Electric Field-kontrollerad Riktad Migration av neurala stamceller i 2D-och 3D-miljöer
Summary
Detta protokoll visar metoder för att fastställa 2D-och 3D-miljöer i specialdesignade electrotactic kammare, som kan spåra celler<em> In vivo / ex vivo</em> Med time-lapse inspelning på en enda cell, i syfte att undersöka galvanotaxis / electrotaxis och andra cellulära svar på likström (DC) elektriska fält (EFS).
Abstract
Endogena elektriska fält (EFS) förekommer naturligt in vivo och spelar en avgörande roll under vävnad / organ utveckling och förnyelse, bland annat av det centrala nervsystemet 1,2. Dessa endogena EF alstras genom cellulär reglering av jontransport kombineras med den elektriska resistansen hos celler och vävnader. Det har rapporterats att tillämpas EF behandlingen kan främja funktionell reparation av ryggmärgsskador hos djur och människor 3,4. I synnerhet har EF-riktad cellmigration visats i en mängd olika celltyper 5,6, innefattande neurala progenitorceller (NPC) 7,8. Applicering av likström (DC) EF är inte en allmänt tillgänglig teknik i de flesta laboratorier. Vi har beskrivit detaljerade protokoll för tillämpning av DC EFS för att cell-och vävnadskulturer tidigare 5,11. Här presenterar vi en video demonstration av standardmetoder som bygger på ett beräknat fält styrka att upprätta 2D end 3D miljöer för NPC, samt att undersöka cellulära svar på EF stimulering i både singel förhållanden celltillväxt i 2D, och organotypisk ryggmärgen bit i 3D. Den spinala cordslice är en idealisk mottagande vävnaden för att studera NPC ex vivo beteenden, efter transplantation, eftersom den cytoarchitectonic vävnadsorganisation är väl bevarade i dessa kulturer 9,10. Dessutom möjliggör denna ex vivo modell även förfaranden som inte är tekniskt möjligt att spåra celler in vivo med time-lapse inspelning på en enda cell nivå. Det är kritiskt viktigt att utvärdera cell beteenden inte bara i en 2D-miljö, men också i en 3D-organotypisk tillstånd som härmar in vivo miljö. Detta system ska medge en hög upplösning avbildning med skyddsglas-baserade rätter i vävnad eller organ kultur med 3D spårning av enskild cell migration in vitro och ex vivo och kan vara ett mellansteg innan man går in i vivo paradigm.
Protocol
Discussion
Protokollen vi använder är baserade på tidigare studier 5,11. Genom att använda dessa metoder, stabil kultur och elektrisk ström kan upprätthållas samtidigt som en EF via agar broar, Steinbergs lösning, och Ag / AgCl elektroder, till celler eller skivor som odlats i Skräddarsydda electrotactic kammare standardiserade och exakt mått. Djupet av kamrarna kan justeras för att rymma för olika prov tjocklekar 11, och i fallet med celler, kan kammarens storlek modifieras för att rymma emeller…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Royal Society URF bidrag UF051616, Storbritannien och det europeiska forskningsrådet StG bidrag 243.261 till BS. Arbetet i MZ lab stöds också av en California Institute of regenerativ medicin bidrag RB1-01.417.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| FGF-basic Recombinant Human | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng/mL |
| EGF Recombinant Human | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng/mL |
| N2-Supplement (100X) liquid | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 medium (high glucose) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Natural mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Growth factor reduced Basement Membrane Matrix (Matrigel) | B.D. Biosciences | 354230 | |
| HEPES buffer | Gibco | 15630 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
Riferimenti
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
- Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord. PNAS. 77, 1209-1209 (1980).
- Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial. J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).
- Zhao, M., Song, B., Pu, J. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, 457-457 (2006).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).
- Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration. Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).
- Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Song, B., Gu, Y., Pu, j. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).
