superiore al cutoff indica suscettibilità, mentre un CT inferiore al cutoff indica resistenza. Ecco un esempio di un grafico di amplificazione della suscettibilità agli antibiotici. Il ceppo di E coli identificato in precedenza è stato testato per la sensibilità a diversi antibiotici, ciascuno rappresentato da una curva separata.

I campioni con un basso valore CT sono campioni in cui la crescita si è verificata in presenza di un antibiotico che indica resistenza all'antibiotico testato. Al contrario, un valore CT elevato rappresenta un campione in cui non si è verificata alcuna crescita, indicando la suscettibilità all'antibiotico testato una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in nove ore se eseguita correttamente.