Summary
हम एक भी मानव रक्त दाता से विनियामक स्मृति, और भोले टी कोशिकाओं को पैदा करने के लिए एक विधि का वर्णन. Polarized Tregs तो दमन भी यहाँ विस्तृत परख सहित आनुवंशिक एकरूपता, साथ आनुवंशिक और कार्यात्मक आवेदनों की एक किस्म में अन्य सबसेट की तुलना में किया जा सकता है.
Protocol
1. मानव Buffy कोट से परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) का अलगाव
- अस्पताल या पास रक्त केंद्र स्थान से buffy कोट की एक इकाई मोल. हमारे रक्त केंद्र buffy कोट प्रति यूनिट सामान्य रक्त दाताओं से प्राप्त की 40-60 के बारे में एमएल के साथ हमें प्रदान करता है.
- एक autoclaved 500 एमएल बाँझ पीबीएस गिलास युक्त बोतल buffy कोट कमजोर करने में खून बहना. पीबीएस + buffy कोट के अंतिम मात्रा 250 एमएल होना चाहिए.
- दस 50 एमएल चोटीदार ट्यूबों 20 एमएल Lymphoprep समाधान के साथ प्रत्येक भरें.
- धीरे पतला buffy कोट की 25 एमएल के साथ Lymphoprep समाधान के उपरिशायी, सावधान किया जा रहा को Lymphoprep समाधान परेशान नहीं है.
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए x 500 जी में ट्यूबों स्पिन. के अपकेंद्रित्र ब्रेक की बारी है, तो लिम्फोसाइट अंश के रूप में परेशान नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें.
- और एक विंदुक साथ में Lymphoprep प्लाज्मा मध्यम परतों के बीच इंटरफेस में PBMCs लीजिए. के बारे में 1 एमएल जब तक बंद प्लाज्मा मध्यम महाप्राण (व्यंजन)अभी भी buffy कोट PBMCs युक्त परत को शामिल किया गया. 10 एमएल विंदुक का उपयोग करने के लिए एक नया 50 एमएल ट्यूब PBMCs हस्तांतरण.
- कोशिकाओं पीबीएस के साथ दो बार और फिर धो ठंड RPMI के 50 एमएल में एक hemocytometer पर गिनती के लिए कोशिकाओं resuspend. ठेठ वसूली 8 x 10 8 है एक PBMCs 9 10 x.
इस प्रक्रिया में रक्त के छोटे संस्करणों के लिए नीचे बढ़ाया जा सकता है. पूरे रक्त के नमूनों के कमजोर पड़ने 1:1 के पीबीएस में है.
2. चुंबकीय नकारात्मक चयन कुल सीडी 4 + टी कोशिकाओं, सीडी 4 + CD45RA + भोले टी कोशिकाओं या सीडी 4 + CD45RO (टेक्नोलॉजीज सेल स्टेम) + मेमोरी से PBMCs EasySep संवर्धन किट का उपयोग टी कोशिकाओं
1 10 एक्स 4.25 x 10 8 PBMCs से 8 के लिए चरणों का पालन करें.
- 5 10 x 7, पीबीएस में एमएल प्रति FBS 2% और 1mm EDTA युक्त अंतिम एकाग्रता resuspend PBMCs. एक ताजा 14 एमएल polypropylene के दौर नीचे ट्यूब की कोशिकाओं को बढ़ने.
- कुल मानव + नकारात्मक चयन द्वारा CD4 टी कोशिकाओं का अलगाव: मानव + टी सेल एंटीबॉडी के संवर्धन कॉकटेल (PBMCs के एमएल प्रति 50 μL), मिश्रण और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं सीडी 4 जोड़ें.
- मानव भोले टी कोशिकाओं की नकारात्मक चयन से अलगाव: प्रतिरक्षी विरोधी CD45RO एमएल प्रति PBMC सेल निलंबन, मिश्रण के 50 μL जोड़ने और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं. संवर्धन (PBMCs के प्रति एमएल के 50 μL) किट, मिश्रण और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं के साथ प्रदान की कॉकटेल जोड़ें.
- मानव स्मृति टी कोशिकाओं की नकारात्मक चयन से अलगाव: मानव स्मृति सीडी 4 + टी सेल एंटीबॉडी के संवर्धन कॉकटेल (PBMCs के एमएल प्रति 50 μL), मिश्रण जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
3. सेल संस्कृति शर्तों विनियामक टी कोशिकाओं को प्रेरित करने के लिए
- चरण 1 और 2, कोट ऊतक संस्कृति प्लेटों से पहले दिन से पहले गिराए विरोधी CD3 एंटीबॉडी के (1 / बाँझ पीबीएस में μg एमएल के एक एकाग्रता के लिए OKT3) क्लोन. 500 μL प्रति के लिए एक 6 थाली पीबीएस की 2 एमएल + प्रति विरोधी-CD3 जोड़ने के लिए, एक 12 अच्छी तरह से थाली 1 एमएल जोड़ने के लिए या एक 24 अच्छी तरह से थाली के लिए अच्छी तरह से जोड़ें. 4 में लेपित थाली डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें जब तक रखें.
- 2.06 मिमी के साथ RPMI - 1640 पूर्व पूरक मिमी Glutamax और मैं 25 के लिए 10% गर्मी - निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, में स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 / μg एमएल और 50 β-mercaptoethanol माइक्रोन को जोड़कर ध्रुवीकरण मध्यम तैयार बफर HEPES. अगला, 2 एनजी / एमएल TGF-β और 5 एनजी / एमएल आईएल -2 जोड़ें. यहाँ, एक ligands या मीडिया के लिए ब्याज की inhibitors का जोड़ सकते हैं. चरण 2 से 2 x 6 10 ध्रुवीकरण माध्यम की कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में कोशिकाओं Resuspend.
- पूर्व गर्म 37 पर प्लेटें डिग्री सेल्सियस और PBS महाप्राण (व्यंजन) बाहर विरोधी CD3 लेपित कुओं की कोशिकाओं को जोड़ने से पहले. एक अच्छी तरह से थाली 6, एक 12 अच्छी तरह से या एक 24 अच्छी तरह से थाली के लिए कक्षों की 1 एमएल थाली के लिए 2 एमएल कोशिकाओं के लिए 4 प्रतिशत की अच्छी तरह से सेल निलंबन एमएल जोड़ें. पीबीएस के साथ खाली कुओं के वाष्पीकरण कम भरेंमीडिया. 37 ° / सी 5% सीओ 2 में 3 दिनों के लिए सेते हैं.
- 3 दिन के बाद चढ़ाना पर, नीचे x 500 जी में थाली स्पिन 5 मिनट के लिए एक अपकेंद्रित्र में. प्लेट के नीचे पर टी कोशिकाओं को परेशान करने के बिना, मीडिया के आधे से हटाने और नए मीडिया के साथ बदलें. वैकल्पिक रूप से, अगर अच्छी तरह से कोशिकाओं (3 एक्स 10 6 / एमएल ऊपर एकाग्रता) के साथ भीड़ हो जाता है, की मात्रा अन्य विरोधी CD3 लेपित, थाली में समान रूप से विभाजित और ताजा मीडिया वापस मूल मात्रा को जोड़ने के. 37 ° / सी 5% सीओ 2 में दो से तीन दिनों के लिए सेते हैं.
4. टी कोशिकाओं के तीन जनसंख्या के प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS)
- बफर धोने FACS बाँझ पीबीएस 0.5% (w / v) गोजातीय सीरम albumin (BSA) और 2 मिमी EDTA जोड़कर तैयार करें. 4 में जगह बफर डिग्री सेल्सियस ठंडा हो.
- सेल संस्कृति से कोशिकाओं को अच्छी तरह से निकालें और पूरा सेल वसूली सुनिश्चित करने के लिए पीबीएस की 2 एमएल के साथ एक अच्छी तरह कुल्ला. 50 एमएल polypropylene ट्यूबों में सभी कक्षों प्लेस और 10 के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्रपहले 4 बजे डिग्री सेल्सियस
- Hemocytometer पर कक्षों की गणना करने के लिए सेल घनत्व निर्धारण.
- 3-5 जगह x 10 के चार अलग - अलग 5 एमएल मुआवजा नियंत्रण के लिए दौर नीचे polystyrene ट्यूबों में 5 ट्यूब प्रति कोशिकाओं. 50 एमएल polypropylene के ट्यूबों, कोई 35 से अधिक एक्स 10 ट्यूब प्रति 6 कोशिकाओं में शेष कोशिकाओं रखें.
- 4 डिग्री सेल्सियस और महाप्राण (व्यंजन) मीडिया पर 5 मिनट के लिए नीचे कोशिकाओं स्पिन. 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं के प्रति ठंडा धोने बफर 90 μL में है हल किया जा कोशिकाओं Resuspend. ठंड धोने बफर मुआवजा नियंत्रण ट्यूब के 100 μL में Resuspend.
- हल किया जा कोशिकाओं के लिए, विरोधी CD25 पीई 2 μL, विरोधी CD45RA पीई Cy5 में 3 μL और 1 1 प्रति विरोधी CD127-APC की μL x 10 6 कोशिकाओं गठबंधन. पीई Cy5 तीसरी ट्यूब and1 विरोधी CD127-APC के चौथे ट्यूब μL - पहली मुआवजा नियंत्रण ट्यूब, 2 विरोधी CD25 पीई के दूसरे ट्यूब μL, 3 विरोधी CD45RA की μL कोई प्रतिरक्षी जोड़ें. अंधेरे में 45 मिनट के लिए बर्फ पर सभी ट्यूबों सेते हैं.
- 1 एक्स 10 बफर धोने के एमएल प्रति 7 कोशिकाओं की एकाग्रता में बफर और resuspend कोशिकाओं महाप्राण (व्यंजन). एक 40 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी के माध्यम से फिल्टर से पहले DNase एमएल प्रति कोशिकाओं के द्वितीय 1.5 μL जोड़ें. ट्यूब प्रति अधिक नहीं की तुलना में 3.5 एमएल के साथ कई 5 एमएल दौर की नीचे polypropylene के ट्यूबों के लिए कोशिकाओं को ले जाएँ. बफर धोने के 300 μL में मुआवजा नियंत्रण कोशिकाओं Resuspend के.
- MoFlo प्रवाह cytometer पर मुआवजा निर्धारित करने के लिए पीई APC, और पीई Cy5 फिल्टर पार का पता लगाने के कम से कम करने के लिए. फाटक सेट (CD25 हाय CD127 -/LOW CD45RA कोशिकाओं) iTregs सॉर्ट 5 एमएल दौर नीचे polystyrene 1 एमएल नवजात बछड़ा सीरम युक्त ट्यूबों में टी कोशिकाओं, भोले (CD25 - CD45RA) और स्मृति (CD25 - - CD45RA).
5. दमन परख
- Suppr बनाओession 100 यू / पेनिसिलिन का एमएल, 100 / स्ट्रेप्टोमाइसिन की μg एमएल, 5 / एनजी एमएल आईएल-2 और 2 एनजी / एमएल TGF-बीटा करने के उद्देश्य से वी जोड़कर परख मीडिया
- परख के दिन, heterologous सीडी 4 + टी कोशिकाओं buffy कोट से शुद्ध रूप में चरण 1 और 2 में संकेत दिया. दमन परख के लिए लक्ष्य कोशिकाओं और नहीं होते हैं, CD25 + Treg कोशिकाओं के रूप में चित्रा 2, 0 दिन में देखा जा सकता है.
- CellTrace किट के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार लेबल के बजाय 2 μL कोशिकाओं के एमएल प्रति 5 मिमी शेयर के समाधान के केवल 1 μL का उपयोग करने के सिवाय, कोशिकाओं. प्रत्यक्ष प्रकाश से बाहर रखते हुए, CFSE की एक शीशी 18 DMSO के CellTrace किट द्वारा आपूर्ति की μL जोड़ने के लिए एक 5 मिमी स्टॉक समाधान करना. 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए लक्ष्य कोशिकाओं की अपेक्षित संख्या (1 एक्स 10 7 के एक अधिकतम करने के लिए) Resuspend prewarmed पीबीएस + 0.1% BSA (w / v) में. 5 कक्षों की एमएल प्रति मिमी CFSE के की μL जोड़ें 1 और 5 minut के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में अंडों पर बैठनातों. 10% FBS के साथ पूरा, बर्फ ठंड RPMI के 5 खंडों में जोड़ें धुंधला बुझाना और 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं. धोने को ठंडा पूरा RPMI और resuspend एक साथ दो बार अधिक कक्षों x 10 5 100 दमन परख मीडिया की μL प्रति कोशिकाओं.
- Treg दमन निरीक्षक मोती 2 10 x 7 मोती / एमएल के एक शेयर की एकाग्रता पर हैं. गोली मोतियों की एक संख्या Eppendorf ट्यूब में त्वरित centrifugation द्वारा प्रयोग के प्रति कोशिकाओं की कुल संख्या के बराबर है. मोती एक बार धो RPMI और फिर गोली के साथ. RPMI की आकांक्षा के बाद, resuspend मोती इतना है कि अच्छी तरह से प्रति मोतियों की उचित राशि दमन परख मीडिया की 8 μL में हैं.
- एक साथ 96 दौर नीचे ऊतक संस्कृति थाली करने के लिए एक वांछित लक्ष्य CFSE से सना हुआ (1 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल) कोशिकाओं, निरीक्षक मोती और ताजा दमन परख मीडिया में polarized और हल कोशिकाओं (1 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल) जोड़ने (CFSE दाग): 200 μL के अंतिम मात्रा में प्रेरक अनुपात (हल). सभी शर्तों tripli में स्थापित कर रहे हैंमोहनभोग.
- 92 μL प्रति शमन में अच्छी तरह से परख मध्यम में CFSE दाग कोशिकाओं की 100 μL, 8 निरीक्षक मोतियों की μL और 1 x 10 ताजा, अस्थिर कोशिकाओं के 5 जोड़कर दो नियंत्रण स्थितियों के पहले तैयार करें. ऊपर के रूप में एक ही सेलुलर घटकों के साथ, लेकिन निरीक्षक मोती Treg के बिना दूसरा नियंत्रण तैयार.
- 37 ° / सी 5% सीओ 2 में पांच दिनों के लिए कवर एल्यूमीनियम पन्नी और सेते हैं में थाली.
- अंधेरे में, और एक 5 एमएल दौर नीचे polystyrene ट्यूब में pipetting जगह से एक अच्छी तरह से कोशिकाओं को इकट्ठा. कोशिकाओं 500 XG में 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, महाप्राण (व्यंजन) मीडिया अपकेंद्रित्र, और 300 μL ठंड चरण 4 से बफर धोने FACS में resuspend है. पहले 3 एक्स 10 + 4 CFSE रहते लिम्फोसाइट सेल क्वेस्ट सॉफ्टवेयर के साथ एक हिस्टोग्राम में लक्ष्य कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व फाटक से घटनाओं का विश्लेषण करें.
6. प्रतिनिधि परिणाम
पांच दिन समय - cou पर प्रवाह cytometric pseudocolor के उदाहरण भूखंडों डॉटrse निगरानी iTreg भेदभाव FoxP3 साथ CD25 सह अभिव्यक्ति रिश्तेदार के आधार पर, CTLA-4 और CD45RA चित्रा 2 में देखा जा सकता है. चित्रा 3 में हिस्टोग्राम एक सफल दमन परख में जो हल iTregs (CD25 हाय CD45RA - CD127 -/LOW कोशिकाओं) से पता चलता है पांच दिन एक संस्कृति है कि विनियामक / शमन करने की क्षमता हासिल कर ली है से केवल सबसेट हैं चित्रा 4 Tregs की प्रेरण से पता चलता है. एक भोले टी सेल पूल (शीर्ष पैनल) और एक स्मृति टी सेल (तल पैनल) पांच दिन बाद में मानक iTreg मध्यम संस्कृति पूल, से. प्रारंभिक कोशिकाओं के CFSE धुंधला दिखाना है कि या तो (शीर्ष सही पैनल) भोले स्मृति या टी कोशिकाओं (नीचे सही पैनल) कोशिका विभाजन के कई दौर के बाद ही iTregs (सर्वोच्च कोशिकाओं FoxP3 व्यक्त) अलग.
चित्रा 1 प्रयोगात्मक प्रक्रिया के योजनाबद्ध. PBMCs गिरफ्तारीई टी कोशिकाओं मानव परिधीय रक्त के बाहर + CD25 सीडी 4 की चुंबकीय नकारात्मक चयन पहले ढाल centrifugation के माध्यम से अलग है. संस्कृति में पांच से छह दिनों के बाद, कोशिकाओं FACS से गुजरना और heterologous CFSE लेबल लक्ष्य कोशिकाओं के साथ सह incubated रहे शमन गतिविधि को मापने.
चित्रा 2 शुद्ध मानव प्राथमिक सीडी 4 + CD25 - टी कोशिकाओं मध्यम iTreg में संवर्धित कर रहे हैं. अलगाव (0 दिन) के बाद और 1 दिन, 3 और 5 सेल संस्कृति में कोशिकाओं का एक नि: शेष भाजक एकत्र रहा है CD45RA, FoxP3, CTLA 4 और CD25 मार्करों की प्रगति की निगरानी है. iTreg प्रोफ़ाइल CD45RA से मेल खाती है, FoxP3 हाय, CTLA-4 हाय और CD25 हाय खिड़की में ग्राफ में डाला.
चित्रा 3 सीडी 4 शुद्ध + CFSE ला.beled कोशिकाओं (एक 10 एक्स 5 / अच्छी तरह से) हल भोले स्मृति, या iTreg के की कोशिकाओं की उपस्थिति में दमन निरीक्षक मोती Treg साथ संवर्धित कर रहे हैं (3 10 एक्स 4 / अच्छी तरह से). पांच दिनों के बाद, कोशिकाओं और काटा दाग कोशिकाओं के CFSE प्रोफ़ाइल प्रवाह cytometry से विश्लेषण किया है. iTreg कोशिकाओं की मौजूदगी पूरी तरह से के प्रसार सीडी 4 + टी कोशिकाओं को समाप्त. नंबर CFSE लेबल कोशिकाओं कि विभाजन आया है के प्रतिशत का संकेत कर रहे हैं.
चित्रा 4 मानव प्राथमिक भोले शुद्ध (सीडी 4 + CD25 - + CD45RA) और स्मृति (सीडी 4 + CD25 - CD45RO +) टी कोशिकाओं CFSE और मध्यम iTreg में सुसंस्कृत के साथ दाग रहे हैं. पांच दिनों के बाद, कोशिकाओं phenotyped कर रहे हैं और कोशिका विभाजन की दर का अनुमान है. चित्रा 2 में संकेत दिया है, iTreg सबसेट दोनों सबसेट से भेदभाव से मेल खाती हैCD45RA - को CD25 हाय FoxP3 हाय और CTLA-4 हाय (दो बाद नहीं दिखाया है). तुलनात्मक CFSE धुंधला प्रोफाइल पांच दिन संस्कृति के दौरान सबसे proliferative कोशिकाओं के रूप में पहचान iTregs उच्चतम व्यक्त FoxP3 टी कोशिकाओं के रूप में (यहाँ).
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Discussion
जबकि Treg हस्तांतरण स्वरोगक्षमता भ्रष्टाचार अस्वीकृति और अन्य प्रतिरक्षा या सूजन की मध्यस्थता विकारों का मुकाबला करने, उनके कुशल पीढ़ी और स्थिर रखरखाव के लिए तरीकों में भारी चिकित्सकीय वादा धारण अभी तक विकसित नहीं किया गया है. केवल मानव टी कोशिकाओं परिसंचारी की 1-5% के रूप में में Tregs हैं, उनके नियंत्रित विस्तार और भेदभाव क्लिनिक में Tregs के कार्यान्वयन के प्रमुख निवारक के रूप में इस कमी पर काबू. दूसरी ओर, के रूप में हम TGN1412 13 परीक्षण से सीखा है, यह वैज्ञानिक और नैतिकता की दृष्टि से आवश्यक है गहराई से आणविक घटनाओं को समझने कि आर्केस्ट्रा मानव किसी भी चिकित्सकीय आहार को लागू करने से पहले टी सेल भाग्य का निर्णय है. भेदभाव को iTreg की इस विधि के साथ, भोले, स्मृति, effector टी कोशिकाओं और iTregs के परिणामस्वरूप आबादी जीन की अभिव्यक्ति या जो एक मानव परिधीय रक्त दाता से प्राप्त कोशिकाओं की आबादी के बीच कार्यात्मक तुलना की सुविधा. हमारे हाथ में, कोशिकाओं को हल किया गया हैकी तुलना में माइक्रोएरे और qRT - पीसीआर पश्चिमी blots में आनुवंशिक परिवर्तन, विश्लेषण को मापने के लिए कुंजी संकेत घटनाओं की जांच में, या पैच में कार्यात्मक आयन चैनल 14 के उपयोग को मापने के लिए clamping.
हमारी प्रणाली एक केंद्रीय ढांचे और readout के आसपास भेदभाव प्रक्रिया के महत्वपूर्ण पहलुओं में हेरफेर करने की क्षमता के अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है. इस प्रकार, एक पूर्व तरह PBMCs के इनपुट कोशिकाओं की आबादी को बदल सकते हैं या छोटे अणु inhibitors संस्कृति के माध्यम से और ligands के शामिल हैं. एक भी कोशिकाओं transfect करने के लिए को overexpress या नीचे दस्तक ब्याज की एक प्रोटीन या परिचय एक पत्रकार का निर्माण कर सकते हैं. एक अतिरिक्त लाभ के रूप में, हम संस्कृति की शर्तों को बदल के उत्पन्न iTregs का प्रतिशत को अधिकतम करने के लिए कर सकते हैं. कुल मिलाकर, इस मानव प्राथमिक टी सेल संस्कृति एक शारीरिक murine प्रणाली में बनाया की तुलना में अधिक से अधिक प्रासंगिकता के साथ एक बहुत मजबूत प्रयोगात्मक मंच रूपरेखा बनाती है. महत्वपूर्ण बात, यह भी एक प्रत्यक्ष चिकित्सात्मक मूल्य को बनाए रखने सकता है. दरअसल, राज्य मंत्री के रूप मेंटी वर्तमान Treg आधारित चिकित्सकीय दृष्टिकोण इन विट्रो या पूर्व vivo या कोशिकाओं के विकास के हेरफेर में शामिल हैं, हमारी प्रणाली सड़क पर देखभाल के मानक में सेल थेरेपी Treg के शामिल किए जाने की दिशा में एक महत्वपूर्ण नाली के रूप में देखा जा सकता है. इस प्रणाली पर भविष्य विस्तार दर्जी पॉलीक्लोनल वर्णित सक्रियण बजाय vivo सूजन प्रतिजनों में विशिष्ट के साथ मुठभेड़ पर सक्रिय हो Tregs.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 1114547 | Keep at room temperature |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19052 | |
| EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19157 | |
| EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19155 | |
| The Big Easy EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18001 | Silver |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| 15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR international | 89004-368 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes | BD Biosciences | 352059 | |
| 50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR international | 89004-364 | |
| Human anti-CD3 Antibody | Bio X Cell | BE0001-2 | Clone: OKT3 |
| 24 Well Cell Polystyrene Culture Plate | BD Biosciences | 353047 | |
| 96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer | GIBCO, by Life Technologies | 72400 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | eBioscience | 14-8348-62 | |
| Recombinant Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-63 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP Biomedicals | 810531 | |
| 0.5 M EDTA | Amresco | E177 | |
| Mouse Anti-Human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | Clone: 4E3 |
| Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 | eBioscience | 15-0458-42 | Clone: HI100 |
| Mouse Anti-Human CD127-APC | Miltenyi Biotec | 130-094-890 | Clone: MB15-18C9 |
| DNase II | MP Biomedicals | 190370 | |
| MoFlo Flow Cytometer | Beckman Coulter Inc. | ||
| FlowJo Software | Tree Star, Inc. | ||
| Cell Quest Pro Software | BD Biosciences | ||
| Newborn Calf Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16010 | |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| AIM-V | GIBCO, by Life Technologies | 0870112 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Treg Suppression Inspector Beads | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| 40 μM Nylon Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 |
References
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